Общие представления о путях сигнальной трансдукции

Для большинства регуляторных молекул между их связыванием с мембранным рецептором и окончательной реакцией клетки, т.е. изменением ее работы, вклиниваются сложные серии событий - определенные пути передачи сигнала, иначе называемые путями сигнальной трансдукции.

Регуляторные вещества принято подразделять на эндокринные, нейрокринные и паракринные. Эндокринные регуляторы (гормоны) выделяются эндокринными клетками в кровь и переносятся ею к клеткам-мишеням, которые могут находиться в любом месте организма. Нейрокринные регуляторы выделяются нейронами в непосредственной близости от клеток-мишеней. Паракринные вещества освобождаются несколько дальше от мишеней, но все же достаточно близко к ним, чтобы достичь рецепторов. Паракринные вещества секретируются одним типом клеток, а действуют на другой, однако в некоторых случаях регуляторы предназначены тем клеткам, которые их выделили, или соседним клеткам, относящимся к тому же типу. Это называется аутокринной регуляцией.

В ряде случаев последний этап сигнальной трансдукции состоит в фосфорилировании определенных эффекторных белков, что ведет к усилению или угнетению их активности, а это, в свою очередь, определяет необходимую организму клеточную реакцию. Фосфорилирование белков осуществляют протеинкиназы, а дефосфорилирование - протеинфосфатазы.

Изменения протеинкиназной активности происходят в результате связывания регуляторной молекулы (в общем случае называемой лигандом) с ее мембранным рецептором, что запускает каскады событий, некоторые из которых приведены на рисунке (рис. 2-1). Активность различных протеинкиназ регулируется рецептором не прямо, а через вторичные мессенджеры (вторичные посредники), в роли которых выступают, например, циклический АМФ (цAMФ), циклический ГМФ (цГMФ), Са 2+ , инозитол-1,4,5-три- фосфат (IP 3) и диацилглицерол (DAG). При этом связывание лиганда с мембранным рецептором изменяет внутриклеточный уровень вторичного мессенджера, что, в свою очередь, отражается на активности протеинкиназы. Многие регулятор-

ные молекулы влияют на клеточные процессы через пути сигнальной трансдукции с участием гетеротримерных ГТФ-связывающих белков (гетеротримерных G-белков) или мономерных ГТФ-связывающих белков (мономерных G-белков).

Когда молекулы лиганда связываются с мембранными рецепторами, взаимодействующими с гетеротримерными G-белками, происходит переход G-белка в активное состояние путем связывания с ГТФ. Активированный G-белок может затем взаимодействовать со многими эффекторными белками, прежде всего ферментами, такими, как аденилатциклаза, фосфодиэстераза, фосфолипазы С, А 2 и D. Это взаимодействие запускает цепи реакций (рис. 2-1), которые заканчиваются активацией различных протеинкиназ, таких, как протеинкиназа А (ПКА), протеинкиназа G (ПKG), протеинкиназа C (ПИС).

В общих чертах пути сигнальной трансдукции с участием G-белков - протеинкиназ включает следующие этапы.

1.Лиганд связывается с рецептором на мембране клетки.

2.Связанный с лигандом рецептор, взаимодействуя с G-белком, активирует его, и активированный G-белок связывает ГТФ.

3.Активированный G-белок взаимодействует с одним или несколькими следующими соединениями: аденилатциклазой, фосфодиэстеразой, фосфолипазами С, А 2 , D, активируея или ингибируя их.

4.Внутриклеточный уровень одного или нескольких вторичных мессенджеров, таких, как цАМФ, цГМФ, Са 2+ , IP 3 или DAG, возрастает или снижается.

5.Увеличение или уменьшение концентрации вторичного мессенджера влияет на активность одной или нескольких зависимых от него протеинкиназ, таких, как цАМФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа А), цГМФ-зависимая протеинкиназа (ПКG), кальмодулинзависимая протеинкиназа (КМПК), протеинкиназа С. Изменение концентрации вторичного мессенджера может активировать тот или иной ионный канал.

6.Уровень фосфорилирования фермента или ионного канала изменяется, что влияет на активность ионного канала, обуславливая конечный ответ клетки.

Рис. 2-1. Некоторые каскады событий, реализующиеся в клетке благодаря вторичным посредникам.

Обозначения: * - активированный фермент

Мембранные рецепторы, связанные с G-белками

Мембранные рецепторы, опосредующие агонист-зависимую активацию G-белков, составляют особое семейство белков, в котором 500 с лишним представителей. К нему относятся α- и β-адренергические, мускариновые ацетилхолиновые, серотониновые, аденозиновые, обонятельные рецепторы, родопсин, а также рецепторы большинства пептидных гормонов. Представители семейства рецепторов, связанных с G-белками, имеют семь трансмембранных α-спиралей (рис. 2-2 А), каждая из которых содержит 22-28 преимущественно гидрофобных аминокислотных остатков.

Для некоторых лигандов, например, ацетилхолина, адреналина, норадреналина и серотонина, известны разные подтипы связанных с G-белками рецепторов. Зачастую они различаются сродством к конкурентным агонистам и антагонистам.

Далее представлена (рис. 2-2 Б) молекулярная организация аденилатциклазы - фермента, продуцирующего цАМФ (первый открытый вторичный мессенджер). Регуляторный путь аденилатциклазы считается классическим путем сигнальной трансдукции, обусловленной G-белками.

Аденилатциклаза служит основой позитивного или негативного контроля путей сигнальной трансдукции через G-белки. При позитивном контроле связывание стимулирующего лиганда, например, адреналина, действующего через β-адренергические рецепторы, ведет к активации гетеротримерных G-белков с α-субъединицей типа as («s» означает стимуляцию). Активация Gs-типа G-белков посредством связанного с лигандом рецептора приводит к тому, что его as-субъединица связывает ГТФ, и затем диссоциирует от βγ-димера.

На рисунке 2-2 В показано, как фосфолипаза С расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат на инозитол-1,4,5-трифосфат и диацилглицерол. Оба вещества, инозитол-1,4,5-трифосфат и диацилглицерол, относятся к вторичным мессенджерам. IP3, связываясь со специфическими лигандзависимыми Са 2+ -каналами эндоплазматического ретикулума, высвобождает из него Са 2+ , т.е. повышает концентрацию Са 2+ в цитозоле. Диацилглицерол вместе с Са 2+ активирует другой важный класс протеинкиназ - протеинкиназу С.

Затем показана структура некоторых вторичных мессенджеров (рис. 2-2 Г-Е): цАМФ, ГМФ,

цГМФ.

Рис. 2-2. Примеры молекулярной организации некоторых структур, участвующих в путях сигнальной трансдукции.

А - рецептор мембраны клетки, связывающий на внешней поверхности лиганд, а внутри - гетеротримерный G-белок. Б - молекулярная организация аденилатциклазы. В - структура фосфатидилинози- тол-4,5-дифосфата и образованных под действием фосфолипазы С инозитол-1,4,5-трифосфата и диацилглицерола. Г - структура 3",5"-циклического АМФ (активатора протеинкиназы А). Д - структура ГМФ. Е - структура 3",5"-циклического ГМФ (активатора протеинкиназы G)

Гетеротримерные G-белки

Гетеротримерный G-белок состоит из трех субъединиц: α (40 000-45 000 Да), β (около 37 000 Да) и γ (8000-10 000 Да). Сейчас известно около 20 различных генов, кодирующих эти субъединицы, в том числе не менее четырех генов β-субъединиц и примерно семь генов γ-субъединиц млекопитающих. Функция и специфичность G-белка обычно, хотя и не всегда, определяются его α-субъединицей. У большинства G-бел- ков субъединицы β и γ плотно связаны между собой. Некоторые гетеротримерные G-белки и пути трансдукции, в которых они задействованы, перечислены в табл. 2-1.

Гетеротримерные G-белки служат посредниками между рецепторами плазматической мембраны для более 100 внеклеточных регуляторных веществ и внутриклеточными процессами, которые они контролируют. В общих чертах, связывание регуляторного вещества с его рецептором активирует G-белок, а тот либо активирует, либо ингибирует фермент и/или вызывает цепь событий, приводящих к активации определенных ионных каналов.

На рис. 2-3 представлен общий принцип работы гетеротримерных G-белков. В большинстве G-белков α-субъединица представляет собой «рабочий элемент» гетеротримерных G-белков. Активация большинства G-белков приводит к конформационному изменению этой субъединицы. Неактивные G-белки существуют главным образом в форме αβγ-гетеротримеров,

с ГДФ в позициях, связывающих нуклеотид. Взаимодействие гетеротримерных G-белков с присоединившим лиганд рецептором ведет к преобразованию α-субъединицы в активную форму с повышенным сродством к ГТФ и пониженной афинностью его к βγ-комплексу. В результате активированная α-субъединица освобождает ГДФ, присоединяет ГТФ, а затем диссоциирует от βγ-димера. У большинства G-белков диссоциированная α-субъединица затем взаимодействует с эффекторными белками в пути сигнальной трансдукции. Однако у некоторых G-белков освободившийся βγ-димер может быть ответственным за все или некоторые эффекты рецептор-лигандного комплекса.

Работа некоторых ионных каналов модулируется G-белками непосредственно, т.е. без участия вторичных мессенджеров. Например, связывание ацетилхолина с мускариновыми М 2 -рецепторами сердца и некоторых нейронов ведет к активации особого класса К + -каналов. В этом случае связывание ацетилхолина с мускариновым рецептором ведет к активации G-белка. Его активированная α-субъединица затем отделяется от βγ-димера, а βγ-димер напрямую взаимодействует с особым классом К + -каналов, приводя их в открытое состояние. Связывание ацетилхолина с мускариновыми рецепторами, повышающее К+-проводимость пейсмекерных клеток в синоатриальном узле сердца - один из главных механизмов, посредством которого парасимпатические нервы вызывают уменьшение частоты сердечных сокращений.

Рис. 2-3. Принцип работы гетеротримерных ГТФ-связывающих белков (гетеротримерных G-белков).

Таблица 2-1. Некоторые гетеротримерные ГТФ-связывающие белки млекопитающих, классифицированные на основе их α-субъединиц *

* В каждом классе α-субъединиц различают несколько изоформ. Идентифицировано более 20 α-субъединиц.

Мономерные G-белки

Клетки содержат еще одно семейство ГТФсвязывающих белков, которые называют мономерными ГТФ-связывающими белками. Они также известны как G-белки с низкой молекулярной массой или малые G-белки (молекулярная масса 20 000-35 000 Да). В таблице 2-2 перечислены основные подклассы мономерных ГТФсвязывающих белков и некоторые из их свойств. Ras-подобные и Rho-подобные мономерные ГТФ-связывающие белки участвуют в пути сигнальной трансдукции на этапе передачи сигнала от тирозинкиназы, рецептора фактора роста, на внутриклеточные эффекторы. Среди процессов, регулируемых путями сигнальной трансдукции, в которые вовлечены мономерные ГТФсвязывающие белки, можно назвать элонгацию полипептидной цепи в ходе белкового синтеза, пролиферацию и дифференцировку клеток, их злокачественное перерождение, контроль актинового цитоскелета, связь между цитоскелетом

и внеклеточным матриксом, транспорт везикул между различными органеллами и экзоцитозную секрецию.

Мономерные ГТФ-связывающие белки, как и их гетеротримерные аналоги, представляют собой молекулярные переключатели, существующие в двух формах - активированной «включенной» и инактивированной «выключенной» (рис. 2-4 Б). Однако активация и инактивация мономерных ГТФ-связывающих белков требует дополнительных регуляторных белков, которые, насколько известно, не требуются для работы гетеротримерных G-белков. Мономерные G-белки активируются гуанин-нуклеотид-освобождающими белками, а инактивируются ГТФаза-активирующими белками. Таким образом, активация и инактивация мономерных ГТФ-связывающих белков контролируется сигналами, которые изменяют активность гуанин-нуклеотид-освобождающих белков или ГТФаза-активирующих белков скорее, чем путем прямого воздействия на мономерные G-белки.

Рис. 2-4. Принцип работы мономерных ГТФ-связывающих белков (мономерных G-белков).

Таблица 2-2. Подсемейства мономерных ГТФ-связывающих белков и некоторые регулируемые ими внутриклеточные процессы

Механизм работы гетеротримерных G-белков

Неактивные G-белки существуют главным образом в форме αβγ-гетеротримеров, с ГДФ в их позициях, связывающих нуклеотид (рис. 2-5 А). Взаимодействие гетеротримерных G-белков с присоединившим лиганд рецептором ведет к преобразованию α-субъединицы в активную форму, которая имеет повышенное сродством к ГТФ и пониженную афинность его к βγ-комплексу (рис. 2-5 Б). В большинстве гетеротримерных G-белков именно α-субъединица представляет собой структуру, передающую информацию. Активация большинства G-белков приводит к конформационному изменению α-субъединицы.

В результате активированная α-субъединица освобождает ГДФ, присоединяет ГТФ (рис. 2-5 В), а затем диссоциирует от βγ-димера (рис. 2-5 Г). У большинства G-белков диссоциированная α-субъединица сразу взаимодействует с эффекторными белками (Е 1) в пути сигнальной трансдукции (рис. 2-5 Г). Однако у некоторых G-белков освободившийся βγ-димер может быть ответственным за все или за некоторые эффекты рецептор-лигандного комплекса. Затем βγ-димер взаимодействует с эффекторным белком Е 2 (рис. 2-5 Д). Далее показано, что члены RGS семьи G-белка стимулируют гидролиз ГТФ (рис. 2-5 Е). Это инактивирует α-субъединицу и объединяет все субъединицы в αβγ-гетеротример.

Рис. 2-5. Цикл работы гетеротримерного G-белка, запускающего дальнейшую цепь событий с помощью своей α -субъединицы.

Обозначения: R - рецептор, L - лиганд, Е - эффекторный белок

Пути сигнальной трансдукции через гетеротримерные G-белки

На рисунке 2-6 А показаны три лиганда, их рецепторы, связанные с разными G-белками, и их молекулярные мишени. Аденилатциклаза является основой для позитивного или негативного контроля путей сигнальной трансдукции, которые обусловлены G-белками. При позитивном контроле связывание стимулирующего лиганда, например норадреналина, действующего через β- адренергические рецепторы, ведет к активации гетеротримерных G-белков с α-субъединицей типа α S («s» означает стимуляцию). Поэтому такой G-белок называют G-белком G S -типа. Активация G s -типа G-белков посредством связанного с лигандом рецептора приводит к тому, что его α s - субъединица связывает ГТФ и затем диссоциирует от βγ-димера.

Другие регуляторные вещества, такие, как адреналин, действующий через α 2 -рецепторы, или аденозин, действующий через α 1 -рецепторы, или дофамин, действующий через D 2 -рецепторы, участвуют в негативном или ингибирующем контроле аденилатциклазы. Эти регуляторные вещества активируют G i -тип G-белков, которые имеют α-субъединицу типа α i («i» означает ингибирование). Связывание ингибирующего лиганда с его

рецептором активирует G i -тип G-белков и вызывает диссоциацию его α i -субъединицы от βγ-димера. Активированная α i -субъединица связывается с аденилатциклазой и подавляет ее активность. Кроме того, βγ-димеры могут связывать свободные α s -субъединицы. Этим путем связывание βγ-димеров со свободной α s -субъединицей дополнительно подавляет стимуляцию аденилатциклазы, блокируя действие стимулирующих лигандов.

Еще один класс внеклеточных агонистов (рис. 2-6 А) связывается с рецепторами, которые активируют посредством G-белка, называемого G q , β-изоформу фосфолипазы С. Она расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат (фосфолипид, в малых количествах присутствующий в плазматической мембране) на инозитол-1,4,5- трифосфат и диацилглицерол, которые относятся ко вторичным мессенджерам. IP 3 , связываясь со специфичными лигандзависимыми Са 2+ -каналами эндоплазматического ретикулума, высвобождает из него Са 2+ , т.е. повышает концентрацию Са 2+ в цитозоле. Са 2+ -каналы эндоплазматического ретикулума вовлечены в электромеханическое сопряжение в скелетной и сердечной мышце. Диацилглицерол вместе с Са 2+ активирует протеинкиназу С. К ее субстратам относятся, например, белки, участвующие в регуляции клеточного деления.

Рис. 2-6. Примеры путей сигнальной трансдукции через гетеротримерные G-белки.

А - в трех приведенных примерах связывание нейротрансмиттера с рецептором ведет к активации G-белка и последующему включению путей вторичных мессенджеров. G s , G q , и G i подразумевают три различных типа гетеротримерных G-белков. Б - регуляция клеточных белков фосфорилированием ведет к усилению или угнетению их активности, а это, в свою очередь, определяет необходимую организму клеточную реакцию. Фосфорилирование белков осуществляют протеинкиназы, а дефосфорилирование - протеинфосфатазы. Протеинкиназа переносит фосфатную группу (Pi) от АТФ на сериновые, треониновые или тирозиновые остатки белков. Это фосфорилирование обратимо меняет структуру и функции клеточных белков. Оба типа ферментов - киназы и фосфатазы - регулируются различными внутриклеточными вторичными мессенджерами

Пути активации внутриклеточных протеинкиназ

Взаимодействие гетеротримерных G-белков с присоединившим лиганд рецептором ведет к преобразованию α-субъединицы в активную форму, которая имеет повышенное сродство к ГТФ и пониженную афинность его к βγ-комплексу. Активация большинства G-белков приводит к конформационному изменению α-субъединицы, которая освобождает ГДФ, присоединяет ГТФ, а затем диссоциирует от βγ-димера. Далее диссоциированная α-субъединица взаимодействует с эффекторными белками в пути сигнальной трансдукции.

На рисунке 2-7 А продемонстрирована активация гетеротримерных G-белков G s -типа с α-субъединицей типа α s , которая происходит благодаря связыванию с лигандом рецептора и приводит к тому, что α s -субъединица G-белков G s -типа связывает ГТФ и затем диссоциирует от βγ-димера, а далее взаимодействует с аденилатциклазой. Это приводит к повышению уровня цАМФ и активации ПКА.

На рисунке 2-7 Б продемонстрирована активация гетеротримерных G-белков G t -типа с α-субъединицей типа α t , которая происходит благодаря связыванию с лигандом рецептора и приводит к тому, что α t -субъединица G-белков G t -типа активируется и затем диссоциирует от βγ-димера, а далее взаимодействует с фосфодиэстеразой. Это приводит к повышению уровня цГМФ и активации ПKG.

Рецептор катехоламинов α 1 взаимодействует с G αq -субъединицей, активирующей фосфолипазу С. На рисунке 2-7 В продемонстрирована активация гетеротримерных G-белков G αq -типа с α-субъединицей типа α q , которая происходит благодаря связыванию лиганда с рецептором и приводит к тому, что α q -субъединица G-белков G αq -типа активируется и затем диссоциирует от βγ-димера, а далее взаимодействует с фосфолипазой С. Она расщепляет фосфатидилинози- тол-4,5-дифосфат на IP 3 и DAG. Это приводит к повышению уровня IP 3 и DAG. IP 3 , связываясь со специфичными лигандзависимыми Са 2+ - каналами эндоплазматического ретикулума,

высвобождает из него Са 2+ . DAG вызывает активацию протеинкиназы С. В нестимулированной клетке значительное количество этого фермента находится в цитозоле в неактивной форме. Са 2+ заставляет протеинкиназу С связываться с внутренней поверхностью плазматической мембраны. Здесь фермент может активироваться диацилглицеролом, который образуется при гидролизе фосфатидилинозитол-4,5-дифосфата. Мембранный фосфатидилсерин также может быть активатором протеинкиназы С, если фермент находится в мембране.

Описано около 10 изоформ протеинкиназы С. Хотя некоторые из них присутствуют во многих клетках млекопитающих, однако подтипы γ и ε обнаружены, главным образом, в клетках центральной нервной системы. Подтипы протеинкиназы С различаются не только распределением по организму, но, по-видимому, и механизмами регуляции своей активности. Некоторые из них в нестимулированных клетках связаны с плазматической мембраной, т.е. не требуют для активации увеличения концентрации Са 2+ . Некоторые изоформы протеинкиназы С активируются арахидоновой кислотой или другими ненасыщенными жирными кислотами.

Первоначальная кратковременная активация протеинкиназы С происходит под действием диацилглицерола, который освобождается, когда фосфолипаза С β активируется, а также под влиянием Са 2+ , освобожденного из внутриклеточных хранилищ с помощью IP 3 . Долго длящаяся активация протеинкиназы С запускается рецептор-зависимыми фосфолипазами А 2 и D. Они действуют первично на фосфатидилхолин - основной мембранный фосфолипид. Фосфолипаза А 2 отделяет от него жирную кислоту во втором положении (обычно ненасыщенную) и лизофосфатидилхолин. Оба эти продукта активируют определенные изоформы протеинкиназы С. Рецептор-зависимая фосфолипаза D расщепляет фосфатидилхолин таким образом, что образуется фосфатидная кислота и холин. Фосфатидная кислота далее расщепляется до диацилглицерола, участвующего в долговременной стимуляции протеинкиназы С.

Рис. 2-7. Основные принципы активации протеинкиназы А, протеинкиназы G и протеинкиназы С.

Обозначения: R - рецептор, L - лиганд

цAMФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа А) и связанные с ней сигнальные пути

В отсутствии цАМФ, цАМФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа А) состоят из четырех субъединиц: двух регуляторных и двух каталитических. У большинства типов клеток каталитическая субъединица одна и та же, а регуляторные субъединицы высокоспецифичны. Присутствие регуляторных субъединиц почти полностью подавляет ферментативную активность комплекса. Таким образом, активация ферментативной активности цАМФ-зависимой протеинкиназы должна вовлекать отделение регуляторных субъединиц от комплекса.

Активация происходит в присутствии микромолярных концентраций цАМФ. Каждая регуляторная субъединица связывает две его молекулы. Связывание цАМФ индуцирует конформационные изменения в регуляторных субъединицах и снижает аффинность их взаимодействия с каталитическими субъединицами. В результате этого регуляторные субъединицы отделяются от каталитических, и каталитические субъединицы становятся активированными. Активная каталитическая субъединица фосфорилирует белкимишени по определенным сериновым и треониновым остаткам.

Сравнение аминокислотных последовательностей цАМФ-зависимой и других классов протеинкиназ показывает, что, несмотря на сильные различия в их регуляторных свойствах, все эти ферменты высокогомологичны по первичной структуре срединной части. Эта часть содержит АТФ-связывающий домен и активный центр фермента, обеспечивающий перенос фосфата с АТФ на белок-акцептор. Участки киназ за пределами этой каталитической срединной части белка участвуют в регуляции киназной активности.

Определена также кристаллическая структура каталитической субъединицы цАМФ-зависимой протеинкиназы. Каталитическая средняя часть молекулы, имеющаяся у всех известных протеинкиназ, состоит из двух долей. Меньшая из них содержит необычный АТФ-связывающий участок, а большая доля содержит участок связывания пептида. Многие протеинкиназы содержат также регуляторный участок, известный как псевдосубстратный домен. По аминокислотной последовательности он напоминает фосфорилируемые участки субстратных белков. Псевдосубстратный домен, связываясь с активным центром протеинкиназы, ингибирует фосфорилирование истинных субстратов протеинкиназы. Активация киназы может включать фосфорилирование или нековалентную аллостерическую модификацию протеинкиназы для устранения ингибирующего действия псевдосубстратного домена.

Рис. 2-8. цAMФ-зависимая протеинкиназа А и мишени.

Когда адреналин связывается с соответствующим рецептором, активация α s -субъединицы стимулирует аденилатциклазу с увеличением уровня цАМФ. цАМФ активирует протеинкиназу А, которая путем фосфорилирования дает три основных эффекта. (1) Протеинкиназа А активирует киназу фосфорилазы гликогена, которая фосфорилирует и активирует фосфорилазу гликогена. (2) Протеинкиназа А инактивирует гликогенсинтазу и таким образом уменьшает образование гликогена. (3) Протеинкиназа А активирует ингибитор фосфопротеин-фосфатазы-1 и тем самым ингибирует фосфатазу. Эффект в целом заключается в координации изменений уровня глюкозы.

Обозначения: УДФ-глюкоза - уридиндифосфатглюкоза

Гормональная регуляция активности аденилатциклазы

На рисунке 2-9 А представлен принципиальный механизм индуцированной гормонами стимуляции и ингибирования аденилатциклазы. Взаимодействие лиганда с рецептором, связанным с α-субъединицей типа α s (стимулирующая), вызывает активацию аденилатциклазы, тогда как взаимодействие лиганда с рецептором), связанным с α-субъединицей типа α i (ингибирующая), вызывает ингибирование фермента. G βγ -субъединица и в стимулирующих, и в ингибирующих G-белках идентична. G α -субъединицы и рецепторы различны. Лиганд-стимулирован-ное образование активных G α ГТФ комплексов происходит с помощью одинаковых механизмов в обоих G αs ,- и G αi -протеинах. Однако G αs ГТФ и G αi ГТФ по-разному взаимодействуют с аденилатциклазой. Одна (G αs ГТФ) стимулирует, а другая G αi ГТФ) ингибирует ее каталитическую активность.

На рисунке 2-9 Б представлен механизм индуцированной определенными гормонами активации и ингибирования аденилатциклазы. β 1 -, β 2 - и D 1 -рецепторы взаимодействуют с субъединицами, которые активируют аденилатциклазу и повышают уровень цАМФ. α 2 -и D 2 -рецепторы взаимодействуют с G αi субъединицами, которые ингибируют аденилатциклазу. (Что касается α 1 -рецептора, то он взаимодействует с G -субъединицей, которая активирует фосфолипазу С.) Рассмотрим один из примеров, представленных на рисунке. Адреналин связывается с β 1 -рецептором, что приводит к активации G αs -белка, который стимулирует аденилатциклазу. Это приводит к увеличению внутриклеточного уровня цАМФ, и, таким образом, усиливает активность ПКА. С другой стороны, норадреналин связывается с α 2 -рецептором, что приводит к активации G αi -белка, который ингибирует аденилатциклазу и тем самым снижает внутриклеточный уровень цАМФ, уменьшая активность ПКА.

Рис. 2-9. Индуцированная лигандами (гормонами) активация и ингибирование аденилатциклазы.

А - принципиальный механизм. Б - механизм применительно к конкретным гормонам

Протеинкиназа С и связанные с ней сигнальные пути

Рецептор α 1 взаимодействует с G αq -субъединицей G-белка, которая активирует фосфолипазу С. Фосфолипаза С расщепляет фосфатидилинози- тол-4,5-дифосфат на IP 3 и DAG. IP 3 , связываясь со специфичными лиганд-зависимыми Са 2+ -каналами эндоплазматического ретикулума, высвобождает из него Са 2+ , т.е. повышает концентрацию Са 2+ в цитозоле. DAG вызывает активацию протеинкиназы С. В нестимулированной клетке этот фермент находится в цитозоле в неактивной

форме. Если цитозольный уровень Са 2+ повышается, происходит взаимодействие Са 2+ с протеинкиназой С, что приводит к связыванию протеинкиназы С с внутренней поверхностью клеточной мембраны. В таком положении фермент активируется диацилглицеролом, образующимся при гидролизе фосфатидилинозитол-4,5-дифосфа- та. Мембранный фосфатидилсерин также может быть активатором протеинкиназы С, если фермент находится в мембране.

В таблице 2-3 приведены изоформы протеинкиназы С млекопитающих и свойства этих изоформ.

Таблица 2-3. Свойства изоформ протеинкиназы С млекопитающих

ДАГ - диацилглицерол; ФС - фосфатидилсерин; ФФА - цис-ненасыщенные жирные кислоты; ЛФХ - лизофосфатидилхолин.

Рис. 2-10. Сигнальные пути диацилглицерол / инозитол-1,4,5-трифосфат

Фосфолипазы и связанные с ними сигнальные пути на примере арахидоновой кислоты

Некоторые агонисты посредством G-белков активируют фосфолипазу А 2 , которая действует на мембранные фосфолипиды. Продукты их реакций могут активировать протеинкиназу С. В частности, фосфолипаза A 2 отделяет от фосфолипидов находящуюся во втором положении жирную кислоту. Вследствие того, что некоторые фосфолипиды содержат в этом положении арахидоновую кислоту, вызванное фосфолипазой A 2 , расщепление этих фосфолипидов освобождает значительное ее количество.

Вышеописанный сигнальный путь арахидоновой кислоты, связанный с фосфолипазой А 2 , называют прямым. Непрямой путь активации арахидоновой кислоты связан с фосфолипазой С β .

Арахидоновая кислота сама по себе является эффекторной молекулой, а кроме того, служит предшественником для внутриклеточного синтеза простагландинов, простациклинов, тромбоксанов и лейкотриенов - важных классов регуляторных молекул. Арахидоновая кислота также образуется из продуктов расщепления диацил-глицеролов.

Простагландины, простациклины и тромбоксаны синтезируются из арахидоновой кислоты циклооксигеназно-зависимым путем, а лейкотриены - липоксигеназно-зависимым путем. Один из противовоспалительных эффектов глюкокортикоидов заключается как раз в ингибировании фосфолипазы A 2 , которая освобождает арахидоновую кислоту из фосфолипидов. Ацетилсалициловая кислота (аспирин  ) и другие нестероидные противовоспалительные средства ингибируют окисление арахидоновой кислоты циклооксигеназой.

Рис. 2-11. Сигнальные пути арахидоновой кислоты.

Обозначения: ПГ - простагландин, ЛГ - лейкотриен, ГПЭТЕ - гидропероксиэйкозатетраеноат, ГЭТЕ - гидроксиэйкозатетраеноат, ЭПР - эндоплазматический ретикулум

Кальмодулин: строение и функции

Множество жизненно важных клеточных процессов, включая освобождение нейротрансмиттеров, секрецию гормонов и мышечное сокращение, регулируется цитозольным уровнем Са 2+ . Один из путей влияния этого иона на клеточные процессы заключается в его связывании с кальмодулином.

Кальмодулин - белок с молекулярным весом 16 700 (рис. 2-12 А). Он присутствует во всех клетках, иногда составляя до 1% их общего белкового содержимого. Кальмодулин связывает четыре иона кальция (рис. 2-12 Б и В), после чего этот комплекс регулирует активность различных внутриклеточных белков, многие из которых не относятся к протеинкиназам.

Комплекс Са 2+ c кальмодулином активирует также кальмодулин-зависимые протеинкиназы. Специфический кальмодулин-зависимые протеинкиназы фосфорилируют специфические эффекторные белки, например, регуляторные легкие цепи миозина, фосфорилазу и фактор элонгации II. Мультифункциональные кальмодулин-зависимые протеинкиназы фосфорилируют многочисленные белки ядра, цитоскелета или мембранные белки. Некоторые кальмодулинзависимые протеинкиназы, такие, как киназа

легкой миозиновой цепи и киназа фосфорилазы, действуют только на один клеточный субстрат, тогда как другие полифункциональны и фосфорилируют более чем один субстратный белок.

Кальмодулин-зависимая протеинкиназа II относится к мажорным белкам нервной системы. В некоторых областях головного мозга на нее приходится до 2% общего белка. Эта киназа участвует в механизме, при котором увеличение концентрации Са 2+ в нервном окончании вызывает освобождение нейротрансмиттера по типу экзоцитоза. Ее главным субстратом служит белок под названием синапсин I, присутствующий в нервных окончаниях и связывающийся с наружной поверхностью синаптических везикул. Когда синапсин I связан с везикулами, он предотвращает экзоцитоз. Фосфорилирование синапсина I вызывает его отделение от везикул, позволяя им выбросить нейротрансмиттер в синаптическую щель путем экзоцитоза.

Киназа легких цепей миозина играет важную роль в регуляции сокращения гладких мышц. Повышение цитозольной концентрации Са 2+ в клетках гладких мышц активирует киназу легких цепей миозина. Фосфорилирование регуляторных легких цепей миозина приводит к длительному сокращению гладкомышечных клеток.

Рис. 2-12. Кальмодулин.

А - кальмодулин без кальция. Б - связывание кальция с кальмодулином и пептидной мишенью. В - схема связывания.

Обозначения: EF - Са 2+ -связывающие домены кальмодулина

Рецепторы с собственной ферметативной активностью (каталитические рецепторы)

Гормоны и факторы роста связываются с протеинами поверхности клетки, которые имеют ферментативную активность на цитоплазматической стороне мембраны. На рисунке 2-13 представлены пять классов каталитических рецепторов.

Один из характерных экземпляров трансмембранных рецепторов с гуанилатциклазной активностью, рецептор предсердного натрий-уретического пептида (ANP). Мембранный рецептор, с которым связывается ANP, не зависит от рассмотренных систем сигнальной трансдукции. Выше было описано действие внеклеточных агонистов, которые, связываясь с мембранными рецепторами, либо активируют аденилатциклазу через G s -белки, либо угнетают ее через G i . Мембранные рецепторы для ANP интересны тем, что сами рецепторы обладают гуанилатциклазной активностью, стимулирующейся связыванием ANP с рецептором.

ANP-рецепторы имеют внеклеточный ANP-свя- зывающий домен, единственную трансмембранную спираль и внутриклеточный гуанилатциклазный домен. Связывание ANP с рецептором повышает внутриклеточный уровень цГМФ, что стимулирует цГМФ-зависимую протеинкиназу. В противоположность цАМФ-зависимой протеинкиназе, имеющей регуляторную и каталитическую субъединицы, регуляторные и каталитические домены цГМФ-зависимой протеинкиназы находятся на одной полипептидной цепи. цГМФзависимая киназа затем фосфорилирует внутриклеточные белки, что приводит к различным клеточным ответам.

Рецепторы с серин-треонин-киназной активностью фосфорилируют белки только по остаткам серина и/или треонина.

Еще одно семейство мембранных рецепторов, не сопряженных с G-белками, состоит из белков с собственнойтирозин-протеинкиназнойактивностью. Рецепторами с собственной тирозин-протеинкиназной активностью служат белки с гликозилированным внеклеточным доменом, единственным

трансмембранным участком и внутриклеточным доменом с тирозин-протеинкиназной активностью. Связывание с ними агониста, например фактора роста нервов (NGF), стимулирует тирозин-протеинкиназную активность, что фосфорилирует специфичные белки-эффекторы по определенным тирозиновым остаткам. Большинство рецепторов для факторов роста димеризуются, когда с ними связывается NGF. Именно димеризация рецептора ведет к появлению у него тирозинпротеинкиназной активности. Активированные рецепторы часто фосфорилируют сами себя, что называется аутофосфорилированием.

К надсемейству пептидных рецепторов относят рецепторы инсулина. Это также тирозин-протеинкиназы. В подклассе рецепторов, относящихся к семейству инсулиновых рецепторов, нелигандный рецептор существует как дисульфид-связанный димер. Взаимодействие с инсулином приводит к конформационным изменениям обоих мономеров, что повышает связывание инсулина, активирует рецепторную тирозинкиназу и ведет к увеличению аутофосфорилирования рецептора.

Связывание гормона или фактора роста с его рецептором запускает разнообразные клеточные ответы, включая поступление в цитоплазму Са 2+ , увеличение Na + /H + обмена, стимуляцию захвата аминокислот и сахара, стимуляцию фосфолипазы С β и гидролиз фосфатидилинозитолдифосфата.

Рецепторы гормона роста, пролактина и эритропоэтина, также как рецепторы интерферона и многих цитокинов, непосредственно не служат протеинкиназами. Однако после активации эти рецепторы образуют сигнальные комплексы с внутриклеточными тирозин-протеинкиназами, которые и запускают их внутриклеточные эффекты. Именно потому они не являются истинными рецепторами с собственной тирозин-протеинкиназной активностью, а просто связываются с ними.

На основе структуры можно полагать, что трансмембранные тирозин-протеинфосфатазы также представляют собой рецепторы, а их с тирозин-протеинфосфатазная активность модулируется внеклеточными лигандами.

Рис. 2-13. Каталитические рецепторы.

А - рецептор гуанилциклазы, Б - рецептор с серин-треонин киназной активностью, В - рецептор с собственной тирозин-протеинкиназной активностью, Г - рецепторы, ассоциированные с тирозин-протеинкиназной активностью

Рецептор-связанные тирозинпротеинкиназы на примере рецепторов интерферона

Рецепторы интерферона непосредственно не являются протеинкиназами. После активации эти рецепторы образуют сигнальные комплексы с внутриклеточными тирозин-протеинкиназами, которые и запускают их внутриклеточные эффекты. То есть они не являются истинными рецепторами с собственной тирозин-протеинкиназной активностью, а просто связываются с ними таке рецепторы называются рецептор-связанными (рецептор-зависимыми) тирозин-протеинкиназами.

Механизмы, благодаря которому эти рецепторы оказывают действие, запускаются, когда гормон связывается с рецептором, что вызывает его димеризацию. Рецепторный димер связывает одну или несколько членов Janus -семейства тирозин-протеинкиназ (JAK). JAK затем перекрестно

фосфорилируют друг друга, а также рецептор. Члены семейства преобразователей сигнала и активаторов транскрипции (STAT) связывают фосфорилированные домены на комплексе рецептора и JAK. STAT-белки фосфорилируются JAK-киназами и затем отсоединяются от сигнального комплекса. В конечном итоге фосфорилированные STAT-белки образуют димеры, которые двигаются к ядру, чтобы активировать транскрипцию определенных генов.

Специфичность рецептора для каждого гормона отчасти зависит от специфики членов семейства JAK или STAT, объединяющихся для образования сигнального комплекса. В некоторых случаях сигнальный комплекс также активирует MAP-(митоген-активирующий протеин)-киназный каскад с помощью адапторных белков, используемых рецепторными тирозинкиназами. Некоторые из ответов рецепторных тирозинкиназных лигандов также вовлекают JAK и STAT пути.

Рис. 2-14. Пример каталитических рецепторов, ассоциированных с тирозин-протеинкиназной активностью. Рецептор, активируемый α -интерфероном (А) и γ -интерфероном (Б)

Ras-подобные мономерные G-белки и опосредованные ими пути трансдукции

Лиганд, например фактор роста, связывается с рецептором, обладающим собственной тирозинпротеинкиназной активностью, что приводит к увеличению транскрипции в 10-ступенчатом процессе. Ras-подобные мономерные ГТФ-связывающие белки участвуют в пути сигнальной трансдукции на этапе передачи сигнала от рецепторов с собственной тирозин-протеинкиназной активностью (например, рецепторов фактора роста) на внутриклеточные эффекторы. Активация и инактивация мономерных ГТФ-связывающих белков требуют дополнительных регуляторных белков. Мономерные G-белки активируются гуанин-нуклеотид-освобождающими белками (GNRP), а инактивируются ГТФаза-активирующими белками (GAP).

Мономерные ГТФ-связывающие белки семейства Ras служат посредниками связывания митогенных лигандов и их тирозин-протеинкиназных рецепторов, что запускает внутриклеточные процессы, ведущие к пролиферации клеток. Когда Ras-белки неактивны, клетки не реагируют на факторы роста, действующие через тирозинкиназные рецепторы.

Aктивация Ras запускает путь сигнальной трансдукции, приводящий в конечном итоге к транскрипции определенных генов, способствующих клеточному росту. Каскад MAP-киназы (МАРК) вовлекается в ответы при активации Ras. Протеинкиназа С также активирует каскад MAP- киназы. Таким образом, каскад MAP-киназы оказывается важной точкой конвергенции для разнообразных эффектов, вызывающих клеточную пролиферацию. Более того, здесь наблюдается перекрест между протеинкиназой С и тирозинкиназами. Например γ-изоформа фосфолипазы С активируется путем связывания с активированным Ras-белком. Эта активация передается на протеинкиназу С в процессе стимуляции фосфолипидного гидролиза.

На рисунке 2-15 представлен механизм, включающий 10 ступеней.

1. Связывание лиганда приводит к димеризации рецептора.

2.Активированнаятирозин-протеинкиназа (RTK) фосфорилирует себя.

3.GRB 2 (growth factor receptor-bound protein-2), SH 2 -содержащий протеин, узнает фосфотирозиновые остатки на активированном рецепторе.

4.Связывание GRB 2 включает SOS (son of sevenless) обменный протеин гуаниннуклеотида.

5.SOS активирует Ras, формируя на Ras ГТФ вместо ГДФ.

6.Активный комплекс Ras-ГТФ активирует другие протеины физическим включением их в плазматическую мембрану. Активный комплекс Ras-ГТФ взаимодействует с N-терминальной частью серин-треонин киназы Raf-1 (известной как митоген-активирующий протеин, MAP) первой в серии последовательности активированных протеинкиназ, которые передают активационный сигнал в ядро клетки.

7.Raf-1 фосфорилирует и активирует протеинкиназу, названную MEK, которая известна как киназа МАP-киназы (МАРКК). MEK - это мультифункциональная протеинкиназа, фосфорилирующая субстраты остатков тирозина и серина / треонина.

8.MEK фосфорилирует МАP-киназу (МАРК), которая также вызывается внеклеточным сигналом - регуляторной киназой (ERK 1 , ERK 2). Активация МАРК требует двойного фосфорилирования на соседних остатках серина и тирозина.

9.МАРК служит важнейшей эффекторной молекулой в Ras-зависимой сигнальной трансдукции, поскольку она фосфорилирует много клеточных протеинов после митогенной стимуляции.

10.Активированная МАРК переносится в ядро, где она фосфорилирует фактор транскрипции. В целом, активированный Ras активирует МАР

путем связывания с ней. Результатом этого каскада являются фосфорилирование и активация МАР-киназы, которая, в свою очередь, фосфорилирует факторы транскрипции, белковые субстраты и другие протеинкиназы, важные для деления и других ответов клеток. Активация Ras зависит от адаптерных белков, связывающихся с фосфотирозиновыми доменами на активированных факторами роста рецепторах. Эти адаптерные белки присоединяются и активируют GNRF (гуанин-нуклеотидобменный протеин), который активирует Ras.

Рис. 2-15. Регуляция транскрипции Ras-подобными мономерными G-белками, запускаемая с рецептора с собственной тирозин-протеинкиназной активностью

Регуляция транскрипции белком, взаимодействующим с цАМФзависимым элементом ДНК (CREB)

CREB -широко распространенный транскрипционный фактор - в норме связан с участком ДНК, названным CRE (сАМР response element). В отсутствии стимуляции CREB дефосфорилирован и не влияет на транскрипцию. Многочисленные пути сигнальной трансдукции посредством активации киназ (таких, как ПКА, Са 2+ /кальмо- дулин-киназа IV, МАР-киназа) приводят к фосфорилированию CREB. Фосфорилированный CREB связывается CBP (CREB-binding protein - CREB-связывающим протеином), который имеет домен, стимулирующий транскрипцию. Параллельно фосфорилирование активирует РР1

(фосфопротеинфосфатазу 1), которая дефосфорилирует CREB, что приводит к остановке транскрипции.

Показано, что активация CREB-опосредованно- го механизма важна для реализации таких высших когнитивных функций, как обучение и память.

На рисунке 2-15 показано также строение цАМФзависимой ПКА, которая в отсутствии цАМФ состоит из четырех субъединиц: двух регуляторных и двух каталитических. Присутствие регуляторных субъединиц подавляет ферментативную активность комплекса. Связывание цАМФ индуцирует конформационные изменения в регуляторных субъединицах, в результате чего регуляторные субъединицы отделяются от каталитических. Каталитические ПКА попадают в ядро клетки и запускают изложенный выше процесс.

Рис. 2-16. Регуляция генной транскрипции с помощью CREB (сАМР response element binding protein) через увеличение уровня циклического аденозинмонофосфата

Краткое описание:

Учебный материал по биохимии и молекулярной биологии: Строение и функции биологических мембран.

МОДУЛЬ 4: СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН

_Темы _

4.1. Общая характеристика мембран. Строение и состав мембран

4.2. Транспорт веществ через мембраны

4.3. Трансмембранная передача сигналов _

Цели изучения Уметь:

1. Интерпретировать роль мембран в регуляции метаболизма, транспорте веществ в клетку и удалении метаболитов.

2. Объяснять молекулярные механизмы действия гормонов и других сигнальных молекул на органы-мишени.

Знать:

1. Строение биологических мембран и их роль в обмене веществ и энергии.

2. Основные способы переноса веществ через мембраны.

3. Главные компоненты и этапы трансмембранной передачи сигналов гормонов, медиаторов, цитокинов, эйкозаноидов.

ТЕМА 4.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕМБРАН.

СТРОЕНИЕ И СОСТАВ МЕМБРАН

Все клетки и внутриклеточные органеллы окружены мембранами, которые играют важную роль в их структурной организации и функционировании. Основные принципы построения всех мембран одинаковы. Однако плазматическая мембрана, а также мембраны эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, митохондрий и ядра имеют существенные структурные особенности, они уникальны по своему составу и по характеру выполняемых функций.

Мембраны:

Отделяют клетки от окружающей среды и делят ее на компартменты (отсеки);

Регулируют транспорт веществ в клетки и органеллы и в обратном направлении;

Обеспечивают специфику межклеточных контактов;

Воспринимают сигналы из внешней среды.

Согласованное функционирование мембранных систем, включающих рецепторы, ферменты, транспортные системы, помогает поддерживать гомеостаз клетки и быстро реагировать на изменения состояния внешней среды путем регуляции метаболизма внутри клеток.

Биологические мембраны построены из липидов и белков, связанных друг с другом с помощью нековалентных взаимодействий. Основу мембраны составляет двойной липидный слой, в состав которого включены белковые молекулы (рис. 4.1). Липидный бислой образован двумя рядами амфифильных молекул, гидрофобные «хвосты» которых спрятаны внутрь, а гидрофильные группы - полярные «головки» обращены наружу и контактируют с водной средой.

1. Липиды мембран. В состав липидов мембран входят как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты. Ненасыщенные жирные кислоты встречаются в два раза чаще чем насыщенные, что определяет текучесть мембран и конформационную лабильность мембранных белков.

В мембранах присутствуют липиды трех главных типов - фосфолипиды, гликолипиды и холестерол (рис. 4.2 - 4.4). Чаще всего встречаются глицерофосфолипиды - производные фосфатидной кислоты.

Рис. 4.1. Поперечный разрез плазматической мембраны

Рис. 4.2. Глицерофосфолипиды.

Фосфатидная кислота - это диацилглицеролфосфат. R 1 , R 2 - радикалы жирных кислот (гидрофобные «хвосты»). Со вторым углеродным атомом глицерола связан остаток полиненасыщенной жирной кислоты. Полярной «головкой» является остаток фосфорной кислоты и присоединенная к нему гидрофильная группа серина, холина, этаноламина или инозитола

Существуют также липиды - производные аминоспирта сфингозина.

Аминоспирт сфингозин при ацилировании, т.е. присоединении жирной кислоты к NH 2 -группе, превращается в церамид. Церамиды различаются по остатку жирной кислоты. С ОН-группой церамида могут быть связаны разные полярные группы. В зависимости от строения полярной «головки» эти производные разделены на две группы - фосфолипиды и гликолипиды. Строение полярной группы сфингофосфолипидов (сфингомиелинов) сходно с глицерофосфолипидами. Много сфингомиелинов содержится в составе миелиновых оболочек нервных волокон. Гликолипиды представляют собой углеводные производные церамида. В зависимости от строения углеводной составляющей различают цереброзиды и ганглиозиды.

Холестерол содержится в мембранах всех животных клеток, он придает мембранам жесткость и снижает их жидкостность (текучесть). Молекула холестерола располагается в гидрофобной зоне мембраны параллельно гидрофобным «хвостам» молекул фосфо- и гликолипидов. Гидроксильная группа холестерола, как и гидрофильные «головки» фосфо- и гликолипидов,

Рис. 4.3. Производные аминоспирта сфингозина.

Церамид - ацилированный сфингозин (R 1 - радикал жирной кислоты). К фосфолипидам относятся сфингомиелины, у которых полярная группа состоит из остатка фосфорной кислоты и холина, этаноламина или серина. Гидрофильной группой (полярной «головкой») гликолипидов является углеводный остаток. Цереброзиды содержат моноили олигосахаридный остаток линейного строения. В состав ганглиозидов входит разветвленный олигосахарид, одним из мономерных звеньев которого является НАНК - N-ацетилнейраминовая кислота

обращена к водной фазе. Молярное соотношение холестерола и других липидов в мембранах равно 0,3-0,9. Самое высокое значение имеет эта величина для цитоплазматической мембраны.

Увеличение содержания холестерола в мембранах уменьшает подвижность цепей жирных кислот, что влияет на конформационную лабильность мембранных белков и снижает возможность их латеральной диффузии. При повышении текучести мембран, вызванном действием на них липофильных веществ или перекисным окислением липидов, доля холестерола в мембранах возрастает.

Рис. 4.4. Положение в мембране фосфолипидов и холестерола.

Молекула холестерола состоит из жесткого гидрофобного ядра и гибкой углеводородной цепи. Полярной «головкой» является ОН-группа у 3-го углеродного атома молекулы холестерола. Для сравнения на рисунке представлено схематическое изображение фосфолипида мембран. Полярная головка этих молекул значительно больше и имеет заряд

Липидный состав мембран различен, содержание того или другого липида, по-видимому, определяется разнообразием функций, которые выполняют эти молекулы в мембранах.

Главные функции липидов мембран состоят в том, что они:

Формируют липидный бислой - структурную основу мембран;

Обеспечивают необходимую для функционирования мембранных белков среду;

Участвуют в регуляции активности ферментов;

Служат «якорем» для поверхностных белков;

Участвуют в передаче гормональных сигналов.

Изменение структуры липидного бислоя может привести к нарушению функций мембран.

2. Белки мембран. Белки мембран различаются по своему положению в мембране (рис. 4.5). Мембранные белки, контактирующие с гидрофобной областью липидного бислоя, должны быть амфифильными, т.е. иметь неполярный домен. Амфифильность достигается благодаря тому, что:

Аминокислотные остатки, контактирующие с липидным бислоем, в основном неполярны;

Многие мембранные белки ковалентно связаны с остатками жирных кислот (ацилированы).

Ацильные остатки жирных кислот, присоединенные к белку, обеспечивают его «заякоревание» в мембране и возможность латеральной диффузии. Кроме того, белки мембран подвергаются таким посттрансляционным модификациям, как гликозилирование и фосфорилирование. Гликозилирование наружной поверхности интегральных белков защищает их от повреждения протеазами межклеточного пространства.

Рис. 4.5. Белки мембран:

1, 2 - интегральные (трансмембранные) белки; 3, 4, 5, 6 - поверхностные белки. В интегральных белках часть полипептидной цепи погружена в липидный слой. Те участки белка, которые взаимодействуют с углеводородными цепями жирных кислот, содержат преимущественно неполярные аминокислоты. Участки белка, находящиеся в области полярных «головок», обогащены гидрофильными аминокислотными остатками. Поверхностные белки разными способами прикрепляются к мембране: 3 - связанные с интегральными белками; 4 - присоединенные к полярным «головкам» липидного слоя; 5 - «заякоренные» в мембране с помощью короткого гидрофобного концевого домена; 6 - «заякоренные» в мембране с помощью ковалентно связанного ацильного остатка

Наружный и внутренний слои одной и той же мембраны различаются по составу липидов и белков. Эта особенность в строении мембран называется трансмембранней асимметрией.

Белки мембран могут участвовать в:

Избирательном транспорте веществ в клетку и из клетки;

Передаче гормональных сигналов;

Образовании «окаймленных ямок», участвующих в эндоцитозе и экзоцитозе;

Иммунологических реакциях;

Качестве ферментов в превращениях веществ;

Организации межклеточных контактов, обеспечивающих образование тканей и органов.

ТЕМА 4.2. ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ

Одна из главных функций мембран - регуляция переноса веществ в клетку и из клетки, удержание веществ, которые нужны клетке и выведение ненужных. Транспорт ионов, органических молекул через мембраны может проходить по градиенту концентрации - пассивный транспорт и против градиента концентрации - активный транспорт.

1. Пассивный транспорт может осуществляться следующими способами (рис. 4.6, 4.7):

Рис. 4.6. Механизмы переноса веществ через мембраны по градиенту концентрации

К пассивному транспорту относится диффузия ионов по белковым каналам, например диффузия Н+, Са 2 +, N+, К+. Функционирование большинства каналов регулируется специфическими лигандами или изменением трансмембранного потенциала.

Рис. 4.7. Са 2 +-канал мембраны эндоплазматического ретикулума, регулируемый инози- тол-1,4,5-трифосфатом (ИФ 3).

ИФ 3 (инозитол-1,4,5-трифосфат) образуется при гидролизе мембранного липида ФИФ 2 (фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата) под действием фермента фосфолипазы С. ИФ 3 связывается специфическими центрами протомеров Са 2 +- канала мембраны эндоплазматического ретикулума. Изменяется конформация белка и канал открывается - Са 2 + поступает в цитозоль клетки по градиенту концентрации

2. Активный транспорт. Первично-активный транспорт происходит против градиента концентрации с затратой энергии АТФ при участии транспортных АТФаз, например Na+, К+-АТФаза, Н+-АТФаза, Са 2 +-АТФаза (рис. 4.8). Н + -АТФазы функционируют как протонные насосы, с помощью которых создается кислая среда в лизосомах клетки. С помощью Са 2+ -АТФазы цитоплазматической мембраны и мембраны эндоплазматического ретикулума поддерживается низкая концентрация кальция в цитозоле клетки и создается внутриклеточное депо Са 2+ в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме.

Вторично-активный транспорт происходит за счет градиента концентрации одного из переносимых веществ (рис. 4.9), который создается чаще всего Na+, К+-АТФазой, функционирующей с затратой АТФ.

Присоединение в активный центр белка-переносчика вещества, концентрация которого выше, изменяет его конформацию и увеличивает сродство к соединению, которое проходит в клетку против градиента концентрации. Вторично-активный транспорт бывает двух типов: активный симпорт и антипорт.

Рис. 4.8. Механизм функционирования Са 2 +-АТФазы

Рис. 4.9. Вторично-активный транспорт

3. Перенос макромолекул и частиц с участием мембран - эндоцитоз и экзоцитоз.

Перенос из внеклеточной среды в клетку макромолекул, например белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов или еще более крупных частиц, происходит путем эндоцитоза. Связывание веществ или высокомолекулярных комплексов происходит в определенных участках плазматической мембраны, которые называются окаймленными ямками. Эндоцитоз, происходящий с участием рецепторов, встроенных в окаймленные ямки, позволяет клеткам поглощать специфические вещества и называется рецептор-зависимым эндоцитозом.

Макромолекулы, например пептидные гормоны, пищеварительные ферменты, белки внеклеточного матрикса, липопротеиновые комплексы, секретируются в кровь или межклеточное пространство путем экзоцитоза. Этот способ транспорта позволяет выводить из клетки вещества, которые накапливаются в секреторных гранулах. В большинстве случаев экзоцитоз регулируется путем изменения концентрации ионов кальция в цитоплазме клеток.

ТЕМА 4.3. ТРАНСМЕМБРАННАЯ ПЕРЕДАЧА СИГНАЛОВ

Важное свойство мембран - способность воспринимать и передавать внутрь клетки сигналы из окружающей среды. Восприятие клетками внешних сигналов происходит при их взаимодействии с рецепторами, расположенными в мембране клеток-мишеней. Рецепторы, присоединяя сигнальную молекулу, активируют внутриклеточные пути передачи информации, это приводит к изменению скорости различных метаболических процессов.

1. Сигнальная молекула, специфически взаимодействующая с мембранным рецептором, называется первичным мессенджером. В качестве первичных мессенджеров выступают различные химические соединения - гормоны, нейромедиаторы, эйкозаноиды, ростовые факторы или физические факторы, например квант света. Рецепторы клеточной мембраны, активированные первичными мессенджерами, передают полученную информацию системе белков и ферментов, которые образуют каскад передачи сигнала, обеспечивающий усиление сигнала в несколько сот раз. Время ответа клетки, заключающееся в активации или инактивации метаболических процессов, мышечного сокращения, транспорта веществ из клеток-мишеней, может составлять несколько минут.

Мембранные рецепторы подразделяются на:

Рецепторы, содержащие субъединицу, связывающую первичный мессенджер, и ионный канал;

Рецепторы, способные проявлять каталитическую активность;

Рецепторы, с помощью G-белков активирующие образование вторичных (внутриклеточных) мессенджеров, передающих сигнал специфическим белкам и ферментам цитозоля (рис. 4.10).

Вторичные мессенджеры имеют небольшую молекулярную массу, с высокой скоростью диффундируют в цитозоле клетки, изменяют активность соответствующих белков, а затем быстро расщепляются или удаляются из цитозоля.

Рис. 4.10. Рецепторы, локализованные в мембране.

Мембранные рецепторы можно разделить на три группы. Рецепторы: 1 - содержащие субъединицу, связывающую сигнальную молекулу и ионный канал, например рецептор ацетилхолина на постсинаптической мембране; 2 - проявляющие каталитическую активность после присоединения сигнальной молекулы, например рецептор инсулина; 3, 4 - передающие сигнал на фермент аденилатциклазу (АЦ) или фосфолипазу С (ФЛС) при участии мембранных G-белков, например разные типы рецепторов адреналина, ацетилхолина и других сигнальных молекул

Роль вторичных мессенджеров выполняют молекулы и ионы:

ЦАМФ (циклический аденозин-3",5"-монофосфат);

ЦГМФ (циклический гуанозин-3",5"-монофосфат);

ИФ 3 (инозитол-1,4,5-трифосфат);

ДАГ (диацилглицерол);

Существуют гормоны (стероидные и тиреоидные), которые, проходя липидный бислой, проникают в клетку и взаимодействуют с внутриклеточными рецепторами. Физиологически важным различием между мембранными и внутриклеточными рецепторами является скорость ответа на поступающий сигнал. В первом случае эффект будет быстрым и непродолжительным, во втором - медленным, но длительным.

Рецепторы, сопряженные с G-белками

Взаимодействие гормонов с рецепторами, сопряженными с G-белками, приводит к активации инозитолфосфатной системы трансдукции сигнала или изменению активности аденилатциклазной регуляторной системы.

2. Аденилатциклазная система включает (рис. 4.11):

- интегральные белки цитоплазматической мембраны:

R s - рецептор первичного мессенджера - активатора аденилатциклазной системы (АЦС);

R ; - рецептор первичного мессенджера - ингибитора АЦС;

Фермент аденилатциклазу (АЦ).

- «заякоренные» белки:

G s - ГТФ-связывающий белок, состоящий из α,βγ-субъединиц, в котором (α,-субъединица связана с молекулой ГДФ;

Рис. 4.11. Функционирование аденилатциклазной системы

G ; - ГТФ-связывающий белок, состоящий из αβγ-субъединиц, в котором а; -субъединица связана с молекулой ГДФ; - цитозольный фермент протеинкиназу А (ПКА).

Последовательность событий передачи сигнала первичных мессенджеров с помощью аденилатциклазной системы

Рецептор имеет центры связывания первичного мессенджера на наружной поверхности мембраны и G-белка (α,βγ-ГДФ) на внутренней поверхности мембраны. Взаимодействие активатора аденилатциклазной системы, например гормона с рецептором (R s), приводит к изменению конформации рецептора. Увеличивается сродство рецептора к G..-белку. Присоединение комплекса гормон-рецептор к GS-ГДФ снижает сродство α,-субъединицы G..-белка к ГДФ и увеличивает сродство к ГТФ. В активном центре α,-субъединицы ГДФ замещается на ГТФ. Это вызывает изменение конформации субъединицы α, и снижение ее сродства к субъединицам βγ. Отделившаяся субъединица α,-ГТФ латерально перемещается в липидном слое мембраны к ферменту аденилатциклазе.

Взаимодействие α,-ГТФ с регуляторным центром аденилатциклазы изменяет конформацию фермента, приводит к его активации и увеличению скорости образования вторичного мессенджера - циклического аденозин- 3",5"-монофосфата (цАМФ) из АТФ. В клетке повышается концентрация цАМФ. Молекулы цАМФ могут обратимо соединяться с регуляторными субъединицами протеинкиназы А (ПКА), которая состоит из двух регуляторных (R) и двух каталитических (С) субъединиц - (R 2 С 2). Комплекс R 2 С 2 ферментативной активностью не обладает. Присоединение цАМФ к регуляторным субъединицам вызывает изменение их конформации и потерю комплементарности к С-субъединицам. Каталитические субъединицы приобретают ферментативную активность.

Активная протеинкиназа А с помощью АТФ фосфорилирует специфические белки по остаткам серина и треонина. Фосфорилирование белков и ферментов повышает или понижает их активность, поэтому изменяется скорость метаболических процессов, в которых они участвуют.

Активация сигнальной молекулой рецептора R стимулирует функционирование Gj-белка, которое протекает по тем же правилам, что и для G..-белка. Но при взаимодействии субъединицы α i -ГТФ с аденилатциклазой активность фермента снижается.

Инактивация аденилатциклазы и протеинкиназы А

α,-Субъединица в комплексе с ГТФ при взаимодействии с аденилатциклазой начинает проявлять ферментативную (ГТФ-фосфатазную) активность, она гидролизует ГТФ. Образующаяся молекула ГДФ остается в активном центре α,-субъединицы, изменяет ее конформацию и уменьшает сродство к АЦ. Комплекс АЦ и α,-ГДФ диссоциирует, α,-ГДФ включается в G..-белок. Отделение α,-ГДФ от аденилатциклазы инактивирует фермент и синтез цАМФ прекращается.

Фосфодиэстераза - «заякоренный» фермент цитоплазматической мембраны гидролизует образовавшиеся ранее молекулы цАМФ до АМФ. Снижение концентрации цАМФ в клетке вызывает расщепление комплекса цАМФ 4 К" 2 и повышает сродство R- и С-субъединиц, образуется неактивная форма ПКА.

Фосфорилированные ферменты и белки под действием фосфопротеинфосфатазы переходят в дефосфорилированную форму, изменяется их конформация, активность и скорость процессов, в которых участвуют эти ферменты. В результате система приходит в исходное состояние и готова вновь активироваться при взаимодействии гормона с рецептором. Таким образом, обеспечивается соответствие содержания гормона в крови и интенсивности ответа клеток-мишеней.

3. Участие аденилатциклазной системы в регуляции экспрессии генов. Многие белковые гормоны: глюкагон, вазопрессин, паратгормон и др., передающие свой сигнал посредством аденилатциклазной системы, могут не только вызвать изменение скорости реакций путем фосфорилирования уже имеющихся в клетке ферментов, но и увеличивать или уменьшать их количество, регулируя экспрессию генов (рис. 4.12). Активная протеинкиназа А может проходить в ядро и фосфорилировать фактор транскрипции (СRЕВ). Присоединение фосфорного

Рис. 4.12. Аденилатциклазный путь, приводящий к экспрессии специфических генов

остатка повышает сродство фактора транскрипции (СRЕВ-(Р) к специфиче-ской последовательности регуляторной зоны ДНК-СRЕ (цАМФ-response element) и стимулирует экспрессию генов определенных белков.

Синтезированные белки могут быть ферментами, увеличение количества которых повышает скорость реакций метаболических процессов, или мембранными переносчиками, обеспечивающими поступление или выход из клетки определенных ионов, воды или других веществ.

Рис. 4.13. Инозитолфосфатная система

Работу системы обеспечивают белки: кальмодулин, фермент протеинкиназа С, Са 2 +-кальмодулин-зависимые протеинкиназы, регулируемые Са 2 +-каналы мембраны эндоплазматического ретикулума, Са 2 +-АТФазы клеточной и митохондриальной мембран.

Последовательность событий передачи сигнала первичных мессенджеров с помощью инозитолфосфатной системы

Связывание активатора инозитолфосфатной системы с рецептором (R) приводит к изменению его конформации. Повышается сродство рецептора к Gф лс -белку. Присоединение комплекса первичный мессенджер-рецептор к Gф лс -ГДФ снижает сродство аф лс -субъединицы к ГДФ и увеличивает сродство к ГТФ. В активном центре аф лс -субъединицы ГДФ замещается на ГТФ. Это вызывает изменение конформации субъединицы аф лс и снижение сродства к субъединицам βγ, происходит диссоциация Gф лс -белка. Отделившаяся субъединица аф лс -ГТФ латерально перемещается по мембране к ферменту фосфолипазе С.

Взаимодействие аф лс -ГТФ с центром связывания фосфолипазы С изменяет конформацию и активность фермента, возрастает скорость гидролиза фосфолипида клеточной мембраны - фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфа- та (ФИФ 2) (рис. 4.14).

Рис. 4.14. Гидролиз фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (ФИФ 2)

В ходе реакции образуются два продукта - вторичные вестники гормонального сигнала (вторичные мессенджеры): диацилглицерол, который остается в мембране и участвует в активации фермента протеинкиназы С, и инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ 3), который, будучи гидрофильным соединением, уходит в цитозоль. Таким образом, сигнал, принятый рецептором клетки, раздваивается. ИФ 3 связывается специфическими центрами Са 2+ - канала мембраны эндоплазматического ретикулума (Э)), что приводит к изменению конформации белка и открытию Са 2+ -канала. Так как концентрация кальция в ЭР примерно на 3-4 порядка выше, чем в цитозоле, после открытия канала Са 2+ по градиенту концентрации поступает в цитозоль. В отсутствие ИФ 3 в цитозоле канал закрыт.

В цитозоле всех клеток содержится небольшой белок кальмодулин, имеющий четыре центра связывания Са 2+ . При повышении концентрации

кальция он активно присоединяется к кальмодулину, образуя комплекс 4Са 2+ -кальмодулин. Этот комплекс взаимодействует с Са 2+ -кальмодулинзависимыми протеинкиназами, другими ферментами и повышает их активность. Активированная Са 2 +-кальмодулин-зависимая протеинкиназа фосфорилирует определенные белки и ферменты, в результате чего изменяется их активность и скорость метаболических процессов, в которых они участвуют.

Повышение концентрации Са 2+ в цитозоле клетки увеличивает скорость взаимодействия Са 2 + с неактивным цитозольным ферментом протеинкиназой С (ПКС). Связывание ПКС с ионами кальция стимулирует перемещение белка к плазматической мембране и позволяет ферменту вступать во взаимодействие с отрицательно заряженными «головками» молекул фосфатидилсерина (ФС) мембраны. Диацилглицерол, занимая специфические центры в протеинкиназе С, в еще большей степени увеличивает ее сродство к ионам кальция. На внутренней стороне мембраны образуется активная форма ПКС (ПКС? Са 2 + ? ФС? ДАГ), которая фосфорилирует специфические ферменты.

Включение ИФ-системы непродолжительно, и после ответа клетки на стимул происходит инактивация фосфолипазы С, протеинкиназы С и Са 2 +-кальмодулин-зависимых ферментов. аф лс -Субъединица в комплексе с ГТФ и фосфолипазой С проявляет ферментативную (ГТФ-фосфатазную) активность, она гидролизует ГТФ. Связанная с ГДФ аф лс -субъединица теряет сродство к фосфолипазе С и возвращается в исходное неактивное состояние, т.е. включается в комплекс αβγ-ГДФ Gф лс -белок).

Отделение аф лс -ГДФ от фосфолипазы С инактивирует фермент и гидролиз ФИФ 2 прекращается. Повышение концентрации Са 2+ в цитозоле активирует работу Са 2+ -АТФаз эндоплазматического ретикулума, цитоплазматической мембраны, которые «выкачивают» Са 2 + из цитозоля клетки. В этом процессе принимают участие также Na+/Са 2 +- и Н+/Са 2 +-переносчики, функционирующие по принципу активного антипорта. Снижение концентрации Са 2+ приводит к диссоциации и инактивации Са 2+ -кальмодулинзависимых ферментов, а также потере сродства протеинкиназы С к липидам мембраны и снижению ее активности.

ИФ 3 и ДАГ, образовавшиеся в результате активации системы, могут снова взаимодействовать друг с другом и превращаться в фосфатидилинозитол- 4,5-бисфосфат.

Фосфорилированные ферменты и белки под действием фосфопротеинфосфатазы переходят в дефосфорилированную форму, изменяется их конформация и активность.

5. Каталитические рецепторы. Каталитические рецепторы являются ферментами. Активаторами этих ферментов могут быть гормоны, ростовые факторы, цитокины. В активной форме - рецепторы-ферменты фосфорилируют специфические белки по -ОН-группам тирозина, поэтому их называют тирозиновыми протеинкиназами (рис. 4.15). При участии специальных механизмов сигнал, полученный каталитическим рецептором, может быть передан в ядро, где он стимулирует или подавляет экспрессию определенных генов.

Рис. 4.15. Активация рецептора инсулина.

Фосфопротеинфосфатаза дефосфорилирует специфические фосфопротеины.

Фосфодиэстераза превращает цАМФ в АМФ и цГМФ в ГМФ.

ГЛЮТ 4 - переносчики глюкозы в инсулинзависимых тканях.

Тирозиновая протеинфосфатаза дефосфорилирует β-субъединицы рецептора

инсулина

Примером каталитического рецептора может служить рецептор инсулина, в состав которого входят две а- и две β-субъединицы. а-Субъединицы расположены на наружной поверхности клеточной мембраны, β-субъединицы пронизывают мембранный бислой. Центр связывания инсулина образован N-концевыми доменами а-субъединиц. Каталитический центр рецептора находится на внутриклеточных доменах β-субъединиц. Цитозольная часть рецептора имеет несколько остатков тирозина, которые могут фосфорилироваться и дефосфорилироваться.

Присоединение инсулина в центр связывания, образованный а-субъединицами, вызывает кооперативные конформационные изменения рецептора. β-Субъединицы проявляют тирозинкиназную активность и катализируют трансаутофосфорилирование (первая β-субъединица фосфорилирует вторую β-субъединицу, и наоборот) по нескольким остаткам тирозина. Фосфорилирование приводит к изменению заряда, конформации и субстратной специфичности фермента (Тир-ПК). Тирозиновая-ПК фосфорилирует определенные клеточные белки, которые получили название субстратов рецептора инсулина. В свою очередь эти белки участвуют в активации каскада реакций фосфорилирования:

фосфопротеинфосфатазы (ФПФ), которая дефосфорилирует специфические фосфопротеины;

фосфодиэстеразы, которая превращает цАМФ в АМФ и цГМФ в ГМФ;

ГЛЮТ 4 - переносчиков глюкозы в инсулинзависимых тканях, поэтому повышается поступление глюкозы в клетки мышц и жировой ткани;

тирозиновой протеинфосфатазы, которая дефосфорилирует β-субъединицы рецептора инсулина;

регуляторных белков ядра, факторов транскрипции, повышающих или снижающих экспрессию генов определенных ферментов.

Реализация эффекта ростовых факторов может осуществляться с помощью каталитических рецепторов, которые состоят из одной полипептидной цепи, но при связывании первичного мессенджера образуют димеры. Все рецепторы этого типа имеют внеклеточный гликозилированный домен, трансмембранный (а-спираль) и цитоплазматический домен, способный при активации проявлять протеинкиназную активность.

Димеризация способствует активации их каталитических внутриклеточных доменов, которые осуществляют трансаутофосфорилирование по аминокислотным остаткам серина, треонина или тирозина. Присоединение фосфорных остатков приводит к формированию у рецептора центров связывания для специфических цитозольных белков и активации протеинкиназного каскада передачи сигнала (рис. 4.16).

Последовательность событий передачи сигнала первичных мессенджеров (ростовых факторов) при участии Ras- и Raf-белков.

Связывание рецептора (R) с фактором роста (ФР) приводит к его димеризации и трансаутофосфорилированию. Фосфорилированный рецептор приобретает сродство к Grb2-белку. Образованный комплекс ФР*R*Grb2 взаимодействует с цитозольным белком SOS. Изменение конформации SOS

обеспечивает его взаимодействие с заякоренным белком мембраны Ras-ГДФ. Образование комплекса ФР?R?Gгb2?SOS?Ras-ГДФ снижает сродство Ras- белка к ГДФ и увеличивает сродство к ГТФ.

Замена ГДФ на ГТФ изменяет конформацию Ras-белка, который отделяется от комплекса и взаимодействует с Raf-белком в примембранной области. Комплекс Ras-ГТФ?Raf проявляет протеинкиназную активность и фосфорилирует фермент МЕК-киназу. Активированная МЕК-киназа в свою очередь фосфорилирует МАП-киназу по треонину и тирозину.

Рис.4.16. МАП-киназный каскад.

Рецепторы такого типа имеют эпидермальный фактор роста (ЭФР), фактор роста нервов (ФРН) и другие ростовые факторы.

Grb2 - протеин, взаимодействующий с рецептором ростового фактора (growth receptor binding protein); SOS (GEF) - ГДФ-ГТФ обменный фактор (guanine nucleotide exchange factor); Ras - G-белок (гуанидинтрифосфатаза); Raf-киназа - в активной форме - фосфорилирующая МЕК-киназу; МЕК-киназа - киназа МАП-киназы; МАП-киназа - митогенактивированная протеинкиназа (mitogen-aktivated protein kinase)

Присоединение группы -РО 3 2- к аминокислотным радикалам МАП-киназы изменяет ее заряд, конформацию и активность. Фермент фосфорилирует по серину и треонину специфические белки мембран, цитозоля и ядра.

Изменение активности этих белков оказывает влияние на скорость метаболических процессов, функционирование мембранных транслоказ, митотическую активность клеток-мишеней.

Рецепторы с гуанилатциклазной активностью также относятся к каталитическим рецепторам. Гуанилатциклаза катализирует образование из ГТФ цГМФ, который является одним из важных мессенджеров (посредников) внутриклеточной передачи сигнала (рис. 4.17).

Рис. 4.17. Регуляция активности мембранной гуанилатциклазы.

Мембранно-связанная гуанилатциклаза (ГЦ) - трансмембранный гликопротеин. Центр связывания сигнальной молекулы находится на внеклеточном домене, внутриклеточный домен гуанилатциклазы в результате активации проявляет каталитическую активность

Присоединение первичного мессенджера к рецептору активирует гуанилатциклазу, которая катализирует превращение ГТФ в циклический гуанозин-3",5"-монофосфат (цГМФ) - вторичный мессенджер. В клетке повышается концентрация цГМФ. Молекулы цГМФ могут обратимо присоединяться к регуляторным центрам протеинкиназы G (ПКЧ5), которая состоит из двух субъединиц. Четыре молекулы цГМФ изменяют конформацию и активность фермента. Активная протеинкиназа G катализирует фосфорилирование определенных белков и ферментов цитозоля клетки. Одним из первичных мессенджеров протеинкиназы G является предсердный натриуретический фактор (ПНФ), регулирующий гомеостаз жидкости в организме.

6. Передача сигнала с помощью внутриклеточных рецепторов. Гидрофобные по химической природе гормоны (стероидные гормоны и тироксин) могут диффундировать через мембраны, поэтому их рецепторы находятся в цитозоле или ядре клетки.

Цитозольные рецепторы связаны с белком-шапероном, который предотвращает преждевременную активацию рецептора. Ядерные и цитозольные рецепторы стероидных и тиреоидных гормонов содержат ДНКсвязывающий домен, обеспечивающий в ядре взаимодействие комплекса гормон-рецептор с регуляторными участками ДНК и изменение скорости транскрипции.

Последовательность событий, приводящих к изменению скорости транскрипции

Гормон проходит через двойной липидный слой клеточной мембраны. В цитозоле или ядре гормон взаимодействует с рецептором. Комплекс гормон-рецептор проходит в ядро и присоединяется к регуляторной нуклеотидной последовательности ДНК - энхансеру (рис. 4.18) или сайленсеру. Доступность промотора для РНК-полимеразы увеличивается при взаимодействии с энхансером или уменьшается при взаимодействии с сайленсером. Соответственно увеличивается или уменьшается скорость транскрипции определенных структурных генов. Зрелые мРНК выходят из ядра. Увеличивается или уменьшается скорость трансляции определенных белков. Изменяется количество белков, которые влияют на метаболизм и функциональное состояние клетки.

В каждой клетке существуют рецепторы, включенные в состав разных сигнал-трансдукторных систем, преобразующих все внешние сигналы во внутриклеточные. Число рецепторов для конкретного первичного мессенджера может варьировать в пределах от 500 до более 100 000 на клетку. Они располагаются на мембране отдаленно друг от друга либо сосредоточены в определенных ее участках.

Рис. 4.18. Передача сигнала на внутриклеточные рецепторы

б) из таблицы выберите липиды, участвующие в:

1. Активации протеинкиназы С

2. Реакции образования ДАГ под действием фосфолипазы С

3. Формировании миелиновых оболочек нервных волокон

в) напишите реакцию гидролиза липида, выбранного вами в п. 2;

г) укажите, какой из продуктов гидролиза участвует в регуляции Са 2 +-канала эндоплазматического ретикулума.

2. Выберите правильные ответы.

На конформационную лабильность белков-переносчиков может влиять:

Б. Изменение электрического потенциала на мембране

B. Присоединение специфических молекул Г. Жирнокислотный состав липидов бислоя Д. Количество переносимого вещества

3. Установите соответствие:

A. Кальциевый канал ЭР Б. Са 2 +-АТФаза

Г. Ка+-зависимый переносчик Са 2 + Д. N+, К+-АТФаза

1. Переносит Na+ по градиенту концентрации

2. Функционирует по механизму облегченной диффузии

3. Переносит Na+ против градиента концентрации

4. Перенесите табл. 4.2. в тетрадь и заполните ее.

Таблица 4.2. Аденилатциклазная и инозитолфосфатная системы

Строение и этапы функционирования	Аденилатциклазная система	Инозитолфосфатная система
Пример первичного мессенджера системы
Интегральный белок клеточной мембраны, взаимодействующий комплементарно с первичным мессенджером
Белок, активирующий фермент сигнальной системы
Фермент системы, образующий вторичный (е) мессенджер (ы)
Вторичный (ые) мессенджер (-ы) системы
Цитозольный (е) фермент (ы) системы, взаимодействующий (е) с вторичным мессенджером
Механизм регуляции (в данной системе) активности ферментов метаболических путей
Механизмы снижения концентрации вторичных мессенджеров в клетке-мишени
Причина снижения активности мембранного фермента сигнальной системы

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1. Установите соответствие:

A. Пассивный симпорт Б. Пассивный антипорт

B. Эндоцитоз Г. Экзоцитоз

Д. Первично-активный транспорт

1. Транспорт вещества в клетку происходит вместе с частью плазматической мембраны

2. Одновременно в клетку по градиенту концентрации проходят два разных вещества

3. Перенос веществ идет против градиента концентрации

2. Выберите правильный ответ.

ag -Субъединица G-белка, связанная с ГТФ, активирует:

A. Рецептор

Б. Протеинкиназу А

B. Фосфодиэстеразу Г. Аденилатциклазу Д. Протеинкиназу С

3. Установите соответствие.

Функция:

A. Регулирует активность каталитического рецептора Б. Активирует фосфолипазу С

B. Переводит в активную форму протеинкиназу А

Г. Повышает концентрацию Са 2+ в цитозоле клетки Д. Активирует протеинкиназу С

Вторичный мессенджер:

4. Установите соответствие.

Функционирование:

A. Способен к латеральной диффузии в бислое мембраны

Б. В комплексе с первичным мессенджером присоединяется к энхансеру

B. Проявляет ферментативную активность при взаимодействии с первичным мессенджером

Г. Может взаимодействовать с G-белком

Д. В процессе передачи сигнала взаимодействует с фосфолипазой С Рецептор:

1. Инсулина

2. Адреналина

3. Стероидного гормона

5. Выполните «цепное» задание:

а) пептидные гормоны взаимодействуют с рецепторами:

A. В цитозоле клетки

Б. Интегральными белками мембран клеток-мишеней

B. В ядре клетки

Г. Ковалентно связанными с ФИФ 2

б) взаимодействие такого рецептора с гормоном вызывает повышение концентрации в клетке:

A. Гормона

Б. Промежуточных метаболитов

B. Вторичных мессенджеров Г. Ядерных белков

в) этими молекулами могут быть:

A. ТАГ Б. ГТФ

B. ФИФ 2 Г. цАМФ

г) они активируют:

A. Аденилатциклазу

Б. Са 2+ -зависимый кальмодулин

B. Протеинкиназу А Г. Фосфолипазу С

д) этот фермент изменяет скорость метаболических процессов в клетке путем:

A. Повышения концентрации Са 2 + в цитозоле Б. Фосфорилирования регуляторных ферментов

B. Активации протенфосфатазы

Г. Изменения экспрессии генов регуляторных белков

6. Выполните «цепное» задание:

а) присоединение фактора роста (ФР) к рецептору (R) приводит к:

A. Изменению локализации комплекса ФР-R

Б. Димеризации и трансаутофосфорилированию рецептора

B. Изменению конформации рецептора и присоединению к Gs-белку Г. Перемещению комплекса ФР-R

б) такие изменения в структуре рецептора увеличивают его сродство к поверхностному белку мембраны:

Б. Raf Г. Grb2

в) это взаимодействие повышает вероятность присоединения к комплексу цитозольного белка:

А. Кальмодулина B. Ras

Б. ПКС Г. SOS

г) который увеличивает комплементарность комплекса к «заякоренному» белку:

д) изменение конформации «заякоренного» белка снижает его сродство к:

А. цАМФ B. ГТФ

Б. ГДФ Г. АТФ

е) это вещество заменяется на:

А. ГДФ B. АМФ

Б. цГМФ Г. ГТФ

ж) присоединение нуклеотида способствует взаимодействию «заякоренного» белка с:

А. ПКА B. Кальмодулином

з) этот белок входит в состав комплекса, который фосфорилирует:

А. МЕК-киназу В. Протеинкиназу С

Б. Протеинкиназу А Г. МАП-киназу

и) этот фермент в свою очередь активирует:

А. МЕК-киназу В. Протеинкиназу G

Б. Raf-белок Г. МАП-киназу

к) фосфорилирование белка повышает его сродство к:

А. Белкам SOS и Raf В. Регуляторным белкам ядра Б. Кальмодулину Г. Ядерным рецепторам

л) активация этих белков приводит к:

A. Дефосфорилированию ГТФ в активном центре белка Ras Б. Снижению сродства рецептора к фактору роста

B. Повышению скорости матричных биосинтезов Г. Диссоциации комплекса SOS-Grb2

м) вследствие этого:

A. Белок SOS отделяется от рецептора

Б. Происходит диссоциация протомеров рецептора (R)

B. Ras-белок отделяется от Raf-белка

Г. Возрастает пролиферативная активность клетки-мишени.

ЭТАЛОНЫ ОТВЕТОВ К «ЗАДАНИЯМ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ»

1. 1-В, 2-А, 3-Д

3. 1-В, 2-Д, 3-Г

4. 1-В, 2-Г, 3-Б

5. а) Б, б) В, в) Г, г) В, д) Б

6. а) Б, б) Г, в) Г, г) А, д) Б, е) Г, ж) Г, з) А, и) Г, к) В, л) В, м) Г

ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ПОНЯТИЯ

1. Структура и функции мембран

2. Транспорт веществ через мембраны

3. Особенности строения белков мембран

4. Трансмембранные системы передачи сигналов (аденилатциклазная, инозитолфосфатная, гуанилатциклазная, каталитические и внутриклеточные рецепторы)

5. Первичные мессенджеры

6. Вторичные мессенджеры (посредники)

ЗАДАНИЯ ДЛЯ АУДИТОРНОЙ РАБОТЫ

1. Ознакомьтесь с рис. 4.19 и выполните следующие задания:

а) назовите вид транспорта;

б) установите порядок событий:

A. Cl - по градиенту концентрации выходит из клетки

Б. Протеинкиназа А фосфорилирует R-субъединицу канала

B. Изменяется конформация R-субъединицы

Г. Происходят кооперативные конформационные изменения мембранного белка

Д. Активируется аденилатциклазная система

Рис. 4.19. Функционирование С1 - -канала эндотелия кишечника.

R - регуляторный белок, который переходит в фосфорилированную форму под действием протеинкиназы А (ПКА)

в) сравните функционирование Са 2+ -канала мембраны эндоплазматического ретикулума и Cl - -канала клетки эндотелия кишечника, заполнив табл. 4.3.

Таблица 4.3. Способы регуляции функционирования каналов

Решите задачи

1. Сокращение сердечной мышцы активирует Са 2 +, содержание которого в цитозоле клетки повышается за счет функционирования цАМФ-зависимых переносчиков цитоплазматической мембраны. В свою очередь, концентрация цАМФ в клетках регулируется двумя сигнальными молекулами - адреналином и ацетилхолином. Причем известно, что адреналин, взаимодействуя с β 2 -адренорецепторами, повышает концентрацию цАМФ в клетках миокарда и стимулирует сердечный выброс, а ацетилхолин, взаимодействуя с М 2 -холинорецепторами, снижает уровень цАМФ и сократимость миокарда. Объясните, почему два первичных мессенджера, используя одну и ту же систему трансдукции сигнала, вызывают различный клеточный ответ. Для этого:

а) представьте схему передачи сигнала для адреналина и ацетилхолина;

б) укажите различие в каскадах передачи сигналов этих мессенджеров.

2. Ацетилхолин, взаимодействуя с М 3 -холинорецепторами слюнных желез, стимулирует выход Са 2+ из ЭР. Повышение концентрации Са 2+ в цитозоле обеспечивает экзоцитоз секреторных гранул и высвобождение в слюнной проток электролитов и небольшого количества белков. Объясните, как регулируется работа Са 2+ -каналов ЭР. Для этого:

а) назовите вторичный мессенджер, обеспечивающий открытие Са 2+ -каналов ЭР;

б) напишите реакцию образования вторичного мессенджера;

в) представьте схему трансмембранной передачи сигнала ацетилхолина, в ходе активации которой образуется регуляторный лиганд Са 2+ -кана-

3. Исследователи рецептора инсулина установили значительное изменение в гене белка - одного из субстратов инсулинового рецептора. Как нарушение в структуре этого белка скажется на функционировании системы передачи сигнала инсулина? Для ответа на вопрос:

а) приведите схему трансмембранной передачи сигнала инсулина;

б) назовите белки и ферменты, которые активирует инсулин в клеткахмишенях, укажите их функцию.

4. Белок Ras является «заякоренным» белком цитоплазматической мембраны. Функцию «якоря» выполняет 15-углеродный остаток фарнезила Н 3 С-(СН 3)С=СН-СН 2 -[СН 2 -(СН 3)С=СН-СН 2 ] 2 -, который присоединяется к белку ферментом фарнезилтрансферазой в ходе посттрансляционной модификации. В настоящее время ингибиторы этого фермента проходят клинические испытания.

Почему использование этих препаратов приводит к нарушению трансдукции сигнала ростовых факторов? Для ответа:

а) представьте схему передачи сигнала с участием Ras-белков;

б) объясните функцию Ras-белков и последствия нарушения их ацилирования;

в) предположите, для лечения каких заболеваний были разработаны эти препараты.

5. Стероидный гормон кальцитриол активирует всасывание пищевого кальция, увеличивая количество белков-переносчиков Са 2+ в клетках кишечника. Объясните механизм действия кальцитриола. Для этого:

а) приведите общую схему передачи сигнала стероидных гормонов и опишите ее функционирование;

б) назовите процесс, который активирует гормон в ядре клетки-мишени;

в) укажите, в каком матричном биосинтезе будут участвовать молекулы, синтезированные в ядре, и где он протекает.

В зависимости от локализации рецепторов в клетках–мишенях гормоны можно разделить на три группы.

Первую группу составляютгормоны липидной природы. Будучи жирорастворимыми, они легко проникают через клеточную мембрану и взаимодействуют с рецепторами, локализованными внутри клетки,–как правило, в цитоплазме.

Втораягруппа–белковые и пептидные гормоны. Они состоят из аминокислот и по сравнению с гормонами липидной природы имеют более высокую молекулярную массу и менее липофильны, из–за чего с трудом проходят через плазматическую мембрану. Рецепторы этих гормонов находятся на поверхности клеточной мембраны, так что белковые и пептидные гормоны в клетку не проникают.

Третью химическую группу гормонов составляют низкомолекулярныетиреоидные гормоны, образованные двумя аминокислотными остатками, связанными между собой эфирной связью. Эти гормоны легко проникают во все клетки тела и взаимодействуют с рецепторами, локализованными в ядре. Одна и та же клетка может иметь рецепторы всех трех типов, т.е. локализованные в ядре, цитозоле и на поверхности плазматической мембраны. Кроме того, в одной и той же клетке могут присутствовать разные рецепторы одного типа; например, на поверхности клеточной мембраны могут находиться рецепторы разных пептидных и/или белковых гормонов.

Вторичные посредники: 1)циклические нуклеотиды (цАМФ и цГМФ); 2)ионы Ca и 3)метаболиты фосфатидилинозитола.

Присоединение гормона к рецептору позволяет последнему взаимодействовать с G-белком. Если G-белок активирует систему аденилатциклаза-цАМФ, его называют Gs-белком. Стимуляция аденилатциклазы, связанной с мембраной фермента посредствам Gs-белка, катализирует превращение небольшого количества присутствующего в цитоплазме аденозинтрифосфата в цАМФ внутри клетки.

Следующий этап опосредован активацией цАМФ-зависимой протеинкиназой, которая фосфорилирует специфические белки в клетке, запуская биохимические реакции, что гарантированно обеспечивает ответ клетки на действие гормона.

Как только цАМФ образуется в клетке, это обеспечивает последовательную активацию ряда ферментов, т.е. каскадную реакцию. Таким образом, первый активированный фермент активирует второй, который активирует третий. Задача такого механизма заключается в том, что небольшое количество молекул, активированных аденилатциклазой, может активировать значительно большее количество молекул на следующем этапе каскадной реакции, что является способом усиления ответа.

В итоге благодаря этому механизму ничтожно малое количество гормона, действующее на поверхность мембраны клетки, запускает мощный каскад активирующих реакций.

Если гормон взаимодействует с рецептором , сопряженным с тормозящим G-белком (Gi-белок), это снижает образование цАМФ и, как следствие, снижает активность клетки.

Вопросы для подготовки к занятию:

1. Гормональная регуляция как механизм межклеточной и межорганной координации обмена веществ. Основные механизмы регуляции метаболизма: изменение активности ферментов в клетке, изменение количества ферментов в клетке (индукция или репрессия синтеза), изменение проницаемости клеточных мембран.

2. Гормоны, общая характеристика, классификация гормонов по химическому строению и биологическим функциям. Механизм действия гормонов белковой природы.

3. Механизм действия гормонов стероидной природы и тироксина.

4. Гормоны гипоталамуса. Люлиберин, соматостатин, тиролиберин.

5. Гормоны гипофиза. Гормоны задней доли гипофиза: вазопрессин, окситоцин.

6. Строение синтез и метаболизм йодтиронинов.

7. Влияние йодтиронинов на обмен веществ. Гипо- и гипертиреозы.

8. Гормоны мозгового слоя надпочечников. Строение, влияние на обмен веществ. Биосинтез катехоламинов.

9. Гормон роста, строение, функции.

10. Гормоны околощитовидных желез. Регуляция фосфорно-кальциевого обмена.

11. Инсулин. Глюкагон. Влияние на обмен веществ.

12. Гормональная картина инсулинзависимого сахарного диабета

13. Гормональная картина инсулиннезависимого сахарного диабета

14. Стероидные гормоны. Глюкокортикоиды.

15. Половые гормоны.

16. Ренин-ангиотензиновая система.

17. Калликреин-кининовая система.

Выполните задания:

1. Либерины:

А. Небольшие пептиды

Б. Взаимодействуют с цитоплазматическими рецепторами.

В. Активируют секрецию тропных гормонов.

Г. Передают сигнал на рецепторы передней доли гипофиза.

Д. Вызывают секрецию инсулина.

2. Выберите неправильное утверждение. цАМФ:

А. Участвует в мобилизации гликогена.

Б. Второй вестник сигнала.

В. Активатор протеинкиназы.

Г. Кофермент аденилатциклазы.

Д. Субстрат фосфодиэстеразы.

3. Расположите события, происходящие при синтезе йодтиронинов, в необходимом порядке, используя цифровые обозначения:

А. Йодирование остатков тирозина в тироглобулине.

Б. Синтез тироглобулина.

В. Конденсация йодированных остатков тирозина.

Г. Транспорт йодтиронинов в клетки-мишени.

Д. Образование комплекса с тироксинсвязывающим белком.

4. Расположите перечисленные метаболиты в порядке их образования:

А. 17-ОН-прогестерон.

Б. Прегненолон.

В. Холестерин.

Г. Прогестерон

Д. Кортизол.

5. Выберите гормон, синтез и секреция которого возрастает в ответ на повышение осмотического давления:

А. Альдостерон.

Б. Кортизол.

В. Вазопрессин.

Г. Адреналин.

Д. Глюкагон.

6. Под влиянием инсулина в печени ускоряются:

А. Биосинтез белков

Б. Биосинтез гликогена.

В. Глюконеогенез.

Г. Биосинтез жирных кислот.

Д. Гликолиз.

7. Для трехдневного голодания верно все ниже перечисленное, кроме:

А. Инсулин-глюкагоновый индекс снижен.

Б. Скорость глюконеогенеза из аминокислот увеличивается.

В. Скорость синтеза ТАГ в печени снижается.

Г. Скорость b-окисления в печени снижается.

Д. Концентрация кетоновых тел в крови выше нормы.

8. При сахарном диабете в печени происходит:

А. Ускорение синтеза гликогена.

Б. Снижение скорости глюконеогенеза из лактата.

В. Снижение скорости мобилизации гликогена.

Г. Повышение скорости синтеза ацетоацетата.

Д. Повышение активности ацетил-КоА-карбоксилазы.

9. При ИНСД у больных наиболее часто обнаруживаются:

А. Гиперглюкоземия.

Б. Снижение скорости синтеза инсулина.

В. Концентрация инсулина в крови в норме или выше нормы.

Г. Антитела к b-клеткам поджелудочной железы.

Д. Микроангиопатии.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 14

Тема: Построение и анализ гликемических кривых

Цель: Изучить промежуточный обмен углеводов, роль углеводов в энергетическом обмене. Клинико-диагностическое значение метода сахарной нагрузки при сахарном диабете, аддисоновой болезни, гипофункции щитовидной железы и т.д.

Принцип метода : Определение глюкозы основано на реакции, катализируемой глюкозооксидазой:

глюкоза + О 2 глюконолактон + Н 2 О 2

Образующаяся в ходе данной реакции перекись водорода вызывает окисление субстратов пероксидазы с образованием окрашенного продукта.

Метод сахарной нагрузки : Утром натощак у больного берут кровь из пальца и определяют концентрацию глюкозы крови. После этого дают выпить 50 - 100 г глюкозы в 200 мл теплой кипяченой воды (1 г глюкозы на 1 кг веса) в течение не более 5 минут. Затем повторно исследуют содержание глюкозы в крови, беря из пальца кровь через каждые 30 минут в течение 2-3 часов. Строят график в координатах: время – концентрация глюкозы в сыворотке крови, по виду графика ставят или уточняют диагноз.

Ход работы: В образцах сыворотки (до и после приема глюкозы) определяют концентрацию глюкозы. Для этого в серию пробирок вносят 2 мл рабочего реактива (фосфатный буфер, субстраты пероксидазы + глюкозооксидазы в отношении 40:1). В одну из пробирок вносят 0,05 мл стандартного раствора глюкозы концентрации 10 ммоль/л. В другие - по 0,05 мл сыворотки крови, взятой по методу сахарной нагрузки. Растворы встряхивают и инкубируют при комнатной температуре 20 мин.

После инкубации измеряют оптическую плотность растворов на ФЭК при длине волны 490 нм. Кювета с длиной оптического пути, равной 5 мм. Раствор сравнения - рабочий реактив.

Расчет концентрации глюкозы:

С = 10 ммоль/л

где Е оп - оптическая плотность в образцах сыворотки;

Е ст - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы

Результат анализа:

График:

Вывод:

Дата: Подпись преподавателя:

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ

Контрольная работа3 Гормональная регуляция обмена веществ

Гидрофильные гормоны построены из аминокислот, или являются производными аминокислот. Они депонируются в больших количествах в клетках желез внутренней секреции и поступают в кровь по мере необходимости. Большинство этих веществ переносятся в кровотоке без участия переносчиков. Гидрофильные гормоны не способны проходить через липофильную клеточную мембрану, поэтому действуют на клетки-мишени за счет связывания с рецептором на плазматической мембране .

Рецепторы – это интегральные мембранные белки, которые связывают сигнальные вещества на внешней стороне мембраны и за счет изменения пространственной структуры генерируют новый сигнал на внутренней стороне мембраны.

Различают три типа рецепторов:

1. Рецепторы первого типа – это белки, которые имеют одну трансмембранную цепь. Активный центр этого аллостерического фермента (многие являются тирозиновыми протеинкиназами) расположен на внутренней стороне мембраны. При связывании гормона с рецептором происходит димеризация последнего с одновременной активизацией и фосфорилированием тирозина в рецепторе. С фосфотирозином связывается белок-переносчик сигнала, который передает сигнал внутриклеточным протеинкиназам.
2. Ионные каналы. Это мембранные белки, которые при связывании с лигандами оказываются открытыми для ионов Na + , K + или Cl + . Так действуют нейромедиаторы.
3. Рецепторы третьего типа , сопряжены с ГТФ-связывающими белками. Пептидная цепь этих рецепторов включает семь трансмембранных тяжей. Такие рецепторы передают сигнал с помощью ГТФ-связывающих белков (G-белок) на белки-эффекторы. Функция этих белков заключается в изменении концентрации вторичных мессенджеров (см. ниже).

Связывание гидрофильного гормона с мембранным рецептором влечет за собой один из трех вариантов внутриклеточного ответа: 1) рецепторные тирозинкиназы активируют внутриклеточные протеинкиназы, 2) активация ионных каналов ведет к изменению концентрации ионов, 3) активация рецепторов, сопряженных с ГТФ-связывающими белками, запускает синтез веществ-посредников, вторичных мессенджеров . Все три системы передачи гормонального сигнала взаимосвязаны.

Рассмотрим преобразование сигнала G-белками, поскольку этот процесс играет ключевую роль в механизме действия целого ряда гормонов . G-белки переносят сигнал с рецептора третьего типа на белки-эффекторы. Они состоят из трех субъединиц: α, β и g. α-субъединица может связывать гуаниновые нуклеотиды (ГТФ, ГДФ). В неактивном состоянии G-белок связан с ГДФ . При связывании гормона с рецептором, последний меняет свою конформацию таким образом, что может связать G-белок. Соединение G-белка с рецептором приводит к обмену ГДФ на ГТФ . При этом происходит активация G-белка, он отделяется от рецептора и диссоциирует на α-субъединицу и β, g-комплекс. ГТФ-α-субъединица связывается с белками-эффекторами и изменяет их активность, в результате чего происходит синтез вторичных посредников (мессенджеров): цАМФ, цГМФ, диацилглицерин (ДАГ), инозит-1,4,5-трифосфат (И-3-Ф) и др. Медленный гидролиз связанного ГТФ до ГДФ переводит α-субъединицу в неактивное состояние и она вновь ассоциируется с β, g-комплексом, т.е. G-белок возвращается в исходное состояние.

Вторичные мессенджеры , или посредники, это внутриклеточные вещества, концентрация которых строго контролируется гормонами, нейромедиаторами и другими внеклеточными сигналами. Наиболее важными вторичными мессенджерами являются цАМФ, цГМФ, диацилглицерин (ДАГ), инозит-1,4,5-трифосфат (И-3-Ф), монооксид азота.

Механизм действия цАМФ . цАМФ является аллостерическим эффектором протеинкиназ А (ПК-А) и ионных каналов. В неактивном состоянии ПК-А является тетрамером, две каталитические субъединицы (К-субъединицы) которого ингибированы регуляторными субъединицами (R-субъединицы). При связывании цАМф R-субъединицы диссоциируют из комплекса и К-субъединицы активируются.

Активный фермент может фосфорилировать определенные остатки серина и треонина в более чем 100 различных белках и факторах транскрипции. В результате фосфорилирования изменяется функциональная активность этих белков.

Если связать все воедино, то получается следующая схема аденилатциклазной системы:

Активация аденилатциклазной систтемы длится очень короткое время, потому что G-белок после связывания с аденилатциклазой начинает проявлять ГТФ-азную активность. После гидролиза ГТФ G-белок восстанавливает свою конформацию и перестает активировать аденилатциклазу. В результате прекращается реакция образования цАМФ.

Кроме участников аденилатциклазной системы в некоторых клетках-мишенях имеются белки-рецепторы, связанные с G-белками, которые приводят к торможению аденилатциклазы. При этом комплекс “GTP-G-белок” ингибирует аденилатциклазу.

Когда останавливается образование цАМФ, реакции фосфорилирования в клетке прекращаются не сразу: пока продолжают существовать молекулы цАМФ - будет продолжаться и процесс активации протеинкиназ. Для того, чтобы прекратить действие цАМФ, в клетках существует специальный фермент - фосфодиэстераза, который катализирует реакцию гидролиза 3",5"-цикло-АМФ до АМФ.

Некоторые вещества, обладающие ингибирующим действием на фосфодиэстеразу, (например, алкалоиды кофеин, теофиллин), способствуют сохранению и увеличению концентрации цикло-АМФ в клетке. Под действием этих веществ в организме продолжительность активации аденилатциклазной системы становится больше, то есть усиливается действие гормона.

Кроме аденилат-циклазной или гуанилатциклазной систем существует также механизм передачи информации внутри клетки-мишени с участием ионов кальция и инозитолтрифосфата.

Инозитолтрифосфат - это вещество, которое является производным сложного липида - инозитфосфатида. Оно образуется в результате действия специального фермента - фосфолипазы “С”, который активируется в результате конформационных изменений внутриклеточного домена мембранного белка-рецептора.

Этот фермент гидролизует фосфоэфирную связь в молекуле фосфатидил-инозитол-4,5-бисфосфата и в результате образуются диацилглицерин и инозитолтрифосфат.

Известно, что образование диацилглицерина и инозитолтрифосфата приводит к увеличению концентрации ионизированного кальция внутри клетки. Это приводит к активации многих кальций-зависимых белков внутри клетки, в том числе активируются различные протеинкиназы. И здесь, как и при активации аденилатциклазной системы, одной из стадий передачи сигнала внутри клетки является фосфорилирование белков, которое в приводит к физиологическому ответу клетки на действие гормона.

В работе фосфоинозитидного механизма передачи сигналов в клетке-мишени принимает участие специальный кальций-связывающий белок - кальмодулин. Это низкомолекулярный белок (17 кДа), на 30% состоящий из отрицательно заряженных аминокислот (Глу, Асп) и поэтому способный активно связывать Са +2 . Одна молекула кальмодулина имеет 4 кальций-связывающих участка. После взаимодействия с Са +2 происходят конформационные изменения молекулы кальмодулина и комплекс “Са +2 -кальмодулин” становится способным регулировать активность (аллостерически угнетать или активировать) многие ферменты - аденилатциклазу, фосфодиэстеразу, Са +2 ,Мg +2 -АТФазу и различные протеинкиназы.

В разных клетках при воздействии комплекса “Са +2 -кальмодулин” на изоферменты одного и того же фермента (например, на аденилатциклазу разного типа) в одних случаях наблюдается активация, а в других - ингибирование реакции образования цАМФ. Такие различные эффекты происходят потому, что аллостерические центры изоферментов могут включать в себя различные радикалы аминокислот и их реакция на действие комплекса Са +2 -кальмодулин будет отличаться.

Таким образом, в роли "вторых посредников" для передачи сигналов от гормонов в клетках-мишенях могут быть:

Циклические нуклеотиды (ц-АМФ и ц-ГМФ);

Ионы Са;

Комплекс “Са-кальмодулин”;

Диацилглицерин;

Инозитолтрифосфат

Механизмы передачи информации от гормонов внутри клеток-мишеней с помощью перечисленных посредников имеют общие черты:

1. одним из этапов передачи сигнала является фосфорилирование белков;

2. прекращение активации происходит в результате специальных механизмов, инициируемых самими участниками процессов, - существуют механизмы отрицательной обратной связи.

Гормоны являются основными гуморальными регуляторами физиологических функций организма, и в настоящее время хорошо известны их свойства, процессы биосинтеза и механизмы действия.