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Reazioni di agglutinazione basato sull'interazione di un reagente (anticorpi) con antigeni situati sulla superficie delle cellule o particelle estranee. Si formano così aggregati di grosse dimensioni, che precipitano e sono visibili anche ad occhio nudo. Pertanto, il gruppo sanguigno viene determinato in base al sistema ABO, alla presenza del fattore Rh in esso, ecc. Questo è un metodo diagnostico più sensibile rispetto alle reazioni di precipitazione, poiché il volume del sedimento (agglutinato) supera il volume del precipitato.

Emoagglutinazione diretta

Il test di emoagglutinazione diretta (RPHA) viene utilizzato per rilevare antigeni di superficie di microrganismi ed eritrociti, nonché anticorpi contro di essi.
Il materiale di prova (sangue) viene aggiunto a sieri standard contenenti anticorpi. La velocità della reazione di agglutinazione diretta è correlata alla quantità del materiale di prova, alla quantità e alla concentrazione del siero e alla temperatura ambiente.

Emoagglutinazione indiretta

La reazione di emoagglutinazione indiretta viene eseguita per rilevare gli anticorpi nel sangue del paziente utilizzando un diagnostico eritrocitario. Il reagente sono gli eritrociti, sulla cui superficie si trova un antigene (proteine ​​​​di microrganismi, tossine, allergeni, ecc.).
Il siero del sangue del paziente viene diluito con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, quindi viene aggiunto un diagnostico eritrocitario e il risultato viene monitorato. Questo metodo diagnostico altamente sensibile rileva gli antigeni anche a basse concentrazioni.

Reazione di emoagglutinazione (RGA).

In laboratorio vengono utilizzate due diverse reazioni di emoagglutinazione.

Il primo RGA si riferisce a sierologico. In questa reazione, gli eritrociti vengono agglutinati quando interagiscono con gli anticorpi corrispondenti (emoagglutinine). La reazione è ampiamente utilizzata per determinare i gruppi sanguigni.

Il secondo RHA non è sierologico. In esso, l'agglutinazione degli eritrociti non è causata

anticorpi, ma sostanze speciali formate da virus. Ad esempio, il virus dell'influenza agglutina gli eritrociti di pollo e porcellini d'India, virus della poliomielite - eritrociti di pecora. Questa reazione consente di giudicare la presenza di un particolare virus nel materiale di prova.

La reazione viene effettuata in provette o su piastre speciali con pozzetti. Il materiale da testare per la presenza del virus viene diluito con soluzione isotonica da 1:10 a 1:1280; 0,5 ml di ciascuna diluizione vengono miscelati con un volume uguale di sospensione di eritrociti all'1-2%. Nel controllo, 0,5 ml di eritrociti vengono miscelati con 0,5 ml di soluzione isotonica. Le provette vengono poste in un termostato per 30 minuti e le piastre vengono lasciate a temperatura ambiente per 45 minuti.

Contabilizzazione dei risultati. A un risultato positivo reazione sul fondo della provetta o pozzetto, cade un precipitato di eritrociti con bordi smerlati ("ombrello"), che ricopre l'intero fondo del pozzetto. A risultato negativo gli eritrociti formano un precipitato denso con bordi lisci ("bottone"). Lo stesso precipitato dovrebbe essere sotto controllo. L'intensità della reazione è espressa dai segni "+".

Reazione di emoagglutinazione

Il titolo del virus è la massima diluizione del materiale in cui si verifica l'agglutinazione.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione

Questa è una reazione sierologica in cui specifici anticorpi antivirali, interagendo con il virus (antigene), lo neutralizzano e lo privano della capacità di agglutinare i globuli rossi, cioè inibire la reazione di emoagglutinazione. Questa reazione consente di determinare il tipo e il tipo di virus.

Impostazione della reazione. 0,25 ml di siero antivirale vengono miscelati con un uguale volume di materiale contenente il virus. La miscela viene agitata e posta in termostato per 30 minuti, dopodiché si aggiungono 0,5 ml di sospensione di eritrociti all'1-2%.

Contabilizzazione dei risultati. Con la corretta impostazione dell'esperimento nel controllo del siero e degli eritrociti, dovrebbe formarsi un "pulsante" - non esiste alcun fattore che agglutina gli eritrociti; nel controllo dell'antigene si forma un "ombrello": il virus ha causato l'agglutinazione degli eritrociti. Se il siero è omologo al virus studiato, si forma un "bottone": il siero ha neutralizzato il virus.

Reazione di emoagglutinazione indiretta

La reazione dell'emoagglutinazione indiretta (passiva) (RIHA) si basa sul fatto che gli eritrociti, se un antigene solubile viene adsorbito sulla loro superficie, acquisiscono la capacità di agglutinare quando interagiscono con gli anticorpi contro l'antigene adsorbito.

Impostazione della reazione. Il siero viene riscaldato per 30 minuti a 56 ° C, diluito in sequenza in un rapporto di 1:10 - 1:1280 e versato in provette o pozzetti da 0,25 ml, dove vengono poi aggiunte 2 gocce di eritrociti con antigeni adsorbiti su di esse.

Controlli: una sospensione di eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi con siero evidentemente immune, una sospensione di eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi con siero normale; una sospensione di eritrociti normali con il siero testato. Nel primo controllo dovrebbe verificarsi agglutinazione, nel secondo e nel terzo no.

Domande di controllo.

1. Cosa indica un risultato RGA positivo tra gli eritrociti e il materiale testato per la presenza del virus?

2. Si verificherà una reazione di agglutinazione eritrocitaria se ad essi vengono aggiunti un virus e il siero corrispondente? Come si chiama la reazione che rivela questo fenomeno?

LAVORO PRATICO №12.

Reazione di legame del complemento.

La reazione di legame del complemento (RCT) si basa sul fatto che uno specifico complesso antigene-anticorpo adsorbe (lega) sempre il complemento su se stesso.

Questa reazione è ampiamente utilizzata nell'identificazione di antigeni e sierodiagnosi di infezioni, in particolare malattie causate da spirochete (reazione di Wassermann), rickettsie e virus.

La PCS è una reazione sierologica complessa. Coinvolge un complemento e due sistemi antigene-anticorpo. Essenzialmente, queste sono due reazioni sierologiche.

Il sistema di base destro è costituito da un antigene e un anticorpo (uno noto, l'altro no). Ad esso viene aggiunta una certa quantità di complemento. Se l'antigene e l'anticorpo di questo sistema corrispondono, si collegheranno e collegheranno un complimento. Il complesso risultante è finemente disperso e non è visibile.

La formazione di questo complesso è nota con l'aiuto di un secondo sistema emolitico o indicatore. Include eritrociti di pecora (antigene) e il loro corrispondente siero emolitico (anticorpo), cioè complesso immunitario già pronto. In questo sistema, la lisi degli eritrociti può avvenire solo in presenza del complemento. Se il complemento è vincolato dal primo sistema, allora non ci sarà emolisi nel secondo sistema; nessun complemento libero. L'assenza di emolisi (il contenuto della provetta è torbido o è presente un sedimento di eritrociti sul fondo della provetta) viene registrata come risultato positivo di RSK.

Se nel primo sistema l'antigene non corrisponde all'anticorpo, allora l'immunocomplesso non si forma e il complimento rimarrà libero. Rimanendo libero, il complimento partecipa al secondo sistema, provocando l'emolisi, il risultato di RSK è negativo (il contenuto delle provette è trasparente - "sangue laccato").

Componenti, reazioni di fissazione del complemento:

1. Antigene - di solito un lisato, estratto, aptene,

meno spesso una sospensione di microrganismi.

2. Anticorpo - siero del paziente.

3. Complemento - siero di cavia.

4. Antigene - eritrociti di pecora.

5. Anticorpo - emolisina agli eritrociti di pecora.

6. Soluzione isotonica.

In considerazione del fatto che la RSC partecipa un gran numero di componenti complessi,

devono essere pretitolati e portati nella reazione in quantità esatte e in volumi uguali: 0,5 o 0,25 ml, meno spesso 0,2, 1,25 o 1,0 ml (volumi maggiori danno un risultato più accurato). La titolazione dei componenti della reazione viene effettuata nello stesso volume dell'esperimento, sostituendo gli ingredienti mancanti con una soluzione isotonica.

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La reazione di emoagglutinazione indiretta o passiva (RNHA o RPHA) è più sensibile e specifica della reazione di agglutinazione. Questa reazione è anche usata in due modi.

1) Per rilevare gli anticorpi nel siero del sangue del paziente, vengono utilizzati i diagnostici eritrocitari, in cui l'antigene viene adsorbito sulla superficie degli eritrociti trattati con tannino. In relazione a questa reazione, il termine RPHA è più spesso utilizzato.

Il siero del test viene diluito nei pozzetti delle piastre di plastica e viene aggiunto il diagnostico eritrocitario. Con una reazione positiva lungo le pareti del foro appare un film sottile a forma di "ombrello di pizzo", con una reazione negativa appare un denso sedimento di eritrociti a forma di "bottone".

2) Per rilevare le tossine e gli antigeni batterici nel materiale in esame, vengono utilizzati diagnostici di anticorpi eritrocitari ottenuti mediante adsorbimento di anticorpi su eritrociti. In relazione a questa reazione, il termine RNGA è più spesso utilizzato. Ad esempio, con l'aiuto di diagnostici anticorpali, vengono rilevati l'antigene del bacillo della peste, l'esotossina della difterite, l'esotossina botulinica.

Cos'è un diagnostico eritrocitario? Cos'è un anticorpo eritrocitario diagnostico?

Gli eritrociti diagnostici sono eritrociti (trattati con tannino o formalina) con antigeni estratti da batteri adsorbiti su di essi e vengono utilizzati nella RPHA (reazione di emoagglutinazione passiva). Nel caso in cui RPGA venga utilizzato per rilevare un antigene nelle secrezioni di pazienti, nei tessuti, ecc., Vengono utilizzati "diagnostici anticorpali", ovvero eritrociti sensibilizzati con anticorpi.

Nell'RNGA, gli anticorpi del siero del sangue vengono rilevati utilizzando un diagnostico eritrocitario antigenico, ovvero eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi.

Tecnica di impostazione delle reazioni. Reazione di coagulazione.

- fissazione degli eritrociti con formaldeide o aldeidi glutariche o acriliche. Tali eritrociti elaborati vengono conservati a lungo. Più spesso vengono utilizzati a questo scopo eritrociti di pecore, umani, polli, ecc.;
— trattamento di erythrocytes fissi con soluzione tannica. Di conseguenza, gli eritrociti acquisiscono la proprietà di adsorbire irreversibilmente proteine ​​(virus e anticorpi) sulla loro superficie;
- sensibilizzazione di eritrociti abbronzati da parte di virus o anticorpi.

Reazione di coagulazione (RCA)

La reazione di coagglutinazione viene utilizzata per determinare gli antigeni utilizzando anticorpi adsorbiti sulla proteina A delle cellule di stafilococco (anticorpo diagnostico).
La proteina A ha un'affinità per il frammento Fc delle immunoglobuline; pertanto, tali batteri trattati con siero diagnostico immunitario adsorbono in modo non specifico gli anticorpi sierici, che interagiscono quindi con i centri attivi con i corrispondenti microbi isolati dai pazienti. Come risultato della coagglutinazione, si formano scaglie, costituite da stafilococchi, anticorpi sierici diagnostici e il microbo da determinare.

Sieri agglutinanti: cosa contengono; come si ottengono, a cosa servono; qual è il titolo del siero agglutinante?

Il siero agglutinante si ottiene immunizzando i conigli (per via endovenosa, sottocutanea o intraperitoneale) con una sospensione di batteri uccisi, partendo da una dose di 200 milioni, poi 500 milioni, 1 miliardo, 2 miliardi di corpi microbici in 1 ml, ad intervalli di 5 giorni. 7-8 giorni dopo l'ultima immunizzazione, viene prelevato il sangue e determinato il titolo anticorpale.

Il titolo di siero agglutinante è la massima diluizione del siero alla quale si verifica l'agglutinazione con il microrganismo corrispondente.

I sieri agglutinanti vengono utilizzati per l'identificazione di un microbo in una reazione di agglutinazione prolungata.

Reazione di emoagglutinazione (RHA)

Se il microrganismo in esame è agglutinato dal siero ad un titolo oa metà del valore del titolo, può essere considerato appartenente alla specie il cui nome è indicato sull'etichetta della fiala.

Quali sono le differenze tra i sieri agglutinanti polivalenti e monovalenti (monocettore); Perché l'immunizzazione di un coniglio con microbi di una specie produce un siero contenente anticorpi contro diversi antigeni?

Sieri monorecettori - sieri contenenti anticorpi contro un solo antigene e sieri polivalenti, che danno reazioni di agglutinazione con due o tre batteri correlati che hanno un antigene comune. I sieri agglutinanti vengono utilizzati per identificare i microrganismi nella reazione di agglutinazione. Lo svantaggio di tali sieri è che sono in grado di dare reazioni di agglutinazione di gruppo, tk. contengono anticorpi contro batteri che hanno antigeni comuni.

Reazione di emoagglutinazione. Descrizione e applicazione

Si basa sul fatto che gli eritrociti, sui quali sono preadsorbiti gli antigeni, acquisiscono la capacità di agglutinare in presenza di sieri omologhi (anticorpi).

In questo caso, gli eritrociti svolgono il ruolo di portatori con determinanti specifici, la cui agglutinazione si verifica a seguito della reazione antigene + anticorpo.

Gli eritrociti, alla cui superficie sono saldamente attaccati gli antigeni, sono chiamati erythrocyte antigenic diagnosticum, o eritrociti sensibilizzati dall'antigene.

Un altro tipo di RNHA - gli anticorpi vengono adsorbiti sulla superficie degli eritrociti e la loro successiva agglutinazione avviene in presenza di un antigene omologo. In questo caso, tali eritrociti sono chiamati diagnostici di anticorpi eritrocitari o eritrociti sensibilizzati da anticorpi.

Sulla base di questi due approcci metodologici fondamentali, sono state sviluppate e vengono utilizzate molte modifiche dell'RNGA. Quindi, piccole particelle standard di lattice vengono utilizzate come supporti. In questo caso, la reazione è chiamata reazione di agglutinazione al lattice (RLA) o viene utilizzata Staphylococcus aureus- reazione di coagulazione, ecc. Di solito, i diagnostici eritrocitari vengono preparati presso le imprese dell'industria biologica e l'esperienza principale di RNGA è già installata nei laboratori diagnostici.

La preparazione dei diagnostici eritrocitari comprende i seguenti passaggi:

• fissazione degli eritrociti con formaldeide o aldeidi glutariche o acriliche. Tali eritrociti elaborati vengono conservati a lungo. Più spesso vengono utilizzati a questo scopo eritrociti di pecore, umani, polli, ecc.;
• trattamento di eritrociti fissi con soluzione di tannino. Di conseguenza, gli eritrociti acquisiscono la proprietà di adsorbire irreversibilmente proteine ​​(virus e anticorpi) sulla loro superficie;
• sensibilizzazione degli eritrociti abbronzati da parte di virus o anticorpi.

Va notato che i metodi di preparazione dei diagnostici eritrocitari per infezione virale diverso.

La tecnica per impostare l'RNHA per rilevare e determinare il titolo anticorpale è la seguente:

• a diluizioni doppie consecutive del siero aggiungere dosi uguali di eritrociti sensibilizzati dall'antigene;
• la miscela viene lasciata per 2-3 ore a temperatura ambiente o per 16-18 ore a 4°C;
• tener conto dei risultati. Se il siero contiene anticorpi contro il virus con cui sono stati sensibilizzati gli eritrociti, si osserva l'emoagglutinazione, che viene valutata in croci.

Il titolo anticorpale del siero è considerato come la più alta diluizione del siero che fornisce ancora l'emoagglutinazione di almeno due incroci.

RNGA è accompagnato da tutti i controlli pertinenti. Di solito mettono la reazione con il micrometodo.

RNHA consente di risolvere i seguenti compiti diagnostici:

• rilevare gli anticorpi e determinarne il titolo nel siero del sangue utilizzando un noto diagnostico antigenico eritrocitario;
• rilevare e identificare un virus sconosciuto utilizzando un noto anticorpo diagnostico eritrocitario.

Vantaggi di RNGA: alta sensibilità, facilità di impostazione della tecnica e risposta rapida. Tuttavia, è importante notare che esistono grandi difficoltà nella preparazione di diagnostici eritrocitari stabili (grande dipendenza dalla purezza dei componenti utilizzati, necessità di selezionare la modalità di fissazione, tanizzazione e sensibilizzazione degli eritrociti per ogni tipo di virus) .

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reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAIT)

L'RGA si basa sulla capacità degli eritrociti di aderire quando determinati antigeni vengono adsorbiti su di essi. Come materiale di prova per l'emoagglutinazione vengono utilizzati liquido allantoico, liquido amniotico, sospensione di membrane corionallantoiche di embrioni di pollo, sospensioni ed estratti da colture o organi di animali infetti da virus, materiale infettivo nativo. RGA non è sierologico, poiché si verifica senza la partecipazione del siero immunitario e viene utilizzato per selezionare la diluizione di lavoro dell'antigene per impostare RTGA o la presenza di un antigene (virus) nel materiale di prova (ad esempio, con l'influenza). La reazione utilizza eritrociti di animali, uccelli, gruppo sanguigno umano I (0).

Per impostare un RGA approssimativo, una goccia di sospensione di eritrociti al 5% e una goccia del materiale di prova vengono applicate su un vetrino, mescolate accuratamente. Con un risultato positivo, dopo 1-2 minuti osservare macroscopicamente l'aspetto dell'agglutinazione flocculante degli eritrociti.

Per allestire RHA in fila espansa nei pozzetti di piastre di polistirene, si preparano diluizioni doppiamente crescenti del materiale in esame in una soluzione fisiologica in un volume di 0,5 ml. In tutte le provette contribuiscono 0,5 ml di 0,25 - 1% di sospensione di eritrociti. I risultati vengono presi in considerazione dopo la completa sedimentazione degli eritrociti nel controllo (eritrociti + soluzione fisiologica). La reazione è presa in considerazione dalla natura del sedimento eritrocitario. In casi positivi, il grado di agglutinazione è contrassegnato da più. Quattro vantaggi valutano la reazione, che ha la forma di un sottile film di eritrociti incollati che copre il fondo della provetta (ombrello), la reazione con lacune nel film è contrassegnata da tre vantaggi, la presenza di un film con bordi di pizzo smerlati di eritrociti incollati è indicato da due più, un sedimento traballante di eritrociti circondato da una zona di grumi agglutinati eritrociti corrisponde a uno più. Un sedimento eritrocitario nettamente definito, indistinguibile dal controllo, mostra l'assenza di agglutinazione. Il titolo è considerato la diluizione limitante del materiale di prova, che ha causato l'agglutinazione degli eritrociti di due plus.

Con un risultato positivo di RHA, lo studio viene continuato, determinando il tipo di virus isolato utilizzando il test di inibizione dell'emoagglutinazione con sieri tipo-specifici.

RTGA si basa sulla proprietà dell'antisiero di sopprimere l'emoagglutinazione virale, poiché il virus neutralizzato da anticorpi specifici perde la sua capacità di agglutinare i globuli rossi. Per la tipizzazione approssimativa dei virus, viene utilizzato il metodo della caduta su vetro. Per la determinazione finale dell'affiliazione tipo del virus isolato e la titolazione degli anticorpi nei sieri, un RTHA espanso viene posto in provette o in pozzetti. A tale scopo, si preparano diluizioni doppie di sieri in soluzione fisiologica e si versano in 0,25 ml. Una goccia del materiale contenente il virus e una goccia di sospensione di eritrociti all'1% vengono aggiunte alle diluizioni del siero.

Quando si utilizza RTGA per determinare il tipo di virus, vengono utilizzati sieri specifici del tipo, che vengono aggiunti a un volume uguale della diluizione di lavoro dell'antigene. L'affiliazione tipo del virus isolato è determinata dal siero immunitario specifico, che ha mostrato il più alto titolo di anticorpi contro questo virus.

RGA e RTGA sono ampiamente utilizzati per diagnosticare le infezioni virali ( encefalite da zecche, influenza, ecc.) al fine di rilevare anticorpi specifici e identificare molti virus in base ai loro antigeni.

Reazione di immunofluorescenza (RIF)

RIF si basa sulla combinazione di antigeni di batteri, rickettsie e virus con anticorpi specifici marcati con coloranti fluorescenti (isotiocianato di fluoresceina, rodamina, B-isotiocianite, lissatinarodamina B-200, sulfocloruro, ecc.) aventi gruppi reattivi (sulfocloruro, isotiocianite, ecc.) .) . Questi gruppi si combinano con i gruppi amminici liberi delle molecole anticorpali, che non perdono la loro affinità specifica per l'antigene corrispondente se trattate con un fluorocromo. I complessi AG-AT risultanti diventano strutture chiaramente visibili e luminose sotto un microscopio a fluorescenza (Fig. 48). RIF può rilevare piccole quantità di antigeni batterici e virali. Il metodo RIF è utilizzato in due versioni: metodo diretto e metodo indiretto.

Il metodo diretto si basa sull'associazione diretta di un antigene con un anticorpo marcato. metodo indiretto– sulla rilevazione fase per fase del complesso AG-AT utilizzando coloranti fluorescenti. Il primo stadio consiste nella formazione di immunocomplessi di un certo antigene con anticorpi specifici. La seconda fase consiste nell'identificare questo complesso trattandolo con antigammaglobulina marcata.

Il vantaggio di RIF è la semplicità, l'elevata sensibilità, la velocità di ottenimento del risultato. Il RIF è utilizzato come metodo per la diagnosi rapida precoce di influenza, dissenteria, malaria, peste, tularemia, sifilide, ecc. Per condurre tale studio viene utilizzato un microscopio luminescente.

Dosaggio radioimmunologico (RIA)

RIA è uno dei metodi più sensibili di immunodiagnostica. Viene utilizzato per rilevare l'antigene del virus dell'epatite B, nei pazienti Epatite virale. Per fare questo, il siero di riferimento (siero contenente anticorpi contro il virus dell'epatite B) viene aggiunto al siero di prova. La miscela viene incubata per 1-2 giorni alla temperatura di 40°C, quindi viene aggiunto un antigene di riferimento (un antigene marcato con l'isotopo 125 J) e l'incubazione viene proseguita per altre 24 ore. Le antiimmunoglobuline che precipitano contro le proteine ​​sieriche di riferimento vengono aggiunte al risultante complesso antigene-anticorpo, che porta alla formazione di un precipitato (Fig. 49). Il risultato viene preso in considerazione dalla presenza e dal numero di impulsi nel precipitato registrati dal contatore. Se nel siero in esame è presente un antigene legato ad anticorpi specifici, questi ultimi non si legano all'antigene marcato e, pertanto, non viene rilevato nel precipitato. Pertanto, RIA si basa sul principio dell'interazione competitiva dell'antigene determinato e di una quantità nota di antigene marcato con i centri attivi degli anticorpi.

Metodo ELISA (ELISA)

Il metodo viene utilizzato per rilevare gli antigeni utilizzando i corrispondenti anticorpi coniugati con un enzima di marcatura (perossidasi di rafano, b-galattosio o fosfatasi alcalina). Dopo che l'antigene è stato combinato con il siero immunitario marcato con l'enzima, il substrato e il cromogeno vengono aggiunti alla miscela. . Il substrato viene scisso dall'enzima e i suoi prodotti di degradazione causano la modificazione chimica del cromogeno. In questo caso, il cromogeno cambia colore: l'intensità del colore è direttamente proporzionale al numero di molecole di antigene e anticorpo legate (Fig. 50).

Il più comune è l'ELISA in fase solida, in cui uno dei componenti della risposta immunitaria (antigene o anticorpo) viene adsorbito su un supporto solido. Come supporto solido vengono utilizzati micropannelli di polistirene. Quando si determinano gli anticorpi, il siero del sangue dei pazienti, il siero dell'antiglobulina marcato con un enzima e una miscela di soluzioni del substrato per l'enzima e il cromogeno vengono aggiunti in sequenza ai pozzetti con l'antigene adsorbito. Ogni volta dopo l'aggiunta del componente successivo, i reagenti non legati vengono rimossi dai pozzetti mediante lavaggio accurato. Con un risultato positivo, il colore della soluzione cromogena cambia.

Un vettore in fase solida può essere sensibilizzato non solo con un antigene, ma anche con un anticorpo. Quindi, l'antigene desiderato viene introdotto nei pozzetti con anticorpi adsorbiti, viene aggiunto il siero immune contro l'antigene marcato con l'enzima, e quindi viene aggiunta la miscela di soluzioni di substrato per l'enzima e il cromogeno.

ELISA è utilizzato per diagnosticare malattie causate da agenti patogeni virali e batterici.

SEZIONE VII. BASI DI VIROLOGIA

L'RGA si basa sulla capacità degli eritrociti di aderire quando determinati antigeni vengono adsorbiti su di essi. Come materiale di prova per l'emoagglutinazione vengono utilizzati liquido allantoico, liquido amniotico, sospensione di membrane corionallantoiche di embrioni di pollo, sospensioni ed estratti da colture o organi di animali infetti da virus, materiale infettivo nativo. RGA non è sierologico, poiché si verifica senza la partecipazione del siero immunitario e viene utilizzato per selezionare la diluizione di lavoro dell'antigene per impostare RTGA o la presenza di un antigene (virus) nel materiale di prova (ad esempio, con l'influenza). La reazione utilizza eritrociti di animali, uccelli, gruppo sanguigno umano I (0).

Per impostare un RGA approssimativo, una goccia di sospensione di eritrociti al 5% e una goccia del materiale di prova vengono applicate su un vetrino, mescolate accuratamente. Con un risultato positivo, dopo 1-2 minuti osservare macroscopicamente l'aspetto dell'agglutinazione flocculante degli eritrociti.

Per allestire RHA in fila espansa nei pozzetti di piastre di polistirene, si preparano diluizioni doppiamente crescenti del materiale in esame in una soluzione fisiologica in un volume di 0,5 ml. In tutte le provette contribuiscono 0,5 ml di 0,25 - 1% di sospensione di eritrociti. I risultati vengono presi in considerazione dopo la completa sedimentazione degli eritrociti nel controllo (eritrociti + soluzione fisiologica). La reazione è presa in considerazione dalla natura del sedimento eritrocitario. In casi positivi, il grado di agglutinazione è contrassegnato da più. Quattro vantaggi valutano la reazione, che ha la forma di un sottile film di eritrociti incollati che copre il fondo della provetta (ombrello), la reazione con lacune nel film è contrassegnata da tre vantaggi, la presenza di un film con bordi di pizzo smerlati di eritrociti incollati è indicato da due più, un sedimento traballante di eritrociti circondato da una zona di grumi agglutinati eritrociti corrisponde a uno più. Un sedimento eritrocitario nettamente definito, indistinguibile dal controllo, mostra l'assenza di agglutinazione. Il titolo è considerato la diluizione limitante del materiale di prova, che ha causato l'agglutinazione degli eritrociti di due plus.

Con un risultato positivo di RHA, lo studio viene continuato, determinando il tipo di virus isolato utilizzando il test di inibizione dell'emoagglutinazione con sieri tipo-specifici.

RTGA si basa sulla proprietà dell'antisiero di sopprimere l'emoagglutinazione virale, poiché il virus neutralizzato da anticorpi specifici perde la sua capacità di agglutinare i globuli rossi. Per la tipizzazione approssimativa dei virus, viene utilizzato il metodo della caduta su vetro. Per la determinazione finale dell'affiliazione tipo del virus isolato e la titolazione degli anticorpi nei sieri, un RTHA espanso viene posto in provette o in pozzetti. A tale scopo, si preparano diluizioni doppie di sieri in soluzione fisiologica e si versano in 0,25 ml. Una goccia del materiale contenente il virus e una goccia di sospensione di eritrociti all'1% vengono aggiunte alle diluizioni del siero.

Quando si utilizza RTGA per determinare il tipo di virus, vengono utilizzati sieri specifici del tipo, che vengono aggiunti a un volume uguale della diluizione di lavoro dell'antigene. L'affiliazione tipo del virus isolato è determinata dal siero immunitario specifico, che ha mostrato il più alto titolo di anticorpi contro questo virus.

RGA e RTGA sono ampiamente utilizzati per diagnosticare le infezioni virali (encefalite da zecche, influenza, ecc.) al fine di rilevare anticorpi specifici e identificare molti virus dai loro antigeni.

Reazione di emoagglutinazione (RHA)

RGA si basa sul fatto che alcuni tipi di batteri e virus hanno la capacità di adsorbire sulla superficie dei globuli rossi. tipi diversi animali (e uccelli), facendoli aderire tra loro e formare agglutinati (RGA diretto).

L'adsorbimento di un antigene (batteri, virus) sulla superficie degli eritrociti non si manifesta sempre con la formazione di un precipitato visibile; inoltre, l'RGA non è specifico, poiché gli eritrociti della stessa specie animale possono adsorbire antigeni diversi.

La reazione di emoagglutinazione passiva (indiretta) (RPHA) è specifica. Per la sua impostazione viene preliminarmente preparato un erythrocyte diagnosticum (eritrociti sui quali viene adsorbito l'antigene). A tale scopo, il sangue di montone (o gallo) viene prelevato sterile, defibrinato e lavato più volte in una soluzione tampone fosfato (pH 7,2) mediante centrifugazione 3-5 volte. Il surnatante viene rimosso, la concentrazione di eritrociti viene regolata al 2,5% (1:40). Ad una sospensione di eritrociti al 2,5% viene aggiunta in un volume uguale (1 ml o 0,5 ml) una sospensione di batteri delle specie microbiche studiate ad una concentrazione di 5-10 miliardi di cellule per 1 ml. Gli eritrociti adsorbono facilmente l'antigene di natura polisaccaridica. Per adsorbire l'antigene di natura proteica, gli eritrociti vengono pretrattati con tannino alla diluizione 1:20000.Gli eritrociti in combinazione con l'antigene aggiunto vengono lasciati per sensibilizzazione (adsorbimento) per 2 ore in termostato (37°C) , quindi nuovamente centrifugato a 3-4 mila rpm/min per 5 min con soluzione tampone fosfato (Fig. 9.13).

Il diagnostico eritrocitario risultante viene posto in provette (o pozzetti in una tavola di plexiglass) e ad esso viene aggiunto siero immunitario standard.

In casi positivi, si verificherà RGA - la perdita di eritrociti sotto forma di un caratteristico sedimento traballante o granulare distribuito su tutta la superficie del fondo della provetta (emoagglutinato). Ciò significa che il tipo di microbo (antigene) in esame è specifico per gli anticorpi dell'immunosiero. In casi negativi, i globuli rossi non incollati si depositeranno sul fondo sotto forma di un piccolo cerchio uniforme.

Per una maggiore affidabilità dei risultati di RPGA, ritardare la reazione(frenata) fenomeno dell'emoagglutinazione(RZGA) o sua modifica - reazione di neutralizzazione degli anticorpi(RIA).

Riso. 9.13. Reazione di emoagglutinazione passiva (schema): Er - eritrociti: AG - antigene: AT - anticorpo

L'essenza della RZGA consiste nel fatto che la reazione di agglutinazione viene impostata con un siero diagnostico specifico e l'antigene testato (il tipo di microbo studiato viene utilizzato come antigene). Questa miscela viene mantenuta per 1-2 ore a 37°C, quindi vengono aggiunti gli eritrociti. Se l'antigene del test è omologo agli anticorpi sierici diagnostici, interagiscono tra loro e gli eritrociti aggiunti non agglutinano - il risultato della reazione è positivo. Se l'antigene del test non è omologo agli anticorpi sierici o non è contenuto nel materiale, gli eritrociti aggiunti assorbono l'antigene e si verifica l'RHA - il risultato dell'RHA è negativo, il tipo di microbo (antigene) testato non è stabilito.

Metodo di impostazione PH Aè che prendono in volumi uguali e mescolano il siero immunitario diagnostico con varie diluizioni del materiale di prova (l'antigene desiderato), lo lasciano a contatto per 1-2 ore, quindi aggiungono eritrociti sensibilizzati con un certo antigene (noto) specifico per il siero anticorpi (diagnostica eritrocitaria). Quando l'antigene desiderato reagisce con gli anticorpi sierici, questi vengono neutralizzati e gli eritrociti aggiunti non si agglutinano, non si verifica RHA - il risultato PHA è positivo. Se il materiale del test non contiene un antigene specifico per gli anticorpi del siero utilizzato, non ci sarà neutralizzazione degli anticorpi. Pertanto, quando viene aggiunto un diagnostico eritrocitario, appare l'agglutinazione eritrocitaria (emoagglutinazione) e il risultato di RHA è negativo. Il test di neutralizzazione degli anticorpi è un metodo altamente sensibile per rilevare l'antigene non solo in una sospensione di batteri vivi (o uccisi), ma anche in una sospensione di tessuto macinato. vari corpi, segreti ed escrezioni nativi e accesi di un organismo malato.

Reazione di Vidal. Dalla seconda settimana della malattia, gli anticorpi contro l'agente infettivo si accumulano nel sangue dei pazienti. Per identificarli, il siero del sangue del paziente viene esaminato nella reazione di agglutinazione. Le colture di Salmonella uccise - diagnosticums - sono utilizzate come antigene.

Per impostare la reazione di Vidal vengono utilizzati il ​​siero del paziente, un set di kit diagnostici e una soluzione isotonica di cloruro di sodio.

Il sangue (2-3 ml) dalla polpa del dito o dalla vena cubitale viene raccolto in una provetta sterile e consegnato al laboratorio. In laboratorio, la provetta viene posta in un termostato per 20-30 minuti per formare un coagulo, quindi il coagulo viene cerchiato con una pipetta Pasteur per separarlo dalla parete della provetta e posto al freddo per 30- 40 minuti. Il siero separato viene aspirato e utilizzato per avviare una reazione di agglutinazione con diagnostici di salmonella tifoide e paratifoide. Per ottenere il siero, il sangue può essere centrifugato.

Quando si verifica un processo infettivo - febbre tifoide o febbre paratifoide - nel corpo vengono prodotti anticorpi O e H contro gli antigeni patogeni con lo stesso nome.

Gli anticorpi O compaiono per primi e scompaiono piuttosto rapidamente. Gli anticorpi H persistono a lungo. La stessa cosa accade con la vaccinazione, quindi reazione positiva Vidal con antigeni O e H indica la presenza di una malattia e una reazione solo con antigeni H può essere sia in coloro che sono stati malati (reazione anamnestica) sia in coloro che sono stati vaccinati (vaccinazione). Sulla base di ciò, la reazione di Vidal viene posizionata separatamente con gli antigeni O e H (diagnosticum).

Dal momento che clinicamente tifo e paratifo A e B sono simili, quindi per identificare la natura della malattia, il siero del paziente viene testato contemporaneamente ai diagnostici di Salmonella tifoide e paratifo A e B.

La reazione di Vidal è molto utilizzata perché è semplice e non richiede particolari condizioni.

Ci sono due modi per impostare la reazione: goccia e volume (vedi Capitolo 12). In pratica, il metodo volumetrico è più spesso utilizzato. Quando si imposta una reazione di agglutinazione lineare, il numero di righe deve corrispondere al numero di antigeni (diagnosticum). L'agente eziologico della malattia è considerato un microrganismo, il cui diagnostico è stato agglutinato dal siero del paziente. A volte si nota l'agglutinazione di gruppo, poiché gli agenti causali della febbre tifoide e paratifoide hanno antigeni di gruppo comuni. In questo caso, il risultato della reazione nella serie in cui si nota l'agglutinazione in una maggiore diluizione del siero è considerato positivo (Tabella 36).

Tabella 36. Possibile risultato della reazione di agglutinazione

Nota. In pratica, la reazione di Vidal è associata a quattro diagnostici: febbre tifoide "O" e "H" e paratifo A e B - con diagnostici "OH".

Se l'agglutinazione si verifica solo in piccole diluizioni di siero - 1:100, 1:200, quindi per distinguere la reazione in caso di malattia da una vaccinazione o da un anamnestico, ricorrono alla riorganizzazione della reazione di agglutinazione dopo 5-7 giorni. In un paziente, il titolo anticorpale aumenta, ma in un paziente vaccinato o guarito non cambia. Pertanto, un aumento del titolo di anticorpi nel siero del sangue funge da indicatore della malattia.

Le Vi-agglutinine compaiono nel sangue del paziente in risposta all'introduzione nel corpo di patogeni tifoidi che possiedono l'antigene Vi. Sono determinati dalla 2a settimana di malattia, ma il loro titolo di solito non supera 1:10. La rilevazione di Vi-anticorpi è associata alla presenza di agenti patogeni tifoidi nel corpo, pertanto la determinazione di questi anticorpi è di grande importanza epidemiologica, poiché consente di identificare i portatori batterici.

Reazione di vi-emoagglutinazione. Questa è la reazione più sensibile per rilevare gli anticorpi.

Il principio della reazione è che gli eritrociti umani (gruppo I) o di pecora, dopo un trattamento speciale, possono adsorbire l'antigene Vi sulla loro superficie e acquisire la capacità di agglutinare con i corrispondenti anticorpi Vi.

Gli eritrociti con antigeni adsorbiti sulla superficie sono chiamati diagnostici eritrocitari.

Per impostare la reazione Vi-emoagglutinazione, prendere:

1) siero del sangue del paziente (1-2 ml); 2) eritrociti Salmonella Vi diagnosticum; H) Vi-siero; 4) O-siero; 5) soluzione isotonica di cloruro di sodio.

La reazione viene posta in provette di agglutinazione o in piastre di plastica con pozzetti.

Il sangue viene prelevato dal paziente allo stesso modo della reazione di Vidal. Prendi il siero. Dal siero vengono preparate diluizioni seriali doppie, a partire da 1:10 fino a 1:160.

0,5 ml di ciascuna diluizione vengono aggiunti al pozzetto e 0,25 ml di erythrocyte diagnosticum. La reazione viene posta in un volume di 0,75 ml.

I controlli sono: 1) siero monorecettore agglutinante standard + diagnosticum - la reazione deve essere positiva fino al titolo sierico; 2) diagnosticum in soluzione isotonica di cloruro di sodio (controllo) - la reazione deve essere negativa.

Il contenuto dei pozzetti viene accuratamente miscelato, posto in un termostato per 2 ore e lasciato a temperatura ambiente fino al giorno successivo (per 18-24 ore).

La contabilità inizia con il controllo. La reazione viene valutata in base al grado di agglutinazione diagnostica.

I risultati sono presi in considerazione secondo il sistema a quattro croci:

Gli eritrociti sono completamente agglutinati - sedimento sul fondo del foro a forma di "ombrello";

+++ "l'ombrello" è più piccolo, non tutti gli eritrociti sono stati agglutinati;

++ "ombrello" è piccolo, sul fondo del foro c'è un sedimento di eritrociti non agglutinati;

La reazione è negativa; gli eritrociti non si sono agglutinati e si sono depositati sul fondo del pozzetto sotto forma di un bottone.

Domande di controllo

1. In quale periodo della malattia viene diagnosticata la reazione di Vidal?

2. Quali ingredienti sono necessari per eseguire la reazione di Vidal?

3. Quali diagnostici sono usati per la reazione di Vidal?

4. Quale delle reazioni sierologiche è la più sensibile nella diagnosi delle infezioni da tifo e paratifo?

5. Quale diagnostico viene utilizzato nella formulazione della reazione di Vi-emoagglutinazione?

6. Quale siero viene utilizzato per determinare la presenza dell'antigene Vi nella coltura studiata?

7. Qual è il significato della definizione del tipo Vi-phage?

Prendere dall'insegnante O- e H-diagnosticum da salmonella tifoide, paratifo A e paratifo B e siero del paziente. Metti la reazione di Vidal.

Mezzi nutritivi

Ambienti EMS, Ploskirev, agar bismuto-solfito sono prodotti dall'industria medica sotto forma di polvere secca. Si preparano secondo le istruzioni riportate in etichetta: si pesa una certa quantità di polvere, si versa la giusta quantità di acqua, si fa bollire e si versa in piastre di Petri sterili.

Mercoledì Russell. In 950 ml di acqua distillata aggiungere 40 g di terreno nutritivo secco e aggiungere 5 g di agar nutriente. Riscaldare per far bollire e sciogliere le polveri. Sciogliere 1 g x in 50 ml di acqua distillata. ore di glucosio e aggiunto alla miscela preparata. Il mezzo viene versato in provette sterili da 5-7 ml, sterilizzate con vapore scorrevole (2 giorni per 2 minuti) e smussate in modo che rimanga una colonna. Allo stesso modo si prepara il terreno di Russell con mannitolo e saccarosio.

L'ambiente di Olkenitsky da agar secco. 2,5 g di agar nutriente secco vengono sciolti in 100 ml di acqua distillata. Tutti gli ingredienti indicati nella ricetta (etichetta) vengono aggiunti all'agar raffreddato a 50 ° C. Il mezzo versato nelle provette viene sterilizzato con flusso di vapore (3 giorni per 20 minuti) e poi smussato. Il mezzo finito dovrebbe essere di un colore rosa pallido.