Reaktsioon hemaglutinatsioonile. Kõhutüüfuse vereanalüüs Vi antigeeniga. Kasutamine hemadsorptsioonireaktsiooni viroloogias

Avaleht → Analüüsid → Immunoloogiline meetod → Hemaglutinatsioonireaktsioonid (immunoloogiline meetod)

Aglutinatsioonireaktsioonid mis põhineb reagendi (antikehade) vastasmõjul rakkude või võõrosakeste pinnal paiknevate antigeenidega. Selle tulemusena moodustuvad suuremõõtmelised agregaadid, mis sadestuvad ja on nähtavad isegi palja silmaga. Seega määratakse veregrupp vastavalt ABO süsteemile, Rh faktori olemasolule selles jne. See on sademereaktsioonidega võrreldes tundlikum diagnostiline meetod, kuna sette (aglutinaadi) maht ületab sademe mahu.

Otsene hemaglutinatsioon

Otsese hemaglutinatsiooni testi (RPHA) kasutatakse mikroorganismide ja erütrotsüütide pinnaantigeenide ning nende vastaste antikehade tuvastamiseks.
Uuritav materjal (veri) lisatakse antikehi sisaldavatele standardseerumitele. Otsese aglutinatsioonireaktsiooni kiirus on seotud uuritava materjali koguse, seerumi koguse ja kontsentratsiooniga ning ümbritseva keskkonna temperatuuriga.

Kaudne hemaglutinatsioon

Kaudse hemaglutinatsiooni reaktsioon viiakse läbi antikehade tuvastamiseks patsiendi veres erütrotsüütide diagnostika abil. Reagendiks on erütrotsüüdid, mille pinnal paikneb antigeen (mikroorganismide valgud, toksiinid, allergeenid jne).
Patsiendi vereseerum lahjendatakse 0,9% naatriumkloriidi lahusega, seejärel lisatakse erütrotsüütide diagnostika ja jälgitakse tulemust. See ülitundlik diagnostiline meetod tuvastab antigeenid isegi madalatel kontsentratsioonidel.

Hemaglutinatsioonireaktsioon (RGA).

Laboris kasutatakse kahte erinevat hemaglutinatsioonireaktsiooni.

Esimene RGA viitab seroloogilisele. Selles reaktsioonis aglutineeritakse erütrotsüüdid, kui nad suhtlevad vastavate antikehadega (hemaglutiniinidega). Reaktsiooni kasutatakse laialdaselt veregruppide määramiseks.

Teine RHA ei ole seroloogiline. Selles ei põhjustata erütrotsüütide aglutinatsiooni

antikehad, vaid viiruste poolt moodustatud spetsiaalsed ained. Näiteks gripiviirus aglutineerib kana erütrotsüüte ja merisead, poliomüeliidi viirus - lamba erütrotsüüdid. See reaktsioon võimaldab hinnata konkreetse viiruse olemasolu uuritavas materjalis.

Reaktsioon viiakse läbi katseklaasides või spetsiaalsetel süvenditega plaatidel. Viiruse esinemise suhtes testitavat materjali lahjendatakse isotoonilise lahusega vahekorras 1:10 kuni 1:1280; 0,5 ml igat lahjendust segatakse võrdse koguse 1-2% erütrotsüütide suspensiooniga. Kontrollis segatakse 0,5 ml erütrotsüüte 0,5 ml isotoonilise lahusega. Katseklaasid asetatakse 30 minutiks termostaadi ja plaadid jäetakse 45 minutiks toatemperatuurile.

Tulemuste arvestus. Kell positiivne tulemus Katseklaasi või kaevu põhjas langeb erütrotsüütide sade (“vihmavari”), mis katab kogu kaevu põhja. Kell negatiivne tulemus erütrotsüüdid moodustavad siledate servadega tiheda sademe ("nupp"). Sama sade peaks olema kontrolli all. Reaktsiooni intensiivsust väljendavad "+" märgid.

Hemaglutinatsiooni reaktsioon

Viiruse tiiter on materjali maksimaalne lahjendus, milles toimub aglutinatsioon.

Hemaglutinatsiooni pärssimise reaktsioon

See on seroloogiline reaktsioon, mille käigus spetsiifilised viirusevastased antikehad, interakteerudes viirusega (antigeeniga), neutraliseerivad selle ja võtavad sellelt võime aglutineerida punaseid vereliblesid, st inhibeerida hemaglutinatsioonireaktsiooni. See reaktsioon võimaldab teil määrata viiruste tüübi ja tüübi.

Reaktsiooni seadistus. 0,25 ml viirusevastast seerumit segatakse võrdse koguse viirust sisaldava materjaliga. Segu loksutatakse ja asetatakse 30 minutiks termostaadi, misjärel lisatakse 0,5 ml 1-2% erütrotsüütide suspensiooni.

Tulemuste arvestus. Seerumi ja erütrotsüütide kontrolli eksperimendi õige seadistuse korral peaks moodustuma "nupp" - erütrotsüüte aglutineerivat tegurit pole; antigeenikontrollis moodustub "vihmavari" - viirus põhjustas erütrotsüütide aglutinatsiooni. Kui seerum on uuritava viirusega homoloogne, tekib "nupp" – seerum on viiruse neutraliseerinud.

Kaudne hemaglutinatsiooni reaktsioon

Kaudse (passiivse) hemaglutinatsiooni (RIHA) reaktsioon põhineb asjaolul, et erütrotsüüdid, kui nende pinnale adsorbeerub lahustuv antigeen, omandavad võime aglutineerida interakteerudes adsorbeerunud antigeeni vastaste antikehadega.

Reaktsiooni seadistus. Seerumit kuumutatakse 30 minutit temperatuuril 56 °C, lahjendatakse järjestikku vahekorras 1:10–1:1280 ja valatakse 0,25 ml katseklaasidesse või süvenditesse, kuhu seejärel lisatakse 2 tilka erütrotsüüte, millele on adsorbeeritud antigeenid.

Juhtelemendid: erütrotsüütide suspensioon neile adsorbeeritud antigeenidega ilmselgelt immuunseerumiga, erütrotsüütide suspensioon neile adsorbeeritud antigeenidega tavalise seerumiga; normaalsete erütrotsüütide suspensioon koos testitud seerumiga. Esimeses kontrollis peaks toimuma aglutinatsioon, teises ja kolmandas mitte.

Testi küsimused.

1. Mida näitab positiivne RGA tulemus erütrotsüütide ja viiruse olemasolu suhtes testitud materjali vahel?

2. Kas viiruse ja sellele vastava seerumi lisamisel tekib erütrotsüütide aglutinatsioonireaktsioon? Mis on reaktsiooni nimi, mis seda nähtust paljastab?

PRAKTILINE TÖÖ №12.

Komplemendi sidumisreaktsioon.

Komplemendi sidumisreaktsioon (RCT) põhineb asjaolul, et spetsiifiline antigeen-antikeha kompleks adsorbeerib (seondab) alati enda külge.

Seda reaktsiooni kasutatakse laialdaselt antigeenide tuvastamisel ja infektsioonide, eriti spiroheetide (Wassermanni reaktsioon), riketsia ja viiruste põhjustatud haiguste serodiagnostikas.

PCS on keeruline seroloogiline reaktsioon. See hõlmab komplementi ja kahte antigeen-antikeha süsteemi. Põhimõtteliselt on need kaks seroloogilist reaktsiooni.

Parempoolne põhisüsteem koosneb antigeenist ja antikehast (üks on teada, teine mitte). Sellele lisatakse teatud kogus komplementi. Kui selle süsteemi antigeen ja antikeha kattuvad, loovad nad ühenduse ja seovad komplimendi. Saadud kompleks on peeneks hajutatud ja pole nähtav.

Selle kompleksi moodustumine on teada teise hemolüütilise või indikaatorsüsteemi abil. Siia kuuluvad lamba erütrotsüüdid (antigeen) ja neile vastav hemolüütiline seerum (antikeha), st. valmis immuunkompleks. Selles süsteemis võib erütrotsüütide lüüs toimuda ainult komplemendi juuresolekul. Kui komplement on seotud esimese süsteemiga, siis teises süsteemis hemolüüsi ei toimu; tasuta täiendust pole. RSK positiivse tulemusena registreeritakse hemolüüsi puudumine (sondi sisu on hägune või toru põhjas on erütrotsüütide sete).

Kui esimeses süsteemis ei vasta antigeen antikehale, siis immuunkompleks ei moodustu ja kompliment jääb vabaks. Vabaks jäädes osaleb kompliment teises süsteemis, põhjustades hemolüüsi, RSK tulemus on negatiivne (torude sisu on läbipaistev - "lakiveri").

Komponendid, komplemendi sidumise reaktsioonid:

1. Antigeen – tavaliselt lüsaat, ekstrakt, hapteen,

harvemini mikroorganismide suspensioon.

2. Antikeha – patsiendi seerum.

3. Komplement - merisea seerum.

4. Antigeen – lamba erütrotsüüdid.

5. Antikeha – hemolüsiin lamba erütrotsüütidele.

6. Isotooniline lahus.

Arvestades asjaolu, et RSC osaleb suur hulk keerulised komponendid,

need tuleb eelnevalt tiitrida ja reaktsioonisegusse võtta täpsetes kogustes ja võrdsetes kogustes: 0,5 või 0,25 ml, harvemini 0,2, 1,25 või 1,0 ml (suuremad kogused annavad täpsema tulemuse). Reaktsioonikomponentide tiitrimine viiakse läbi katsega samas mahus, asendades puuduvad koostisosad isotoonilise lahusega.

Seotud Informatsioon:

Saidi otsing:

Kaudse või passiivse hemaglutinatsiooni reaktsioon (RNHA või RPHA) on tundlikum ja spetsiifilisem kui aglutinatsioonireaktsioon. Seda reaktsiooni kasutatakse ka kahes suunas.

1) Patsiendi vereseerumis antikehade tuvastamiseks kasutatakse erütrotsüütide diagnostikaid, milles antigeen adsorbeeritakse tanniiniga töödeldud erütrotsüütide pinnale. Selle reaktsiooniga seoses kasutatakse sagedamini terminit RPHA.

Testseerum lahjendatakse plastplaatide süvendites ja lisatakse erütrotsüütide diagnostika. Positiivse reaktsiooni korral ilmub augu seintele õhuke kile "pitsi vihmavarju" kujul, negatiivse reaktsiooni korral ilmub tihe erütrotsüütide sete "nupu" kujul.

2) Toksiinide ja bakteriaalsete antigeenide tuvastamiseks uuritavas materjalis kasutatakse erütrotsüütidele antikehade adsorptsioonil saadud antikehade erütrotsüütide diagnostikaid. Selle reaktsiooniga seoses kasutatakse sagedamini terminit RNGA. Näiteks tuvastatakse antikehadiagnostika abil katkubatsilli antigeen, difteeria eksotoksiin, botuliini eksotoksiin.

Mis on erütrotsüütide diagnostika? Mis on antikehade erütrotsüütide diagnostika?

Erütrotsüütide diagnostika on erütrotsüüdid (töödeldud tanniini või formaliiniga), millele on adsorbeerunud bakteritest ekstraheeritud antigeenid ja mida kasutatakse RPHA-s (passiivne hemaglutinatsioonireaktsioon). Juhul, kui RPGA-d kasutatakse antigeeni tuvastamiseks patsientide eritistes, kudedes jne, kasutatakse "antikehade diagnostikat", st antikehadega sensibiliseeritud erütrotsüüte.

RNGA puhul tuvastatakse vereseerumi antikehad antigeense erütrotsüütide diagnostika abil, milleks on erütrotsüüdid, millele on adsorbeerunud antigeenid.

Reaktsioonide seadmise tehnika. Koaglutinatsiooni reaktsioon.

- erütrotsüütide fikseerimine formaldehüüdi või glutaar- või akrüülaldehüüdidega. Selliseid töödeldud erütrotsüüte säilitatakse pikka aega. Sagedamini kasutatakse selleks lammaste, inimeste, kanade jne erütrotsüüte;
— fikseeritud erütrotsüütide töötlemine tanniinilahusega. Selle tulemusena omandavad erütrotsüüdid omaduse oma pinnale pöördumatult adsorbeerida valke (viiruseid ja antikehi);
- taniseeritud erütrotsüütide sensibiliseerimine viiruste või antikehade poolt.

Koaglutinatsioonireaktsioon (RCA)

Koaglutinatsioonireaktsiooni kasutatakse antigeenide määramiseks, kasutades stafülokokirakkude A-valgule adsorbeeritud antikehi (antibody diagnosticum).
A-valgul on afiinsus immunoglobuliinide Fc-fragmendi suhtes; seetõttu adsorbeerivad sellised immuundiagnostilise seerumiga töödeldud bakterid mittespetsiifiliselt seerumi antikehi, mis seejärel interakteeruvad aktiivsete keskustega patsientidest eraldatud vastavate mikroobidega. Koaglutinatsiooni tulemusena tekivad helbed, mis koosnevad stafülokokkidest, diagnostilistest seerumi antikehadest ja määratavast mikroobist.

Aglutineerivad seerumid: mida need sisaldavad; kuidas neid saadakse, milleks neid kasutatakse; mis on aglutineeriva seerumi tiiter?

Aglutineeriv seerum saadakse küülikute immuniseerimisel (intravenoosselt, subkutaanselt või intraperitoneaalselt) tapetud bakterite suspensiooniga, alustades doosiga 200 miljonit, seejärel 500 miljonit, 1 miljard, 2 miljardit mikroobikeha 1 ml-s, 5-päevaste intervallidega. 7-8 päeva pärast viimast immuniseerimist võetakse veri ja määratakse antikehade tiiter.

Aglutineeriva seerumi tiiter on seerumi maksimaalne lahjendus, mille juures toimub aglutinatsioon vastava mikroorganismiga.

Aglutineerivaid seerumeid kasutatakse mikroobide tuvastamiseks pikendatud aglutinatsioonireaktsioonis.

Hemaglutinatsiooni reaktsioon (RHA)

Kui uuritav mikroorganism aglutineeritakse seerumi toimel tiitri või poole tiitri väärtuseni, võib seda lugeda kuuluvaks liigiks, mille nimi on märgitud ampulli etiketile.

Mille poolest erinevad polüvalentsed ja monovalentsed (monoretseptorid) aglutineerivad seerumid? Miks tekib küüliku immuniseerimisel ühe liigi mikroobidega seerum, mis sisaldab mitme antigeeni vastaseid antikehi?

Monoretseptori seerumid - seerumid, mis sisaldavad ainult ühe antigeeni vastaseid antikehi, ja polüvalentsed seerumid, mis annavad aglutinatsioonireaktsiooni kahe või kolme sarnase bakteriga, millel on ühine antigeen. Aglutineerivaid seerumeid kasutatakse aglutinatsioonireaktsiooni mikroorganismide tuvastamiseks. Selliste seerumite puuduseks on see, et nad on võimelised andma rühma aglutinatsioonireaktsioone, tk. need sisaldavad antikehi bakterite vastu, millel on ühised antigeenid.

Hemaglutinatsiooni reaktsioon. Kirjeldus ja rakendus

See põhineb asjaolul, et erütrotsüüdid, millele antigeenid on eelnevalt adsorbeerunud, omandavad aglutineerumisvõime homoloogsete seerumite (antikehade) juuresolekul.

Sel juhul mängivad erütrotsüüdid spetsiifiliste determinantidega kandjate rolli, mille aglutinatsioon toimub antigeen + antikeha reaktsiooni tulemusena.

Erütrotsüüte, mille pinnale on antigeenid kindlalt kinnitatud, nimetatakse erütrotsüütide antigeenseks diagnostikaks ehk antigeeniga sensibiliseeritud erütrotsüütideks.

Teist tüüpi RNHA - antikehad adsorbeeritakse erütrotsüütide pinnale ja nende järgnev aglutinatsioon toimub homoloogse antigeeni juuresolekul. Sel juhul nimetatakse selliseid erütrotsüüte erythrocyte antibody diagnosticum ehk antikehade poolt sensibiliseeritud erütrotsüütideks.

Nende kahe fundamentaalse metodoloogilise lähenemisviisi põhjal on välja töötatud ja kasutusel on palju RNGA modifikatsioone. Niisiis kasutatakse kandjatena väikseid standardseid lateksiosakesi. Sel juhul nimetatakse reaktsiooni lateksi aglutinatsioonireaktsiooniks (RLA) või kasutatakse seda Staphylococcus aureus- koagulatsioonireaktsioon jne. Tavaliselt valmistatakse erütrotsüütide diagnostikaid bioloogilise tööstuse ettevõtetes ja RNGA põhikogemus on juba paigaldatud diagnostikalaboritesse.

Erütrotsüütide diagnostika ettevalmistamine hõlmab järgmisi samme:

erütrotsüütide fikseerimine formaldehüüdi või glutaar- või akrüülaldehüüdidega. Selliseid töödeldud erütrotsüüte säilitatakse pikka aega. Sagedamini kasutatakse selleks lammaste, inimeste, kanade jne erütrotsüüte;
fikseeritud erütrotsüütide töötlemine tanniinilahusega. Selle tulemusena omandavad erütrotsüüdid omaduse oma pinnale pöördumatult adsorbeerida valke (viiruseid ja antikehi);
taniseeritud erütrotsüütide sensibiliseerimine viiruste või antikehade poolt.

Tuleb märkida, et erütrotsüütide diagnostika valmistamise meetodid viirusnakkused erinev.

RNHA seadistamise tehnika antikehade tiitri tuvastamiseks ja määramiseks on järgmine:

seerumi järjestikustele 2-kordsetele lahjendustele lisatakse võrdsed annused antigeeniga sensibiliseeritud erütrotsüüte;
segu jäetakse 2-3 tunniks toatemperatuurile või 16-18 tunniks 4 °C juurde;
tulemusi arvesse võtma. Kui seerum sisaldab viiruse antikehi, millega erütrotsüüdid sensibiliseeriti, täheldatakse hemaglutinatsiooni, mida hinnatakse ristamise teel.

Seerumi antikehade tiiter loetakse seerumi kõrgeimaks lahjendiks, mis tagab siiski hemaglutinatsiooni vähemalt kahe ristamisega.

RNGA-ga on kaasas kõik asjakohased juhtnupud. Tavaliselt rakendavad nad reaktsiooni mikromeetodil.

RNHA võimaldab lahendada järgmisi diagnostilisi ülesandeid:

tuvastada antikehi ja määrata nende tiiter vereseerumis, kasutades teadaolevat erütrotsüütide antigeenset diagnostikat;
tuvastada ja tuvastada tundmatu viirus, kasutades teadaolevat erütrotsüütide antikehade diagnostikat.

RNGA eelised: kõrge tundlikkus, seadistustehnika lihtsus ja kiire reageerimine. Siiski on oluline märkida, et stabiilsete erütrotsüütide diagnostiliste materjalide ettevalmistamisel on suuri raskusi (suur sõltuvus kasutatavate komponentide puhtusest, vajadus valida erütrotsüütide fikseerimise, taniseerimise ja sensibiliseerimise viis iga viirusetüübi jaoks) .

Kui leiate vea, valige tekstiosa ja vajutage Ctrl+Enter.

Kokkupuutel

hemaglutinatsiooni pärssimise reaktsioon (HAIT)

RGA põhineb erütrotsüütide võimel kleepuda kokku, kui neile adsorbeeritakse teatud antigeene. Hemaglutinatsiooni katsematerjalina kasutatakse allantoisi, amnionivedelikku, kanaembrüote koorionallantoisi membraanide suspensioone, viirustega nakatunud loomade kultuuride või elundite suspensioone ja ekstrakte, natiivset nakkuslikku materjali. RGA ei ole seroloogiline, kuna see toimub ilma immuunseerumi osaluseta ja seda kasutatakse antigeeni töölahjenduse valimiseks RTGA määramiseks või antigeeni (viiruse) olemasolu uuritavas materjalis (näiteks gripi korral). Reaktsioonis kasutatakse loomade, lindude erütrotsüüte, inimese I (0) veregruppi.

Ligikaudse RGA seadistamiseks kantakse alusklaasile tilk 5% erütrotsüütide suspensiooni ja tilk uuritavat materjali, mis segatakse põhjalikult. Positiivse tulemuse korral jälgige 1-2 minuti pärast makroskoopiliselt erütrotsüütide flokulentse aglutinatsiooni ilmnemist.

RHA seadistamiseks laiendatud reas polüstüreenplaatide süvendites valmistatakse uuritava materjali kahekordselt suurenevad lahjendused füsioloogilises lahuses mahus 0,5 ml. Kõigisse katsutitesse lisage 0,5 ml 0,25–1% erütrotsüütide suspensiooni. Tulemusi võetakse arvesse pärast erütrotsüütide täielikku settimist kontrollrühmas (erütrotsüüdid + soolalahus). Reaktsiooni võetakse arvesse erütrotsüütide sette olemuse järgi. Positiivsetel juhtudel märgitakse aglutinatsiooni aste plussidega. Katseklaasi (vihmavarju) põhja katva õhukese liimitud erütrotsüütide kile kujulist reaktsiooni hindavad neli plussi, kiles olevate tühikutega reaktsioon on märgitud kolme plussiga, pitsiliste servadega kile olemasolu. liimitud erütrotsüütidest on tähistatud kahe plussiga, ühele plussile vastab erütrotsüütide helbeline sete, mida ümbritseb erütrotsüütide aglutineerunud tükkide tsoon. Teravalt piiritletud erütrotsüütide sete, mida ei saa eristada kontrollist, näitab aglutinatsiooni puudumist. Tiitriks on võetud uuritava materjali piirav lahjendus, mis põhjustas erütrotsüütide aglutinatsiooni kahe plussi võrra.

RHA positiivse tulemuse korral jätkatakse uuringut, määrates isoleeritud viiruse tüübi, kasutades hemaglutinatsiooni inhibeerimise testi tüübispetsiifiliste seerumitega.

RTGA põhineb antiseerumi omadusel pärssida viiruse hemaglutinatsiooni, kuna spetsiifiliste antikehadega neutraliseeritud viirus kaotab võime aglutineerida punaseid vereliblesid. Viiruste ligikaudseks tüpiseerimiseks kasutatakse klaasile langetamise meetodit. Eraldatud viiruse tüübilise kuuluvuse lõplikuks määramiseks ja antikehade tiitrimiseks seerumites asetatakse laiendatud RTHA katseklaasidesse või süvenditesse. Sel eesmärgil valmistatakse füsioloogilises soolalahuses kahekordsed seerumilahjendused ja valatakse 0,25 ml-sse. Seerumi lahjendustele lisatakse üks tilk viirust sisaldavat materjali ja üks tilk 1% erütrotsüütide suspensiooni.

Viiruse tüübi määramiseks RTGA kasutamisel kasutatakse tüübispetsiifilisi seerumeid, mis lisatakse võrdsele mahule antigeeni töölahjendusele. Eraldatud viiruse tüüpiline kuuluvus määratakse spetsiifilise immuunseerumi järgi, mis näitas selle viiruse vastaste antikehade kõrgeimat tiitrit.

RGA-d ja RTGA-d kasutatakse laialdaselt viirusnakkuste diagnoosimiseks ( puukentsefaliit, gripp jne), et tuvastada spetsiifilisi antikehi ja tuvastada paljusid viirusi nende antigeenide järgi.

Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF)

RIF põhineb bakterite, riketsia ja viiruste antigeenide kombinatsioonil spetsiifiliste antikehadega, mis on märgistatud fluorestseeruvate värvainetega (fluorestseiini isotiotsüanaat, rodamiin, B-isotiotsüaniit, lüssatiinrodamiini B-200, sulfokloriid jne), millel on reaktiivsed rühmad (sulfokloriidtsüaan, isotiokloriid jne). .) . Need rühmad ühinevad antikehamolekulide vabade aminorühmadega, mis ei kaota fluorokroomiga töötlemisel oma spetsiifilist afiinsust vastava antigeeni suhtes. Saadud AG-AT kompleksid muutuvad fluorestsentsmikroskoobi all selgelt nähtavateks, eredalt helendavateks struktuurideks (joonis 48). RIF suudab tuvastada väikeses koguses bakteriaalseid ja viiruslikke antigeene. RIF-meetodit kasutatakse kahes versioonis: otsene ja kaudne meetod.

Otsene meetod põhineb antigeeni otsesel seostamisel märgistatud antikehaga. kaudne meetod– AG-AT kompleksi järkjärguline tuvastamine fluorestsentsvärvide abil. Esimene etapp seisneb teatud antigeeni immuunkomplekside moodustamises spetsiifiliste antikehadega. Teine etapp on selle kompleksi tuvastamine, töödeldes seda märgistatud antigammaglobuliiniga.

RIF-i eeliseks on lihtsus, kõrge tundlikkus, tulemuse saamise kiirus. RIF-i kasutatakse gripi, düsenteeria, malaaria, katku, tulareemia, süüfilise jne varajase diagnoosimise meetodina. Sellise uuringu läbiviimiseks kasutatakse luminestsentsmikroskoopi.

Radioimmunoanalüüs (RIA)

RIA on üks tundlikumaid immuundiagnostika meetodeid. Seda kasutatakse B-hepatiidi viiruse antigeeni tuvastamiseks patsientidel viiruslik hepatiit. Selleks lisatakse uuritavale seerumile võrdlusseerum (seerum, mis sisaldab B-hepatiidi viiruse antikehi). Segu inkubeeritakse 1-2 päeva temperatuuril 40 0 C, seejärel lisatakse võrdlusantigeen (125 J isotoobiga märgistatud antigeen) ja inkubeerimist jätkatakse veel 24 tundi. Saadud antigeeni-antikeha kompleksile lisatakse sadestavad antiimmunoglobuliinid võrdlusseerumi valkude vastu, mis viib sademe moodustumiseni (joonis 49). Tulemust võetakse arvesse loenduri poolt registreeritud impulsside olemasolu ja arvu põhjal. Kui testitavas seerumis on spetsiifiliste antikehadega seotud antigeen, siis viimane ei seondu märgistatud antigeeniga ja seetõttu ei tuvastata seda sades. Seega põhineb RIA määratud antigeeni ja teadaoleva koguse märgistatud antigeeni konkureeriva interaktsiooni põhimõttel antikehade aktiivsete keskustega.

ELISA meetod (ELISA)

Meetodit kasutatakse antigeenide tuvastamiseks, kasutades neile vastavaid antikehi, mis on konjugeeritud märgistusensüümiga (mädarõika peroksidaas, b-galaktoos või aluseline fosfataas). Pärast antigeeni kombineerimist ensüümiga märgistatud immuunseerumiga lisatakse segule substraat ja kromogeen. . Ensüüm lõhustab substraati ja selle lagunemissaadused põhjustavad kromogeeni keemilise modifitseerimise. Sellisel juhul muudab kromogeen oma värvi – värvi intensiivsus on otseselt võrdeline seotud antigeeni ja antikeha molekulide arvuga (joon. 50).

Kõige tavalisem on tahke faasi ELISA, mille käigus üks immuunvastuse komponentidest (antigeen või antikeha) adsorbeeritakse tahkele kandjale. Tahke kandjana kasutatakse polüstüreenist mikropaneele. Antikehade määramisel lisatakse adsorbeeritud antigeeniga süvenditesse järjestikku patsientide vereseerum, ensüümiga märgistatud antiglobuliini seerum ning ensüümi substraadi ja kromogeeni lahuste segu. Iga kord pärast järgmise komponendi lisamist eemaldatakse sidumata reaktiivid süvenditest põhjaliku pesemisega. Positiivse tulemuse korral muutub kromogeenilahuse värvus.

Tahkefaasilist kandjat saab sensibiliseerida mitte ainult antigeeniga, vaid ka antikehaga. Seejärel sisestatakse soovitud antigeen adsorbeeritud antikehadega süvenditesse, lisatakse ensüümiga märgistatud antigeeni vastane immuunseerum ning seejärel ensüümi ja kromogeeni substraadi lahuste segu.

ELISA-t kasutatakse viiruslike ja bakteriaalsete patogeenide põhjustatud haiguste diagnoosimiseks.

VII JAGU. VIROLOOGIA ALUSED

RHA positiivse tulemuse korral jätkatakse uuringut, määrates isoleeritud viiruse tüübi, kasutades hemaglutinatsiooni inhibeerimise testi tüübispetsiifiliste seerumitega.

RGA-d ja RTGA-d kasutatakse laialdaselt viirusnakkuste (puukentsefaliit, gripp jne) diagnoosimiseks, et tuvastada spetsiifilisi antikehi ja tuvastada paljusid viirusi nende antigeenide järgi.

Hemaglutinatsiooni reaktsioon (RHA)

RGA põhineb asjaolul, et teatud tüüpi bakteritel ja viirustel on võime adsorbeeruda punaste vereliblede pinnal. erinevad tüübid loomad (ja linnud), põhjustades nende kokkukleepumist ja aglutinaadi moodustumist (otsene RGA).

Antigeeni (bakterid, viirused) adsorptsioon erütrotsüütide pinnal ei väljendu alati nähtava sademe moodustumisega; lisaks on RGA mittespetsiifiline, kuna sama loomaliigi erütrotsüüdid võivad adsorbeerida erinevaid antigeene.

Passiivse (kaudse) hemaglutinatsiooni (RPHA) reaktsioon on spetsiifiline. Selle seadistamiseks valmistatakse eelnevalt ette erütrotsüütide diagnostika (erütrotsüüdid, millele antigeen adsorbeeritakse). Sel eesmärgil võetakse steriilselt jäära (või kuke) veri, defibrineeritakse ja pestakse mitu korda fosfaatpuhverlahuses (pH 7,2), kasutades 3-5-kordset tsentrifuugimist. Supernatant eemaldatakse, erütrotsüütide kontsentratsioon reguleeritakse 2,5% (1:40). 2,5% erütrotsüütide suspensioonile lisatakse võrdses mahus (1 ml või 0,5 ml) uuritud mikroobiliikide bakterite suspensiooni kontsentratsiooniga 5-10 miljardit rakku 1 ml kohta. Erütrotsüüdid adsorbeerivad kergesti polüsahhariidset antigeeni. Valgulise antigeeni adsorbeerimiseks töödeldakse erütrotsüüte eelnevalt tanniiniga lahjenduses 1:20 000. Erütrotsüüdid koos lisatud antigeeniga jäetakse 2 tunniks termostaadis (37 °C) sensibiliseerimiseks (adsorptsiooniks) , seejärel tsentrifuugiti uuesti kiirusel 3-4 tuhat p/min 5 minutit fosfaatpuhverlahusega (joonis 9.13).

Saadud erütrotsüütide diagnostika asetatakse katseklaasidesse (või pleksiklaasplaadi süvenditesse) ja sellele lisatakse standardset immuunseerumit.

Positiivsetel juhtudel ilmneb RGA - erütrotsüütide kadu iseloomuliku helbelise või granuleeritud sette kujul, mis jaotub kogu katseklaasi põhja pinnale (hemaglutinaat). See tähendab, et uuritava mikroobi (antigeeni) tüüp on spetsiifiline immunoseeriumi antikehade suhtes. Negatiivsetel juhtudel settivad liimimata punased verelibled väikese ühtlase ringi kujul põhja.

RPGA tulemuste suurema usaldusväärsuse tagamiseks viivitada reaktsiooni(pidurdamine) hemaglutinatsiooni nähtus(RZGA) või selle modifikatsioon - antikehade neutraliseerimise reaktsioon(RIA).

Riis. 9.13. Passiivne hemaglutinatsiooni reaktsioon (skeem): Er - erütrotsüüdid: AG - antigeen: AT - antikeha

RZGA olemus seisneb selles, et aglutinatsioonireaktsioon seadistatakse spetsiifilise diagnostilise seerumi ja testitava antigeeniga (antigeenina kasutatakse uuritavat tüüpi mikroobi). Seda segu hoitakse 1-2 tundi temperatuuril 37 °C, seejärel lisatakse erütrotsüüdid. Kui uuritav antigeen on diagnostiliste seerumi antikehadega homoloogne, interakteeruvad need omavahel ja lisatud erütrotsüüdid ei aglutineerita – reaktsiooni tulemus on positiivne. Kui uuritav antigeen ei ole homoloogne seerumi antikehadega või ei sisaldu materjalis, siis lisatud erütrotsüüdid adsorbeerivad antigeeni ja tekib RHA - RHA tulemus on negatiivne, uuritava mikroobi (antigeeni) tüüp ei ole kindlaks tehtud.

PH A seadmise meetod on see, et nad võtavad võrdsetes kogustes ja segavad diagnostilist immuunseerumit uuritava materjali erinevate lahjendustega (soovitav antigeen), jätavad 1-2 tunniks kokku puutuma, seejärel lisavad teatud (teadaoleva) seerumile spetsiifilise antigeeniga sensibiliseeritud erütrotsüüdid. antikehad (erütrotsüütide diagnostika). Kui soovitud antigeen reageerib seerumi antikehadega, need neutraliseeritakse ja lisatud erütrotsüüdid ei aglutineerita, RHA-d ei teki – PHA tulemus on positiivne. Kui uuritav materjal ei sisalda kasutatud seerumi antikehade suhtes spetsiifilist antigeeni, siis antikehade neutraliseerimist ei toimu. Seetõttu ilmneb erütrotsüütide diagnostika lisamisel erütrotsüütide aglutinatsioon (hemaglutinatsioon) ja RHA tulemus on negatiivne. Antikehade neutraliseerimise test on väga tundlik meetod antigeeni tuvastamiseks mitte ainult elusate (või tapetud) bakterite suspensioonis, vaid ka jahvatatud koe suspensioonis. erinevaid kehasid, haige organismi põlis- ja kuumutatud saladused ja väljaheited.

Vidali reaktsioon. Alates haiguse teisest nädalast kogunevad patsientide verre nakkustekitaja vastased antikehad. Nende tuvastamiseks uuritakse aglutinatsioonireaktsioonis patsiendi vereseerumit. Antigeenina kasutatakse tapetud salmonella kultuure – diagnostilisi aineid.

Vidali reaktsiooni seadistamiseks kasutatakse patsiendi seerumit, diagnostiliste komplektide komplekti ja isotoonilist naatriumkloriidi lahust.

Veri (2-3 ml) sõrme või kubitaalveeni pulbist kogutakse steriilsesse katsutisse ja toimetatakse laborisse. Laboris asetatakse katseklaas 20-30 minutiks termostaadi, et moodustuks tromb, seejärel ringletakse tromb Pasteuri pipetiga, et eraldada see katseklaasi seinast ja asetatakse 30-ks külma. 40 minutit. Eraldatud seerum imetakse ära ja kasutatakse salmonella tüüfuse ja paratüüfuse diagnostiliste ainetega aglutinatsioonireaktsiooni tekitamiseks. Seerumi saamiseks võib verd tsentrifuugida.

Nakkusliku protsessi – kõhutüüfus või paratüüfus – ilmnemisel tekivad organismis O- ja H-antikehad samanimeliste patogeeni antigeenide vastu.

O-antikehad tekivad kõigepealt ja kaovad üsna kiiresti. H-antikehad püsivad pikka aega. Sama asi juhtub ka vaktsineerimisega, nii et positiivne reaktsioon O- ja H-antigeenidega Vidal viitab haiguse esinemisele ning reaktsioon ainult H-antigeenidega võib olla nii haigetel (anamnestiline reaktsioon) kui ka vaktsineeritutel (vaktsineerimine). Sellest lähtuvalt paigutatakse Vidali reaktsioon eraldi O- ja H-antigeenidega (diagnostika).

Kuna kliiniliselt kõhutüüfus ja paratüüfus A ja B on sarnased, siis haiguse olemuse kindlakstegemiseks testitakse patsiendi seerumit samaaegselt Salmonella tüüfuse ja paratüüfuse A ja B diagnostiliste materjalidega.

Vidali reaktsiooni kasutatakse laialdaselt, kuna see on lihtne ega vaja eritingimusi.

Reaktsiooni seadistamiseks on kaks võimalust: tilk ja maht (vt 12. peatükk). Praktikas kasutatakse sagedamini mahulist meetodit. Lineaarse aglutinatsioonireaktsiooni seadistamisel peaks ridade arv vastama antigeenide arvule (diagnosticum). Haiguse tekitajaks peetakse mikroorganismi, mille diagnostiline aine aglutineeriti patsiendi seerumiga. Mõnikord täheldatakse rühma aglutinatsiooni, kuna kõhutüüfuse ja paratüüfuse põhjustajatel on ühised rühma antigeenid. Sel juhul loetakse positiivseks reaktsiooni tulemus seerias, milles täheldati aglutinatsiooni suuremas seerumi lahjenduses (tabel 36).

Tabel 36. Aglutinatsioonireaktsiooni võimalik tulemus

Märge. Praktikas kasutatakse Vidali reaktsiooni nelja diagnostilise ainega: kõhutüüfus "O" ja "H" ning paratüüfus A ja B - diagnostiliste ainete "OH".

Kui aglutinatsioon toimub ainult seerumi väikestes lahjendustes - 1:100, 1:200, siis selleks, et eristada haiguse korral reaktsiooni vaktsineerimisest või anamneesist, kasutavad nad aglutinatsioonireaktsiooni uuesti 5–7 päeva pärast. Patsiendil antikehade tiiter tõuseb, kuid vaktsineeritud või paranenud patsiendil see ei muutu. Seega on antikehade tiitri tõus vereseerumis haiguse näitajaks.

Vi-aglutiniinid ilmuvad patsiendi verre vastusena Vi-antigeeni sisaldavate tüüfuse patogeenide sisenemisele kehasse. Neid määratakse alates 2. haigusnädalast, kuid nende tiiter ei ületa tavaliselt 1:10. Vi-antikehade tuvastamine on seotud kõhutüüfuse patogeenide esinemisega organismis, seetõttu on nende antikehade määramisel suur epidemioloogiline tähtsus, kuna see võimaldab tuvastada bakterikandjaid.

Vi-hemaglutinatsiooni reaktsioon. See on kõige tundlikum reaktsioon antikehade tuvastamiseks.

Reaktsiooni põhimõte seisneb selles, et inimese (I rühm) või lamba erütrotsüüdid suudavad pärast eritöötlust oma pinnale adsorbeerida Vi-antigeeni ja omandada võime aglutineerida vastavate Vi-antikehadega.

Pinnale adsorbeerunud antigeenidega erütrotsüüte nimetatakse erütrotsüütide diagnostikaks.

Vi-hemaglutinatsioonireaktsiooni seadistamiseks toimige järgmiselt.

1) patsiendi vereseerum (1-2 ml); 2) erütrotsüüt Salmonella Vi diagnosticum; H) Vi-seerum; 4) O-seerum; 5) isotooniline naatriumkloriidi lahus.

Reaktsioon asetatakse aglutinatsioonikatseklaasidesse või süvenditega plastplaatidesse.

Patsiendilt võetakse verd samamoodi nagu Vidali reaktsiooni puhul. Hankige seerum. Seerumist valmistatakse kahekordsed seerialahjendused, alates 1:10 kuni 1:160.

Igast lahjendusest lisatakse süvendisse 0,5 ml ja 0,25 ml erütrotsüütide diagnostilist lahust. Reaktsioonisegu valatakse mahuga 0,75 ml.

Kontrollideks on: 1) standardne aglutineeriv monoretseptori seerum + diagnosticum - reaktsioon peab olema positiivne kuni seerumi tiitrini; 2) diagnosticum isotoonilises naatriumkloriidi lahuses (kontroll) - reaktsioon peaks olema negatiivne.

Kaevude sisu segatakse põhjalikult, asetatakse 2 tunniks termostaadi ja jäetakse järgmise päevani (18-24 tunniks) toatemperatuurile.

Raamatupidamine algab kontrollist. Reaktsiooni hinnatakse sõltuvalt diagnostilise aglutinatsiooni astmest.

Tulemusi võetakse arvesse nelja risti süsteemi järgi:

Erütrotsüüdid on täielikult aglutineerunud - sete augu põhjas "vihmavarju" kujul;

+++ "vihmavari" on väiksem, kõik erütrotsüüdid ei aglutineerunud;

++ "vihmavari" on väike, augu põhjas on aglutineerimata erütrotsüütide sete;

Reaktsioon on negatiivne; erütrotsüüdid ei aglutineerunud ja settisid nupu kujul kaevu põhja.

testi küsimused

1. Millises haigusperioodis diagnoositakse Vidali reaktsioon?

2. Milliseid koostisosi on vaja Vidali reaktsiooni läbiviimiseks?

3. Milliseid diagnostilisi vahendeid kasutatakse Vidali reaktsiooni jaoks?

4. Milline seroloogilistest reaktsioonidest on tüüfuse ja paratüüfuse infektsioonide diagnoosimisel kõige tundlikum?

5. Millist diagnostikat kasutatakse Vi-hemaglutinatsioonireaktsiooni formuleerimisel?

6. Millise seerumiga määratakse Vi-antigeeni olemasolu uuritavas kultuuris?

7. Mis tähtsus on Vi-faagi tüübi määratlusel?

Võtta õpetajalt O- ja H-diagnostika salmonella tüüfusest, paratüüfusest A ja paratüüfusest B ning patsiendi seerum. Pane Vidali reaktsioon.

Toiteainekeskkond

Keskkonnad EMS, Ploskirev, vismut-sulfit agarit toodab meditsiinitööstus kuivpulbri kujul. Need valmistatakse etiketil oleva juhendi järgi: kaalutakse teatud kogus pulbrit, valatakse vastav kogus vett, keedetakse ja valatakse steriilsetesse Petri tassidesse.

Kolmapäev Russell. 950 ml destilleeritud vette lisatakse 40 g kuiva toitainekeskkonda ja 5 g toiteagarit. Kuumuta keemiseni ja lahusta pulbrid. Lahustage 1 g x 50 ml destilleeritud vees. tundi glükoosi ja lisatakse valmistatud segule. Sööde valatakse steriilsetesse 5–7 ml katseklaasidesse, steriliseeritakse voolava auruga (2 päeva 2 minutit) ja kallutatakse nii, et kolonn jääb alles. Russelli sööde mannitooli ja sahharoosiga valmistatakse samal viisil.

Olkenitski sööde kuivast agarist. 2,5 g kuiva toitaineagarit sulatatakse 100 ml destilleeritud vees. Kõik retseptis (sildil) märgitud koostisosad lisatakse temperatuurini 50 °C jahutatud agarile. Katseklaasidesse valatud sööde steriliseeritakse voolava auruga (3 päeva 20 minutit) ja seejärel kaldstatakse. Valmis sööde peaks olema kahvaturoosa värvi.