واکنش هماگلوتیناسیون vi. آزمایش خون برای تب تیفوئید با آنتی ژن Vi. استفاده از واکنش جذب خون در ویروس شناسی

صفحه اصلی → تجزیه و تحلیل → روش ایمونولوژیک → واکنش های هماگلوتیناسیون (روش ایمونولوژیک)

واکنش های آگلوتیناسیونبر اساس تعامل یک معرف (آنتی بادی) با آنتی ژن های واقع در سطح سلول ها یا ذرات خارجی است. در نتیجه سنگدانه های بزرگی تشکیل می شود که رسوب می کنند و حتی با چشم غیر مسلح نیز قابل مشاهده هستند. به این ترتیب گروه خونی با توجه به سیستم ABO، وجود فاکتور Rh در آن و غیره تعیین می‌شود. این روش تشخیصی حساس‌تری نسبت به واکنش‌های بارشی است، زیرا حجم رسوب (آگلوتینه) بیش از حجم است. رسوب می کند.

هماگلوتیناسیون مستقیم

واکنش هماگلوتیناسیون مستقیم (DHR) برای شناسایی آنتی ژن های سطحی میکروارگانیسم ها و گلبول های قرمز و همچنین آنتی بادی های موجود در آنها استفاده می شود.
ماده آزمایش (خون) به سرم های استاندارد حاوی آنتی بادی اضافه می شود. سرعت واکنش آگلوتیناسیون مستقیم با مقدار ماده مورد آزمایش، مقدار و غلظت سرم و دمای محیط مرتبط است.

هماگلوتیناسیون غیر مستقیم

واکنش هماگلوتیناسیون غیرمستقیم برای تشخیص آنتی بادی در خون بیمار با استفاده از تشخیص گلبول قرمز انجام می شود. معرف شامل گلبول های قرمز خون است که در سطح آن آنتی ژن (پروتئین های میکروارگانیسم ها، سموم، آلرژن ها و غیره) وجود دارد.
سرم خون بیمار با محلول کلرید سدیم 9/0 درصد رقیق می شود، سپس گلبول های قرمز تشخیصی اضافه می شود و نتیجه بررسی می شود. این روش تشخیصی بسیار حساس، آنتی ژن ها را حتی در غلظت های کوچک تشخیص می دهد.

واکنش هماگلوتیناسیون (HRA).

در آزمایشگاه از دو واکنش هماگلوتیناسیون با مکانیسم های اثر متفاوت استفاده می شود.

اولین RGA سرولوژیکی است. در این واکنش، گلبول های قرمز در هنگام تعامل با آنتی بادی های مناسب (هماگلوتینین) آگلوتینه می شوند. این واکنش به طور گسترده ای برای تعیین گروه های خونی استفاده می شود.

RGA دوم سرولوژیکی نیست. در آن، چسبندگی گلبول های قرمز ناشی از

آنتی بادی ها، اما مواد خاصی که توسط ویروس ها تشکیل می شوند. به عنوان مثال، ویروس آنفولانزا گلبول های قرمز مرغ را آگلوتینه می کند و خوک گینه، ویروس فلج اطفال - گلبول های قرمز گوسفند. این واکنش قضاوت در مورد وجود یک ویروس خاص در ماده مورد مطالعه را ممکن می سازد.

واکنش در لوله های آزمایش یا روی صفحات مخصوص با چاه انجام می شود. ماده آزمایش شده برای حضور ویروس با محلول ایزوتونیک از 1:10 تا 1:1280 رقیق می شود. 0.5 میلی لیتر از هر رقت با حجم مساوی از 1-2٪ سوسپانسیون گلبول قرمز مخلوط می شود. در شاهد، 0.5 میلی لیتر گلبول قرمز با 0.5 میلی لیتر محلول ایزوتونیک مخلوط می شود. لوله های آزمایش به مدت 30 دقیقه در یک ترموستات قرار می گیرند و صفحات به مدت 45 دقیقه در دمای اتاق قرار می گیرند.

حسابداری برای نتایجدر نتیجه مثبتدر واکنش، رسوبی از گلبول‌های قرمز خون با لبه‌های صدفی ("چتر") در انتهای لوله آزمایش یا چاه ظاهر می‌شود و تمام کف چاه را می‌پوشاند. در نتیجه منفیگلبول های قرمز یک رسوب متراکم با لبه های صاف ("دکمه") تشکیل می دهند. همان رسوب باید در کنترل باشد. شدت واکنش با علائم "+" بیان می شود.

واکنش هماگلوتیناسیون

تیتر ویروس حداکثر رقت ماده ای است که در آن آگلوتیناسیون اتفاق می افتد.

واکنش مهار هماگلوتیناسیون

این یک واکنش سرولوژیکی است که در آن آنتی‌بادی‌های ضد ویروسی خاص، در تعامل با ویروس (آنتی‌ژن)، آن را خنثی می‌کنند و توانایی لخته شدن گلبول‌های قرمز را از آن سلب می‌کنند، یعنی واکنش هماگلوتیناسیون را مهار می‌کنند. این واکنش به شما امکان می دهد نوع و نوع ویروس ها را تعیین کنید.

تنظیم یک واکنش 0.25 میلی لیتر سرم ضد ویروسی با حجم مساوی از مواد حاوی ویروس مخلوط می شود. مخلوط را تکان داده و به مدت 30 دقیقه در یک ترموستات قرار داده و پس از آن 0.5 میلی لیتر سوسپانسیون 1-2٪ گلبول قرمز اضافه می شود.

حسابداری برای نتایجاگر آزمایش به درستی انجام شود، باید یک "دکمه" در کنترل سرم و گلبول های قرمز تشکیل شود - هیچ عاملی برای آگلوتیناسیون گلبول های قرمز وجود ندارد. در کنترل آنتی ژن، یک "چتر" تشکیل می شود - ویروس باعث آگلوتیناسیون گلبول های قرمز خون می شود. اگر سرم با ویروس مورد مطالعه همولوگ باشد، یک "دکمه" تشکیل می شود - سرم ویروس را خنثی کرده است.

واکنش هماگلوتیناسیون غیر مستقیم

واکنش هماگلوتیناسیون غیرمستقیم (غیرفعال) (RIHA) بر اساس این واقعیت است که گلبول های قرمز، اگر یک آنتی ژن محلول روی سطح آنها جذب شود، در هنگام تعامل با آنتی بادی های آنتی ژن جذب شده، توانایی آگلوتیناسیون را به دست می آورند.

تنظیم یک واکنشسرم به مدت 30 دقیقه در دمای 56 درجه سانتی گراد حرارت داده می شود، به طور متوالی به نسبت 1:10 - 1:1280 رقیق می شود و در 0.25 میلی لیتر در لوله های آزمایش یا چاه ها ریخته می شود، جایی که 2 قطره گلبول قرمز با آنتی ژن های جذب شده روی آنها جذب می شود. اضافه.

کنترل ها:یک سوسپانسیون گلبول های قرمز با آنتی ژن های جذب شده روی آنها با سرم آشکارا ایمنی، یک سوسپانسیون گلبول های قرمز با آنتی ژن های جذب شده روی آنها با سرم طبیعی. تعلیق گلبول های قرمز طبیعی با سرم آزمایش. در کنترل اول باید آگلوتیناسیون اتفاق بیفتد، در کنترل دوم و سوم نباید اتفاق بیفتد.

کنترل سوالات

1. نتیجه آنالیز اشعه ایکس مثبت بین گلبول‌های قرمز خون و ماده مورد آزمایش برای وجود ویروس چه چیزی را نشان می‌دهد؟

2. اگر ویروس و سرم مربوط به آن به گلبول های قرمز اضافه شود، واکنش آگلوتیناسیون گلبول های قرمز رخ می دهد؟ نام واکنشی که این پدیده را آشکار می کند چیست؟

کار عملی شماره 12.

واکنش تثبیت مکمل

واکنش تثبیت کمپلمان (FFR) بر این واقعیت استوار است که یک کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی خاص همیشه مکمل را به خود جذب می کند (پیوند می کند).

این واکنش به طور گسترده ای در شناسایی آنتی ژن ها و تشخیص سرمی عفونت ها به ویژه بیماری های ناشی از اسپیروکت ها (واسرمان واکنش)، ریکتزیا و ویروس ها استفاده می شود.

RKS یک واکنش سرولوژیکی پیچیده است. این شامل مکمل و دو سیستم آنتی ژن-آنتی بادی است. در اصل، این دو واکنش سرولوژیکی هستند.

سیستم اصلی سمت راست از یک آنتی ژن و یک آنتی بادی تشکیل شده است (یکی شناخته شده است، دیگری مشخص نیست). مقدار مشخصی مکمل به آن اضافه می شود. اگر آنتی ژن و آنتی بادی این سیستم با هم تطبیق داشته باشند، یک تعارف به هم وصل می کنند و می بندند. مجموعه حاصل به خوبی پراکنده شده و قابل مشاهده نیست.

تشکیل این کمپلکس با استفاده از سیستم همولیتیک یا اندیکاتور دوم تشخیص داده می شود. این شامل گلبول های قرمز گوسفند (آنتی ژن) و سرم همولیتیک مربوطه (آنتی بادی)، یعنی. کمپلکس ایمنی آماده در این سیستم، لیز گلبول های قرمز تنها در حضور مکمل می تواند رخ دهد. اگر مکمل توسط سیستم اول محدود شود، در سیستم دوم همولیز وجود نخواهد داشت، زیرا بدون مکمل رایگان عدم وجود همولیز (محتویات لوله کدر است یا رسوب گلبول های قرمز در پایین وجود دارد) به عنوان یک نتیجه RSC مثبت ثبت می شود.

اگر در سیستم اول آنتی ژن با آنتی بادی مطابقت نداشته باشد، کمپلکس ایمنی تشکیل نمی شود و مکمل آزاد می ماند. با آزاد ماندن، تعارف در سیستم دوم شرکت می کند و باعث همولیز می شود، نتیجه RSC منفی است (محتویات لوله ها شفاف است - "خون لاکی").

اجزاء، واکنش های تثبیت مکمل:

1. آنتی ژن - معمولا لیز، عصاره، هاپتن،

کمتر تعلیق میکروارگانیسم ها.

2. آنتی بادی - سرم بیمار.

3. مکمل - سرم خوکچه هندی.

4. آنتی ژن - گلبول های قرمز گوسفند.

5. آنتی بادی - همولیزین به گلبول های قرمز گوسفند.

6. محلول ایزوتونیک.

با توجه به اینکه RSK شرکت می کند تعداد زیادی ازاجزای پیچیده،

آنها ابتدا باید تیتر شوند و در مقادیر دقیق و در حجم های مساوی واکنش نشان دهند: 0.5 یا 0.25، کمتر 0.2، 1.25 یا 1.0 میلی لیتر (حجم های بزرگتر نتیجه دقیق تری می دهد). تیتراسیون اجزای واکنش در همان حجم آزمایش انجام می شود و مواد از دست رفته را با محلول ایزوتونیک جایگزین می کند.

اطلاعات مربوطه:

جستجو در سایت:

تست هماگلوتیناسیون غیر مستقیم یا غیر مستقیم (IRHA یا RPHA) نسبت به آزمایش آگلوتیناسیون حساس تر و اختصاصی تر است. از این واکنش در دو جهت نیز استفاده می شود.

1) برای تشخیص آنتی بادی ها در سرم خون بیمار، از دستگاه تشخیص گلبول قرمز استفاده می شود که در آن آنتی ژن روی سطح گلبول های قرمز تیمار شده با تانن جذب می شود. در رابطه با این واکنش، اصطلاح RPGA بیشتر استفاده می شود.

سرم آزمایش در چاهک های پلیت های پلاستیکی رقیق شده و گلبول های قرمز تشخیصی اضافه می شوند. با یک واکنش مثبت، یک فیلم نازک در امتداد دیواره های سوراخ به شکل یک "چتر توری" ظاهر می شود؛ با یک واکنش منفی، یک رسوب متراکم از گلبول های قرمز به شکل یک "دکمه" ظاهر می شود.

2) برای تشخیص سموم و آنتی ژن های باکتریایی در ماده مورد مطالعه، از تشخیص آنتی بادی گلبول قرمز استفاده می شود که از طریق جذب آنتی بادی ها روی گلبول های قرمز به دست می آید. در رابطه با این واکنش، اصطلاح RNGA بیشتر استفاده می شود. به عنوان مثال، با کمک تشخیص آنتی بادی، آنتی ژن باسیل طاعون، اگزوتوکسین دیفتری و اگزوتوکسین بوتولینوم شناسایی می شود.

تشخیص گلبول قرمز چیست؟ تشخیص آنتی بادی اریتروسیت چیست؟

اریتروسیت‌های تشخیصی گلبول‌های قرمز خون (درمان‌شده با تانن یا فرمالین) با آنتی‌ژن‌های استخراج‌شده از باکتری‌های جذب شده روی آن‌ها هستند و در RPHA (واکنش‌های هماگلوتیناسیون غیرفعال) استفاده می‌شوند. در مواردی که از RPGA برای تشخیص آنتی ژن در ترشحات بیماران، در بافت ها و غیره استفاده می شود، از "تشخیص آنتی بادی" استفاده می شود، یعنی گلبول های قرمز حساس به آنتی بادی ها.

در RNGA، آنتی‌بادی‌های سرم خون با استفاده از یک گلبول قرمز تشخیصی آنتی‌ژنی، که گلبول‌های قرمز با آنتی‌ژن‌های جذب شده روی آن‌ها هستند، شناسایی می‌شوند.

روش‌شناسی برای تنظیم واکنش‌ها. واکنش کواگلوتیناسیون

- تثبیت گلبول های قرمز با فرمالدئید یا گلوتاریک یا اکریلیک آلدئید. چنین گلبول های قرمز درمان شده برای مدت طولانی ذخیره می شوند. اغلب برای این منظور از گلبول های قرمز گوسفند، انسان، مرغ و غیره استفاده می شود.
- درمان گلبول های قرمز ثابت با محلول تانن. در نتیجه، گلبول های قرمز خون توانایی جذب برگشت ناپذیر پروتئین ها (ویروس ها و آنتی بادی ها) را در سطح خود به دست می آورند.
- حساس شدن گلبول های قرمز برنزه شده توسط ویروس ها یا آنتی بادی ها.

واکنش انعقادی (CAR)

واکنش انعقادی برای تعیین آنتی ژن ها با استفاده از آنتی بادی های جذب شده روی پروتئین A سلول های استافیلوکوک (آنتی بادی diagnosticum) استفاده می شود.
پروتئین A میل ترکیبی با قطعه Fc ایمونوگلوبولین‌ها دارد، بنابراین چنین باکتری‌هایی که با سرم تشخیصی ایمنی درمان می‌شوند، به‌طور غیر اختصاصی آنتی‌بادی‌های سرم را جذب می‌کنند، که سپس با مراکز فعال با میکروب‌های مربوطه جدا شده از بیماران تعامل می‌کنند. در نتیجه انعقاد، پوسته های متشکل از استافیلوکوک ها، آنتی بادی های سرم تشخیصی و میکروب شناسایی شده تشکیل می شوند.

سرم های آگلوتینه کننده: حاوی چه چیزی هستند. چگونه به دست می آیند، برای چه استفاده می شوند. تیتر سرم آگلوتینه چقدر است؟

سرم آگلوتینه کننده با ایمن سازی خرگوش ها (داخل وریدی، زیر جلدی یا داخل صفاقی) با سوسپانسیون باکتری های کشته شده، با دوز 200 میلیون، سپس 500 میلیون، 1 میلیارد، 2 میلیارد اجسام میکروبی در 1 میلی لیتر، در فواصل زمانی 5 روزه به دست می آید. 8-7 روز پس از آخرین ایمن سازی خون گرفته شده و تیتر آنتی بادی تعیین می شود.

تیتر یک سرم آگلوتینه کننده حداکثر رقت سرمی است که در آن آگلوتیناسیون با میکروارگانیسم مربوطه اتفاق می افتد.

سرم های آگلوتینه کننده برای شناسایی میکروب ها در یک واکنش آگلوتیناسیون در مقیاس کامل استفاده می شوند.

واکنش هماگلوتیناسیون (HRA)

اگر میکروارگانیسم مورد مطالعه توسط سرم به تیتر یا نصف مقدار تیتر آگلوتینه شود، می توان آن را متعلق به گونه ای دانست که نام آن بر روی برچسب آمپول درج شده است.

تفاوت بین سرم های آگلوتینه چند ظرفیتی و تک ظرفیتی (تک گیرنده) چیست؟ چرا ایمن سازی خرگوش با میکروب های یک نوع، سرم حاوی آنتی بادی برای چندین آنتی ژن تولید می کند؟

سرم های تک گیرنده، سرم های حاوی آنتی بادی تنها در برابر یک آنتی ژن، و سرم های چند ظرفیتی هستند که با دو یا سه باکتری مرتبط که دارای یک آنتی ژن مشترک هستند، واکنش های آگلوتیناسیون ایجاد می کنند. سرم های آگلوتینه کننده برای شناسایی میکروارگانیسم ها در واکنش آگلوتیناسیون استفاده می شوند. عیب چنین سرم هایی این است که قادر به ایجاد واکنش های آگلوتیناسیون گروهی هستند، زیرا آنها حاوی آنتی بادی برای باکتری هایی هستند که آنتی ژن های مشترک دارند.

واکنش هماگلوتیناسیون توضیحات و کاربرد

این مبتنی بر این واقعیت است که گلبول های قرمز خون، که آنتی ژن ها قبلاً روی آنها جذب شده اند، در حضور سرم های همولوگ (آنتی بادی ها) توانایی آگلوتیناسیون را به دست می آورند.

در این حالت گلبول های قرمز به عنوان حامل با عوامل تعیین کننده خاص عمل می کنند که آگلوتیناسیون آنها در نتیجه واکنش آنتی ژن + آنتی بادی رخ می دهد.

گلبول های قرمز خون که آنتی ژن ها به طور محکم به سطح آن متصل هستند، آنتی ژن گلبول های قرمز تشخیصی یا گلبول های قرمز حساس شده با آنتی ژن نامیده می شوند.

نوع دیگری از RNGA - آنتی بادی ها بر روی سطح گلبول های قرمز جذب می شوند و آگلوتیناسیون بعدی آنها در حضور یک آنتی ژن همولوگ اتفاق می افتد. در این مورد، به چنین گلبول های قرمز، آنتی بادی گلبول های قرمز تشخیصی یا گلبول های قرمز حساس شده توسط آنتی بادی ها می گویند.

بر اساس این دو رویکرد اساسی روش شناختی، بسیاری از تغییرات RNGA توسعه یافته و مورد استفاده قرار گرفته است. بنابراین، ذرات کوچک استاندارد لاتکس به عنوان حامل استفاده می شود. در این حالت واکنش را واکنش آگلوتیناسیون لاتکس (RLA) می نامند و یا استفاده می شود استافیلوکوکوس اورئوس- واکنش انعقادی و غیره. معمولاً تشخیص گلبول های قرمز در شرکت های صنایع بیولوژیکی تهیه می شود و تجربه اصلی RNGA در آزمایشگاه های تشخیصی انجام می شود.

آماده سازی تشخیص گلبول قرمز شامل مراحل زیر است:

تثبیت گلبول های قرمز با فرمالدئید یا گلوتاریک یا اکریلیک آلدئید. چنین گلبول های قرمز درمان شده برای مدت طولانی ذخیره می شوند. اغلب برای این منظور از گلبول های قرمز گوسفند، انسان، مرغ و غیره استفاده می شود.
درمان گلبول های قرمز ثابت با محلول تانن. در نتیجه، گلبول های قرمز خون توانایی جذب برگشت ناپذیر پروتئین ها (ویروس ها و آنتی بادی ها) را در سطح خود به دست می آورند.
حساس شدن گلبول های قرمز برنزه شده توسط ویروس ها یا آنتی بادی ها.

لازم به ذکر است که روش های تهیه تشخیص گلبول های قرمز برای عفونت های ویروسیناهمسان.

روش انجام RNGA برای تشخیص و تعیین تیتر آنتی بادی به شرح زیر است:

دوزهای مساوی از گلبول های قرمز حساس شده با آنتی ژن به رقت های 2 برابری متوالی سرم اضافه می شود.
مخلوط به مدت 2-3 ساعت در دمای اتاق یا 16-18 ساعت در دمای 4 درجه سانتیگراد باقی می ماند.
نتایج را در نظر بگیرید اگر سرم حاوی آنتی بادی هایی برای ویروسی باشد که گلبول های قرمز با آن حساس شده اند، هماگلوتیناسیون مشاهده می شود که به صورت متقاطع ارزیابی می شود.

تیتر آنتی بادی در سرم به عنوان بالاترین رقت سرمی در نظر گرفته می شود که همچنان هماگلوتیناسیون را با حداقل دو تلاقی فراهم می کند.

RNGA با تمام کنترل های مربوطه همراه است. معمولا واکنش با استفاده از میکرو متد انجام می شود.

RNGA به شما امکان می دهد مشکلات تشخیصی زیر را حل کنید:

شناسایی آنتی بادی ها و تعیین تیتر آنها در سرم خون با استفاده از یک تشخیص آنتی ژن گلبول قرمز شناخته شده.
شناسایی و شناسایی یک ویروس ناشناخته با استفاده از یک تشخیص آنتی بادی گلبول قرمز شناخته شده.

مزایای RNGA: حساسیت بالا، سادگی روش قرار دادن و سرعت پاسخ. با این حال، توجه به این نکته مهم است که مشکلات زیادی در تهیه تشخیص پایدار گلبول قرمز ایجاد می شود (وابستگی زیاد به خلوص اجزای مورد استفاده، نیاز به انتخاب حالت تثبیت، برنزه شدن و حساس شدن گلبول های قرمز برای هر نوع ویروس).

اگر خطایی پیدا کردید، لطفاً یک متن را انتخاب کنید و Ctrl+Enter را فشار دهید.

در تماس با

واکنش مهار هماگلوتیناسیون (HAI)

RHA بر اساس توانایی گلبول های قرمز خون برای چسبیدن به هم زمانی که آنتی ژن های خاصی روی آنها جذب می شود، است. مایع آلانتوئیک و آمنیوتیک، سوسپانسیون غشای کوریوآلانتوئیک جنین مرغ، سوسپانسیون و عصاره های کشت یا اندام حیوانات آلوده به ویروس، و مواد عفونی بومی به عنوان مواد آزمایشی برای هماگلوتیناسیون استفاده می شود. RGA سرولوژیکی نیست، زیرا بدون مشارکت سرم ایمنی رخ می دهد و برای انتخاب رقت کاری آنتی ژن برای انجام RGA یا وجود آنتی ژن (ویروس) در ماده آزمایش (مثلاً برای آنفولانزا) استفاده می شود. در این واکنش از گلبول های قرمز حیوانات، پرندگان و انسان های گروه خونی I (0) استفاده می شود.

برای تنظیم یک RGA تقریبی، یک قطره از یک سوسپانسیون 5٪ از گلبول های قرمز خون و یک قطره از مواد آزمایش را روی یک اسلاید شیشه ای اعمال کرده و کاملاً مخلوط می کنند. در صورت مثبت بودن نتیجه، پس از 2-1 دقیقه ظاهر آگلوتیناسیون گلبول های قرمز به صورت ماکروسکوپی مشاهده می شود.

برای راه اندازی RGA در یک ردیف تا نشده در چاه های صفحات پلی استایرن، رقت های افزایش مضاعف ماده آزمایش در محلول فیزیولوژیکی در حجم 0.5 میلی لیتر تهیه می شود. 0.5 میلی لیتر سوسپانسیون 0.25 - 1٪ از گلبول های قرمز به تمام لوله های آزمایش اضافه می شود. نتایج پس از ته نشینی کامل گلبول های قرمز در کنترل (گلبول های قرمز + محلول نمک) در نظر گرفته می شود. واکنش توسط ماهیت رسوب گلبول قرمز در نظر گرفته می شود. در موارد مثبت، درجه آگلوتیناسیون با پلاس مشخص می شود. واکنشی که شبیه یک لایه نازک از گلبول‌های قرمز چسبنده است که کف لوله آزمایش (چتر) را می‌پوشاند، با چهار علامت مثبت ارزیابی می‌شود؛ واکنشی که شکاف‌هایی در فیلم وجود دارد با سه بعلاوه مشخص می‌شود؛ وجود یک فیلم با توری پوسته‌دار. لبه‌های گلبول‌های قرمز چسبنده با دو علامت مثبت مشخص می‌شوند؛ یک رسوب لخته‌ای از گلبول‌های قرمز خون که توسط ناحیه‌ای از گلبول‌های قرمز آگلوتینه شده احاطه شده است، معادل یک پلاس است. رسوب گلبول قرمز کاملاً مشخص و غیر قابل تشخیص از کنترل نشان دهنده عدم وجود آگلوتیناسیون است. تیتر حداکثر رقت ماده آزمایشی است که باعث آگلوتیناسیون گلبول های قرمز با دو عدد مثبت شده است.

اگر نتیجه RHA مثبت باشد، مطالعه ادامه می یابد و نوع ویروس جدا شده با استفاده از واکنش مهار هماگلوتیناسیون با سرم های نوع خاص تعیین می شود.

RTGA بر اساس خاصیت آنتی سرم برای سرکوب هماگلوتیناسیون ویروسی است، زیرا ویروس خنثی شده توسط آنتی بادی های خاص توانایی لخته شدن گلبول های قرمز را از دست می دهد. برای تایپ آزمایشی ویروس ها از روش قطره ای روی شیشه استفاده می شود. برای تعیین قطعی نوع ویروس جدا شده و تیتراسیون آنتی بادی های موجود در سرم، یک RTGA منبسط شده در لوله های آزمایش یا چاهک ها قرار داده می شود. برای این منظور، رقت های دو برابری سرم در محلول فیزیولوژیکی تهیه شده و در 0.25 میلی لیتر توزیع می شود. به رقت های سرم یک قطره از مواد حاوی ویروس و یک قطره سوسپانسیون 1% گلبول های قرمز اضافه کنید.

هنگام استفاده از RTGA برای تعیین نوع ویروس، از سرم های نوع خاص استفاده می شود که به حجم مساوی از رقت کاری آنتی ژن اضافه می شود. نوع ویروس جدا شده توسط سرم ایمنی خاصی تعیین می شود که بالاترین تیتر آنتی بادی را در برابر این ویروس نشان می دهد.

RGA و RTGA به طور گسترده ای برای تشخیص عفونت های ویروسی استفاده می شود. آنسفالیت ناشی از کنه، آنفولانزا و غیره) به منظور شناسایی آنتی بادی های خاص و شناسایی بسیاری از ویروس ها توسط آنتی ژن های آنها.

واکنش ایمونوفلورسانس (RIF)

RIF بر اساس ترکیبی از آنتی ژن های باکتری، ریکتزیا و ویروس ها با آنتی بادی های خاص برچسب گذاری شده با رنگ های فلورسنت (فلورسین ایزوتیوسیانات، رودامین، B-isothicyanite، lissatine رودامین B-200، سولفوکلراید، و غیره) که دارای گروه های واکنش دهنده ایزوتیوسیانات (sulfoich) هستند، ساخته شده است. ، و غیره.) . این گروه‌ها با گروه‌های آمینه آزاد مولکول‌های آنتی‌بادی ترکیب می‌شوند، که وقتی با فلوروکروم درمان می‌شوند، میل خاص خود را برای آنتی‌ژن مربوطه از دست نمی‌دهند. کمپلکس‌های AG-AT به‌طور واضح زیر یک میکروسکوپ فلورسنت به ساختارهای درخشان و درخشانی تبدیل می‌شوند (شکل 48). RIF می تواند مقادیر کمی از آنتی ژن های باکتریایی و ویروسی را تشخیص دهد. روش RIF در دو نسخه مستقیم و غیر مستقیم استفاده می شود.

روش مستقیم بر اساس ترکیب مستقیم یک آنتی ژن با یک آنتی بادی نشاندار است. روش غیر مستقیم- در تشخیص گام به گام مجموعه AG-AT با استفاده از رنگ های فلورسنت. مرحله اول تشکیل کمپلکس های ایمنی یک آنتی ژن خاص با آنتی بادی های خاص است. مرحله دوم شناسایی این کمپلکس با درمان آن با آنتی گاماگلوبولین نشاندار است.

مزیت RIF سادگی، حساسیت بالا و سرعت به دست آوردن نتایج است. RIF به عنوان روشی برای تشخیص سریع آنفولانزا، اسهال خونی، مالاریا، طاعون، تولارمی، سیفلیس و غیره استفاده می شود. برای انجام چنین مطالعه ای از میکروسکوپ فلورسنت استفاده می شود.

رادیوایمونواسی (RIA)

RIA یکی از حساس ترین روش های تشخیص ایمنی است. برای تشخیص آنتی ژن ویروس هپاتیت B در بیماران استفاده می شود هپاتیت ویروسی. برای انجام این کار، یک سرم مرجع (سرم حاوی آنتی بادی برای ویروس هپاتیت B) به سرم آزمایش اضافه می شود. مخلوط به مدت 1-2 روز در دمای 40 درجه سانتیگراد انکوبه می شود، سپس یک آنتی ژن مرجع (آنتی ژن نشاندار شده با ایزوتوپ 125 J) اضافه می شود و انکوباسیون برای 24 ساعت دیگر ادامه می یابد. آنتی ایمونوگلوبولین های رسوبی علیه پروتئین های سرم مرجع به مجموعه آنتی ژن-آنتی بادی حاصل اضافه می شوند که منجر به تشکیل رسوب می شود (شکل 49). نتیجه با حضور و تعداد پالس ها در رسوب ثبت شده توسط شمارنده در نظر گرفته می شود. اگر آنتی ژنی در سرم آزمایش وجود داشته باشد که به آنتی‌بادی‌های خاص متصل شده باشد، آنتی‌بادی‌های دوم با آنتی‌ژن نشان‌دار شده تعامل ندارند و بنابراین در رسوب شناسایی نمی‌شوند. بنابراین، RIA بر اساس اصل تعامل رقابتی آنتی ژن شناسایی شده و مقدار مشخصی از آنتی ژن نشاندار شده با مراکز فعال آنتی بادی ها است.

روش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم (ELISA)

این روش برای شناسایی آنتی ژن ها با استفاده از آنتی بادی های مربوطه آنها که به آنزیم برچسب (پراکسیداز ترب، ب-گالاکتوز یا آلکالین فسفاتاز) کونژوگه شده اند، استفاده می شود. پس از ترکیب آنتی ژن با سرم ایمنی نشاندار شده با آنزیم، یک سوبسترا و کروموژن به مخلوط اضافه می شود. . سوبسترا توسط آنزیم شکافته می شود و محصولات تجزیه آن باعث اصلاح شیمیایی کروموژن می شود. در همان زمان، کروموژن رنگ خود را تغییر می دهد - شدت رنگ به طور مستقیم با تعداد مولکول های آنتی ژن و آنتی بادی متصل است (شکل 50).

رایج ترین روش الایزای فاز جامد است که در آن یکی از اجزای واکنش ایمنی (آنتی ژن یا آنتی بادی) روی یک حامل جامد جذب می شود. میکرو پانل های پلی استایرن به عنوان یک حامل جامد استفاده می شود. هنگام تعیین آنتی‌بادی‌ها، سرم خون بیمار، سرم آنتی‌گلوبولین نشان‌دار شده با آنزیم و مخلوطی از محلول‌های سوبسترای آنزیم و کروموژن به‌طور متوالی به چاه‌هایی با آنتی‌ژن جذب‌شده اضافه می‌شوند. هر بار پس از افزودن یک جزء دیگر، معرف های غیر متصل با شستشوی کامل از چاهک ها خارج می شوند. اگر نتیجه مثبت باشد، رنگ محلول کروموژن تغییر می کند.

یک حامل فاز جامد می تواند نه تنها با یک آنتی ژن، بلکه با یک آنتی بادی نیز حساس شود. سپس آنتی ژن مورد نظر با آنتی بادی های جذب شده به چاهک ها اضافه می شود، سرم ایمنی در برابر آنتی ژن نشاندار شده با آنزیم اضافه می شود و سپس مخلوطی از محلول های سوبسترا برای آنزیم و کروموژن اضافه می شود.

الایزا برای تشخیص بیماری های ناشی از پاتوژن های ویروسی و باکتریایی استفاده می شود.

بخش VII. مبانی ویروس شناسی

RGA و RTGA به طور گسترده برای تشخیص عفونت های ویروسی (آنسفالیت ناشی از کنه، آنفولانزا و غیره) به منظور شناسایی آنتی بادی های خاص و شناسایی بسیاری از ویروس ها توسط آنتی ژن های آنها استفاده می شود.

واکنش هماگلوتیناسیون (HRA)

RGA مبتنی بر این واقعیت است که برخی از انواع باکتری ها و ویروس ها توانایی جذب در سطح گلبول های قرمز را دارند. انواع متفاوتحیوانات (و پرندگان)، که باعث می شود آنها به هم بچسبند و یک آگلوتینات تشکیل دهند (RGA مستقیم).

جذب آنتی ژن (باکتری ها، ویروس ها) روی سطح گلبول های قرمز همیشه با تشکیل یک رسوب قابل مشاهده آشکار نمی شود. علاوه بر این، RHA غیراختصاصی است زیرا گلبول های قرمز یک گونه حیوانی می توانند آنتی ژن های مختلف را جذب کنند.

واکنش هماگلوتیناسیون غیر مستقیم (غیر مستقیم) (RPHA) اختصاصی است. برای انجام این روش ابتدا یک erythrocyte diagnosticum (گلبول های قرمزی که آنتی ژن روی آنها جذب می شود) تهیه می شود. برای این منظور، خون گوسفند (یا خروس) به طور استریل به دست می آید، دفیبرینه می شود و چندین بار در محلول بافر فسفات (pH 7.2) با استفاده از سانتریفیوژ 3-5 برابر شسته می شود. مایع رویی برداشته می شود، غلظت گلبول های قرمز به 2.5٪ تنظیم می شود (1:40). به یک سوسپانسیون 2.5٪ از گلبول های قرمز، حجم مساوی (1 میلی لیتر یا 0.5 میلی لیتر) از یک سوسپانسیون باکتری از گونه های میکروبی مورد مطالعه را با غلظت 5-10 میلیارد سلول در هر 1 میلی لیتر اضافه کنید. گلبول های قرمز به راحتی آنتی ژن های پلی ساکارید را جذب می کنند. برای جذب یک آنتی ژن پروتئینی، گلبول های قرمز با تانن از قبل با رقت 1:20000 تیمار می شوند. گلبول های قرمز در ترکیب با آنتی ژن اضافه شده برای حساس سازی (جذب) به مدت 2 ساعت در ترموستات (37 درجه سانتیگراد) باقی می مانند و سپس سانتریفیوژ می شوند. دوباره در 3-4 هزار دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه با محلول بافر فسفات (شکل 9.13).

گلبول های قرمز حاصل در لوله های آزمایش (یا چاه هایی در یک تخته پلکسی گلاس) قرار می گیرند و سرم ایمنی استاندارد به آن اضافه می شود.

در موارد مثبت، RHA رخ می دهد - از دست دادن گلبول های قرمز خون به شکل یک رسوب پوسته پوسته یا دانه ای مشخص که در تمام سطح کف لوله آزمایش (هماگلوتینات) توزیع می شود. این بدان معنی است که نوع میکروب مورد مطالعه (آنتی ژن) مختص آنتی بادی های سرم ایمنی است. در موارد منفی، گلبول های قرمز غیر چسبیده به شکل یک دایره کوچک و یکنواخت به پایین می نشینند.

برای اطمینان بیشتر نتایج، RPGA انجام می شود تاخیر واکنش(ترمز کردن) پدیده هماگلوتیناسیون(RZGA) یا اصلاح آن - واکنش خنثی سازی آنتی بادی(RIA).

برنج. 9.13. واکنش هماگلوتیناسیون غیرفعال (طرح): Er - گلبول قرمز: AG - آنتی ژن: AT - آنتی بادی

ماهیت RZGAشامل این واقعیت است که یک واکنش آگلوتیناسیون با یک سرم تشخیصی خاص و یک آنتی ژن آزمایشی انجام می شود (نوع میکروب مورد مطالعه به عنوان آنتی ژن استفاده می شود). این مخلوط به مدت 2-1 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد نگهداری می شود و سپس گلبول های قرمز به آن اضافه می شود. اگر آنتی ژن آزمایشی با آنتی بادی های سرم تشخیصی همولوگ باشد، آنها با یکدیگر تعامل دارند و گلبول های قرمز اضافه شده آگلوتینه نمی شوند - نتیجه واکنش مثبت است. اگر آنتی ژن آزمایشی با آنتی بادی های سرم همولوگ نباشد یا در ماده موجود نباشد، گلبول های قرمز اضافه شده آنتی ژن را جذب می کنند و RGA رخ می دهد - نتیجه RGA منفی است، نوع میکروب (آنتی ژن) مورد آزمایش مشخص نیست.

متدولوژی تنظیم PH Aشامل مصرف مقادیر مساوی و مخلوط کردن سرم ایمنی تشخیصی با رقت‌های مختلف ماده مورد آزمایش (آنتی ژن مورد نظر)، باقی گذاشتن آن برای تماس به مدت 1-2 ساعت، سپس افزودن گلبول‌های قرمز حساس با آنتی ژن خاص (معروف) خاص به آنتی‌بادی‌های سرم است. (تشخیص گلبول قرمز). هنگامی که آنتی ژن مورد نظر با آنتی بادی های سرم واکنش نشان می دهد، آنها خنثی می شوند و گلبول های قرمز اضافه شده آگلوتینه نمی شوند، RHA رخ نمی دهد - نتیجه RHA مثبت است. اگر ماده آزمایشی حاوی آنتی ژن مخصوص آنتی بادی های سرم مورد استفاده نباشد، خنثی سازی آنتی بادی ها اتفاق نمی افتد. بنابراین، هنگام افزودن erythrocyte diagnosticum، آگلوتیناسیون گلبول های قرمز (هماگلوتیناسیون) ظاهر می شود و نتیجه RNA منفی است. واکنش خنثی سازی آنتی بادی یک روش بسیار حساس برای تشخیص آنتی ژن نه تنها در سوسپانسیون باکتری های زنده (یا کشته شده)، بلکه در سوسپانسیون بافت زمین است. اندام های مختلف، ترشحات و فضولات بومی و حرارت دیده ارگانیسم بیمار.

واکنش ویدال. از هفته دوم بیماری، آنتی بادی های ضد عامل عفونی در خون بیماران تجمع می یابد. برای شناسایی آنها، سرم خون بیمار در واکنش آگلوتیناسیون بررسی می شود. کشت سالمونلاهای کشته شده - تشخیصی - به عنوان آنتی ژن استفاده می شود.

برای انجام واکنش Widal از سرم بیمار، مجموعه ای از کیت های تشخیصی و محلول ایزوتونیک کلرید سدیم استفاده می شود.

خون (3-2 میلی لیتر) از پالپ انگشت یا ورید کوبیتال در یک لوله استریل جمع آوری شده و به آزمایشگاه تحویل داده می شود. در آزمایشگاه لوله آزمایش را به مدت 20 تا 30 دقیقه در ترموستات قرار می دهند تا لخته ایجاد شود، سپس از پیپت پاستور دور لخته می شود تا از دیواره لوله آزمایش جدا شود و در سرما قرار می گیرد. به مدت 30-40 دقیقه سرم جدا شده مکیده می شود و برای انجام واکنش آگلوتیناسیون با تشخیص تیفوس سالمونلا و تب پاراتیفوئید استفاده می شود. برای بدست آوردن سرم می توان خون را سانتریفیوژ کرد.

هنگامی که یک فرآیند عفونی رخ می دهد - تب حصبه یا تب پاراتیفوئید - بدن آنتی بادی های O- و H را در برابر همان آنتی ژن های پاتوژن تولید می کند.

آنتی بادی های O ابتدا ظاهر می شوند و به سرعت ناپدید می شوند. آنتی بادی های H برای مدت طولانی دوام می آورند. همین اتفاق در مورد واکسیناسیون می افتد، بنابراین واکنش مثبتویدال با آنتی‌ژن‌های O و H نشان‌دهنده وجود بیماری است و واکنش تنها با آنتی‌ژن‌های H می‌تواند هم در افرادی که از بیماری بهبود یافته‌اند (واکنش آنامنسیک) و هم در کسانی که واکسینه شده‌اند (واکنش واکسن) رخ دهد. بر این اساس واکنش Widal به طور جداگانه با آنتی ژن های O و H (diagnosticums) انجام می شود.

از نظر بالینی تب حصبهو پاراتیف A و B مشابه هستند، سپس برای شناسایی ماهیت بیماری، سرم بیمار همزمان با تشخیص بیماری سالمونلا تیفوس و پاراتیفوئید A و B آزمایش می شود.

واکنش Widal به دلیل ساده بودن و عدم نیاز به شرایط خاصی بسیار مورد استفاده قرار می گیرد.

واکنش را می توان به دو روش انجام داد: قطره ای و حجمی (به فصل 12 مراجعه کنید). در عمل، روش حجمی بیشتر مورد استفاده قرار می گیرد. هنگام انجام واکنش آگلوتیناسیون خطی، تعداد ردیف ها باید با تعداد آنتی ژن ها (diagnosticums) مطابقت داشته باشد. عامل بیماری میکروارگانیسمی در نظر گرفته می شود که تشخیص توسط سرم بیمار از آن آگلوتینه شده است. گاهی اوقات آگلوتیناسیون گروهی مشاهده می شود، زیرا عوامل ایجاد کننده تب حصبه و پاراتیفوئید دارای آنتی ژن های گروه مشترک هستند. در این مورد، نتیجه واکنش در سری که در آن آگلوتیناسیون در رقت بیشتر سرم مشخص می شود، مثبت در نظر گرفته می شود (جدول 36).

جدول 36. نتیجه احتمالی واکنش آگلوتیناسیون

توجه داشته باشید. در عمل، واکنش ویدال با چهار تشخیص انجام می شود: تب تیفوئید "O" و "H" و تب پاراتیفوئید A و B با تشخیص "ON".

اگر آگلوتیناسیون فقط در رقت های کوچک سرم رخ دهد - 1:100، 1:200، سپس برای تشخیص واکنش در طول بیماری از واکسیناسیون یا واکنش آنامنسیک، آنها به تکرار واکنش آگلوتیناسیون پس از 5-7 روز متوسل می شوند. در یک بیمار، تیتر آنتی بادی افزایش می یابد، اما در یک فرد واکسینه شده یا بهبود یافته تغییر نمی کند. بنابراین، افزایش تیتر آنتی بادی در سرم خون به عنوان یک شاخص بیماری عمل می کند.

در پاسخ به ورود پاتوژن های تیفوئیدی دارای آنتی ژن Vi به بدن، آگلوتینین های Vi در خون بیمار ظاهر می شوند. آنها از هفته دوم بیماری شناسایی می شوند، اما تیتر آنها معمولاً از 1:10 تجاوز نمی کند. تشخیص آنتی بادی های Vi-با حضور پاتوژن های تیفوئید در بدن همراه است، بنابراین تعیین این آنتی بادی ها از اهمیت اپیدمیولوژیکی بالایی برخوردار است، زیرا امکان شناسایی ناقلان باکتری را فراهم می کند.

واکنش وی-هماگلوتیناسیون. این حساس ترین واکنش برای تشخیص آنتی بادی است.

اصل واکنش این است که گلبول های قرمز انسان (گروه I) یا گوسفند، پس از درمان ویژه، می توانند آنتی ژن Vi را روی سطح خود جذب کنند و در نتیجه توانایی چسبندگی با آنتی بادی های Vi مربوطه را به دست آورند.

گلبول‌های قرمز با آنتی‌ژن‌های جذب شده روی سطح، گلبول‌های قرمز خونی نامیده می‌شوند.

برای انجام واکنش Vi-هماگلوتیناسیون، موارد زیر را مصرف کنید:

1) سرم خون بیمار (1-2 میلی لیتر)؛ 2) اریتروسیت سالمونلا وی دیاگنوستیکوم. ح) وی سرم; 4) سرم O; 5) محلول ایزوتونیک کلرید سدیم.

واکنش در لوله های آگلوتیناسیون یا در صفحات پلاستیکی با چاه انجام می شود.

خون از بیمار مانند واکنش ویدال گرفته می شود. سرم به دست می آید. رقت های سریال دو برابری از سرم تهیه می شود که از 1:10 تا 1:160 شروع می شود.

0.5 میلی لیتر از هر رقت به چاه اضافه می شود و 0.25 میلی لیتر گلبول های قرمز تشخیصی اضافه می شود. واکنش در حجم 0.75 میلی لیتر انجام می شود.

کنترل ها عبارتند از: 1) سرم تک گیرنده آگلوتیناسیون استاندارد + تشخیص - واکنش باید تا تیتر سرم مثبت باشد. 2) diagnosticum در محلول ایزوتونیک کلرید سدیم (شاهد) - واکنش باید منفی باشد.

محتویات چاهک ها کاملاً مخلوط می شوند، به مدت 2 ساعت در ترموستات قرار می گیرند و تا روز بعد (18-24 ساعت) در دمای اتاق قرار می گیرند.

حسابداری با کنترل شروع می شود. واکنش بسته به درجه آگلوتیناسیون تشخیصی ارزیابی می شود.

نتایج با توجه به سیستم چهار ضربدر در نظر گرفته می شود:

گلبول های قرمز کاملاً آگلوتینه شده اند - در انتهای چاه به شکل "چتر" رسوب می کنند.

+++ "چتر" کوچکتر است، همه گلبول های قرمز آگلوتینه نمی شوند.

++ "چتر" کوچک است، در انتهای سوراخ رسوبی از گلبول های قرمز غیر آگلوتینه وجود دارد.

واکنش منفی است. گلبول های قرمز به هم چسبیده نشدند و به شکل یک دکمه در کف چاه نشستند.

کنترل سوالات

1. واکنش ویدال در چه دوره ای از بیماری انجام می شود؟

2. برای انجام واکنش ویدال به چه موادی نیاز است؟

3. برای انجام واکنش ویدال از چه تشخیصی استفاده می شود؟

4. کدام واکنش سرولوژیک در تشخیص عفونت های تیفوئیدی پاراتیفوئید حساس ترین است؟

5. هنگام انجام واکنش وی-هماگلوتیناسیون از چه تشخیصی استفاده می شود؟

6. برای تعیین وجود آنتی ژن وی در کشت مورد مطالعه از چه سرمی استفاده می شود؟

7. اهمیت تعیین Vi-phagotype چیست؟

تشخیص O- و H از سالمونلا تیفوس، پاراتیفوئید A و پاراتیفوئید B و سرم بیمار را از معلم بگیرید. واکنش ویدال را بگویید.

رسانه فرهنگ

محیط های EMS، Ploskireva و بیسموت سولفیت آگار توسط صنایع پزشکی به شکل پودر خشک تولید می شوند. آنها طبق دستورالعمل روی برچسب تهیه می شوند: مقدار مشخصی پودر را وزن کنید، به مقدار مناسب آب بریزید، بجوشانید و در ظروف پتری استریل بریزید.

راسل چهارشنبه. 40 گرم محیط غذایی خشک را به 950 میلی لیتر آب مقطر اضافه کنید و 5 گرم نوترینت آگار اضافه کنید. حرارت دهید تا به جوش آید و پودرها حل شوند. 1 گرم x در 50 میلی لیتر آب مقطر حل می شود. ساعت گلوکز و به مخلوط آماده شده اضافه کنید. محیط در لوله های آزمایش استریل 5-7 میلی لیتری ریخته می شود، با بخار جاری (2 روز به مدت 2 دقیقه) استریل می شود و به گونه ای اریب می شود که یک ستون باقی بماند. محیط راسل با مانیتول و ساکارز به همین ترتیب تهیه می شود.

محیط اولکنیتسکی از آگار خشک. 2.5 گرم نوترینت آگار خشک در 100 میلی لیتر آب مقطر ذوب می شود. تمام مواد ذکر شده در دستور غذا (برچسب) به آگاری که تا دمای 50 درجه سانتیگراد خنک شده است اضافه می شود. محیط ریخته شده در لوله های آزمایش با بخار جاری (3 روز، هر کدام 20 دقیقه) استریل می شود و سپس درو می شود. محیط آماده شده باید صورتی کم رنگ باشد.