Reakcia vi hemaglutinácie. Krvný test na brušný týfus s Vi antigénom. Použitie vo virológii hemadsorpčnej reakcie

Úvod → Analýzy → Imunologická metóda → Hemaglutinačné reakcie (imunologická metóda)

Aglutinačné reakcie založené na interakcii činidla (protilátok) s antigénmi umiestnenými na povrchu buniek alebo cudzích častíc. V dôsledku toho vznikajú agregáty veľkých rozmerov, ktoré sa vyzrážajú a sú viditeľné aj voľným okom. Krvná skupina sa teda určuje podľa systému ABO, prítomnosti Rh faktora v ňom atď. Ide o citlivejšiu diagnostickú metódu v porovnaní so zrážacími reakciami, keďže objem sedimentu (aglutinátu) prevyšuje objem zrazeniny.

Priama hemaglutinácia

Priamy hemaglutinačný test (RPHA) sa používa na detekciu povrchových antigénov mikroorganizmov a erytrocytov, ako aj protilátok proti nim.
Testovaný materiál (krv) sa pridá do štandardného séra obsahujúceho protilátky. Rýchlosť priamej aglutinačnej reakcie súvisí s množstvom testovaného materiálu, množstvom a koncentráciou séra a teplotou okolia.

Nepriama hemaglutinácia

Reakcia nepriamej hemaglutinácie sa uskutočňuje na detekciu protilátok v krvi pacienta pomocou erytrocytárneho diagnostického zariadenia. Činidlom sú erytrocyty, na povrchu ktorých sa nachádza antigén (proteíny mikroorganizmov, toxíny, alergény atď.).
Krvné sérum pacienta sa zriedi 0,9% roztokom chloridu sodného, potom sa pridá erytrocytárne diagnosticum a sleduje sa výsledok. Táto vysoko citlivá diagnostická metóda deteguje antigény už pri nízkych koncentráciách.

Hemaglutinačná reakcia (RGA).

V laboratóriu sa používajú dve rôzne hemaglutinačné reakcie.

Prvý RGA sa týka sérologického. Pri tejto reakcii dochádza k aglutinácii erytrocytov pri interakcii so zodpovedajúcimi protilátkami (hemaglutiníny). Reakcia sa široko používa na stanovenie krvných skupín.

Druhá RHA nie je sérologická. V ňom je spôsobená aglutinácia erytrocytov nie

protilátky, ale špeciálne látky tvorené vírusmi. Napríklad vírus chrípky aglutinuje kuracie erytrocyty a morčatá, vírus poliomyelitídy – ovčie erytrocyty. Táto reakcia umožňuje posúdiť prítomnosť konkrétneho vírusu v testovanom materiáli.

Reakcia sa uskutočňuje v skúmavkách alebo na špeciálnych platniach s jamkami. Materiál, ktorý sa má testovať na prítomnosť vírusu, sa zriedi izotonickým roztokom od 1:10 do 1:1280; 0,5 ml každého riedenia sa zmieša s rovnakým objemom 1-2% suspenzie erytrocytov. Pri kontrole sa zmieša 0,5 ml erytrocytov s 0,5 ml izotonického roztoku. Skúmavky sa umiestnia do termostatu na 30 minút a doštičky sa nechajú pri teplote miestnosti 45 minút.

Účtovanie výsledkov. O pozitívny výsledok reakciou na dne skúmavky alebo jamky padá zrazenina erytrocytov s vrúbkovanými okrajmi („dáždnik“), ktorá pokrýva celé dno jamky. O negatívny výsledok erytrocyty tvoria hustú zrazeninu s hladkými okrajmi ("tlačidlo"). Rovnaká zrazenina by mala byť pod kontrolou. Intenzita reakcie je vyjadrená znamienkami „+“.

Hemaglutinačná reakcia

Titer vírusu je maximálne zriedenie materiálu, v ktorom dochádza k aglutinácii.

Reakcia inhibície hemaglutinácie

Ide o sérologickú reakciu, pri ktorej špecifické antivírusové protilátky interagujúce s vírusom (antigénom) ho neutralizujú a zbavujú ho schopnosti aglutinovať červené krvinky, t.j. inhibovať hemaglutinačnú reakciu. Táto reakcia vám umožňuje určiť typ a typ vírusov.

Nastavenie reakcie. 0,25 ml antivírusového séra sa zmieša s rovnakým objemom materiálu obsahujúceho vírus. Zmes sa pretrepe a umiestni sa do termostatu na 30 minút, potom sa pridá 0,5 ml 1-2% suspenzie erytrocytov.

Účtovanie výsledkov. Pri správnom nastavení experimentu pri kontrole séra a erytrocytov by malo vzniknúť „gombík“ – neexistuje faktor aglutinujúci erytrocyty; v antigénovej kontrole vzniká „dáždnik“ – vírus spôsobil aglutináciu erytrocytov. Ak je sérum homológne so skúmaným vírusom, vytvorí sa "tlačidlo" - sérum neutralizovalo vírus.

Nepriama hemaglutinačná reakcia

Reakcia nepriamej (pasívnej) hemaglutinácie (RIHA) je založená na skutočnosti, že erytrocyty, ak je na ich povrchu adsorbovaný rozpustný antigén, získavajú schopnosť aglutinácie pri interakcii s protilátkami proti adsorbovanému antigénu.

Nastavenie reakcie. Sérum sa zahrieva 30 minút na 56 °C, zriedi sa postupne v pomere 1:10 - 1:1280 a naleje sa do skúmaviek alebo jamiek po 0,25 ml, kde sa potom pridajú 2 kvapky erytrocytov s adsorbovanými antigénmi.

Ovládanie: suspenzia erytrocytov s na nich adsorbovanými antigénmi s evidentne imúnnym sérom, suspenzia erytrocytov s na nich adsorbovanými antigénmi s normálnym sérom; suspenzia normálnych erytrocytov s testovaným sérom. Pri prvej kontrole by malo dôjsť k aglutinácii, pri druhej a tretej nie.

Kontrolné otázky.

1. Čo naznačuje pozitívny výsledok RGA medzi erytrocytmi a materiálom testovaným na prítomnosť vírusu?

2. Vznikne aglutinačná reakcia erytrocytov, ak sa k nim pridá vírus a jemu zodpovedajúce sérum? Ako sa volá reakcia, ktorá odhaľuje tento jav?

PRAKTICKÁ PRÁCA №12.

Reakcia väzby komplementu.

Reakcia väzby komplementu (RCT) je založená na skutočnosti, že špecifický komplex antigén-protilátka vždy adsorbuje (viaže) komplement na seba.

Táto reakcia je široko používaná pri identifikácii antigénov a sérodiagnostike infekcií, najmä chorôb spôsobených spirochétami (Wassermannova reakcia), rickettsiami a vírusmi.

PCS je komplexná sérologická reakcia. Zahŕňa komplement a dva systémy antigén-protilátka. V podstate ide o dve sérologické reakcie.

Pravo-základný systém pozostáva z antigénu a protilátky (jedna je známa, druhá nie). Pridáva sa k nemu určité množstvo komplementu. Ak sa antigén a protilátka tohto systému zhodujú, spoja sa a spoja kompliment. Výsledný komplex je jemne rozptýlený a nie je viditeľný.

Tvorba tohto komplexu je známa pomocou druhého hemolytického alebo indikátorového systému. Zahŕňa ovčie erytrocyty (antigén) a im zodpovedajúce hemolytické sérum (protilátka), t.j. hotový imunitný komplex. V tomto systéme môže k lýze erytrocytov dôjsť len v prítomnosti komplementu. Ak je komplement viazaný prvým systémom, potom nedôjde k hemolýze v druhom systéme; žiadny voľný doplnok. Ako pozitívny výsledok RSK sa zaznamenáva absencia hemolýzy (obsah skúmavky je zakalený alebo je na dne skúmavky sediment erytrocytov).

Ak v prvom systéme antigén nezodpovedá protilátke, potom sa imunitný komplex nevytvorí a kompliment zostane voľný. Zostávajúci voľný kompliment sa podieľa na druhom systéme, čo spôsobuje hemolýzu, výsledok RSK je negatívny (obsah skúmaviek je priehľadný - "laková krv").

Komponenty, reakcie fixácie komplementu:

1. Antigén - zvyčajne lyzát, extrakt, haptén,

menej často suspenzia mikroorganizmov.

2. Protilátka – sérum pacienta.

3. Doplnok - morčacie sérum.

4. Antigén – ovčie erytrocyty.

5. Protilátka - hemolyzín na ovčie erytrocyty.

6. Izotonický roztok.

Vzhľadom na to, že sa RSC zúčastňuje veľké množstvo zložité komponenty,

musia byť vopred titrované a vložené do reakcie v presných množstvách a v rovnakých objemoch: 0,5 alebo 0,25 ml, menej často 0,2, 1,25 alebo 1,0 ml (väčšie objemy poskytujú presnejší výsledok). Titrácia reakčných zložiek sa uskutočňuje v rovnakom objeme ako experiment, pričom chýbajúce zložky sa nahradia izotonickým roztokom.

Súvisiace informácie:

Vyhľadávanie na stránke:

Reakcia nepriamej alebo pasívnej hemaglutinácie (RNHA alebo RPHA) je citlivejšia a špecifickejšia ako aglutinačná reakcia. Táto reakcia sa tiež používa v dvoch smeroch.

1) Na detekciu protilátok v krvnom sére pacienta sa používajú erytrocytárne diagnostika, pri ktorých sa antigén adsorbuje na povrchu erytrocytov ošetrených tanínom. V súvislosti s touto reakciou sa častejšie používa termín RPHA.

Testované sérum sa zriedi v jamkách plastových platničiek a pridá sa erytrocytárne diagnosticum. Pri pozitívnej reakcii sa pozdĺž stien otvoru objaví tenký film vo forme "čipkového dáždnika", pri negatívnej reakcii sa objaví hustý sediment erytrocytov vo forme "gombíka".

2) Na detekciu toxínov a bakteriálnych antigénov v študovanom materiáli sa používajú protilátkové erytrocytové diagnosticum získané adsorpciou protilátok na erytrocytoch. V súvislosti s touto reakciou sa častejšie používa termín RNGA. Napríklad pomocou protilátkových diagnostik sa zisťuje morový bacilový antigén, difterický exotoxín, botulínový exotoxín.

Čo je diagnostika erytrocytov? Čo je to protilátková diagnostika erytrocytov?

Erytrocytové diagnosticum sú erytrocyty (ošetrené tanínom alebo formalínom) s antigénmi extrahovanými z baktérií, ktoré sú na nich adsorbované a používajú sa pri RPHA (pasívna hemaglutinačná reakcia). V prípade, že sa RPGA používa na detekciu antigénu v sekrétoch pacientov, v tkanivách atď., používajú sa "protilátkové diagnostická", t.j. erytrocyty senzibilizované protilátkami.

V RNGA sa protilátky v krvnom sére detegujú pomocou antigénneho erytrocytového diagnostika, ktorým sú erytrocyty s adsorbovanými antigénmi.

Technika nastavovania reakcií. Koaglutinačná reakcia.

- fixácia erytrocytov formaldehydom alebo glutarovými alebo akrylovými aldehydmi. Takto spracované erytrocyty sú dlhodobo skladované. Častejšie sa na tento účel používajú erytrocyty oviec, ľudí, kurčiat atď.;
— ošetrenie fixovaných erytrocytov roztokom tanínu. Výsledkom je, že erytrocyty nadobúdajú vlastnosť ireverzibilne adsorbovať proteíny (vírusy a protilátky) na svojom povrchu;
- senzibilizácia tanizovaných erytrocytov vírusmi alebo protilátkami.

Koaglutinačná reakcia (RCA)

Koaglutinačná reakcia sa používa na stanovenie antigénov pomocou protilátok adsorbovaných na proteín A buniek stafylokoka (antibody diagnosticum).
Proteín A má afinitu k Fc fragmentu imunoglobulínov, preto takéto baktérie ošetrené imunodiagnostickým sérom nešpecificky adsorbujú sérové protilátky, ktoré potom interagujú s aktívnymi centrami so zodpovedajúcimi mikróbmi izolovanými od pacientov. V dôsledku koagulácie sa vytvárajú vločky pozostávajúce zo stafylokokov, diagnostických sérových protilátok a mikróbu, ktorý sa určuje.

Aglutinačné séra: čo obsahujú; ako sa získavajú, na čo sa používajú; aký je titer aglutinačného séra?

Aglutinačné sérum sa získava imunizáciou králikov (intravenózne, subkutánne alebo intraperitoneálne) suspenziou usmrtených baktérií, počínajúc dávkou 200 miliónov, potom 500 miliónov, 1 miliardy, 2 miliárd mikrobiálnych teliesok v 1 ml, v intervaloch 5 dní. 7-8 dní po poslednej imunizácii sa odoberie krv a stanoví sa titer protilátok.

Titer aglutinačného séra je maximálne zriedenie séra, pri ktorom dochádza k aglutinácii s príslušným mikroorganizmom.

Aglutinačné séra sa používajú na identifikáciu mikróbov v rozšírenej aglutinačnej reakcii.

Hemaglutinačná reakcia (RHA)

Ak je skúmaný mikroorganizmus aglutinovaný sérom na titer alebo na polovičnú hodnotu titra, možno ho považovať za patriaci k druhu, ktorého názov je uvedený na štítku ampulky.

Aké sú rozdiely medzi polyvalentnými a monovalentnými (monoreceptorovými) aglutinačnými sérami; Prečo imunizácia králika mikróbmi jedného druhu produkuje sérum obsahujúce protilátky proti niekoľkým antigénom?

Monoreceptorové séra - séra obsahujúce protilátky len proti jednému antigénu a polyvalentné séra, ktoré spôsobujú aglutinačné reakcie s dvomi alebo tromi príbuznými baktériami, ktoré majú spoločný antigén. Aglutinačné séra sa používajú na identifikáciu mikroorganizmov v aglutinačnej reakcii. Nevýhodou takýchto sér je, že sú schopné poskytnúť skupinové aglutinačné reakcie, tk. obsahujú protilátky proti baktériám, ktoré majú spoločné antigény.

Hemaglutinačná reakcia. Popis a aplikácia

Vychádza zo skutočnosti, že erytrocyty, na ktorých sú vopred adsorbované antigény, získavajú schopnosť aglutinácie v prítomnosti homológnych sér (protilátok).

V tomto prípade erytrocyty zohrávajú úlohu nosičov so špecifickými determinantami, ktorých aglutinácia nastáva v dôsledku reakcie antigén + protilátka.

Erytrocyty, na ktorých povrchu sú pevne naviazané antigény, sa nazývajú erytrocytárne antigénne diagnosticum alebo erytrocyty senzibilizované antigénom.

Iný typ RNHA - protilátky sú adsorbované na povrchu erytrocytov a v prítomnosti homológneho antigénu dochádza k ich následnej aglutinácii. V tomto prípade sa takéto erytrocyty nazývajú erytrocyty protilátka diagnosticum alebo erytrocyty senzibilizované protilátkami.

Na základe týchto dvoch základných metodologických prístupov bolo vyvinutých a využívaných mnoho modifikácií RNGA. Ako nosiče sa teda používajú malé štandardné častice latexu. V tomto prípade sa reakcia nazýva latexová aglutinačná reakcia (RLA) alebo sa používa Staphylococcus aureus- koagulačná reakcia atď. Zvyčajne sa erytrocytové diagnostiky pripravujú v podnikoch biologického priemyslu a hlavné skúsenosti RNGA sú už inštalované v diagnostických laboratóriách.

Príprava diagnostiky erytrocytov zahŕňa nasledujúce kroky:

fixácia erytrocytov formaldehydom alebo glutarovými alebo akrylovými aldehydmi. Takto spracované erytrocyty sú dlhodobo skladované. Častejšie sa na tento účel používajú erytrocyty oviec, ľudí, kurčiat atď.;
ošetrenie fixovaných erytrocytov roztokom tanínu. Výsledkom je, že erytrocyty nadobúdajú vlastnosť ireverzibilne adsorbovať proteíny (vírusy a protilátky) na svojom povrchu;
senzibilizácia tanizovaných erytrocytov vírusmi alebo protilátkami.

Je potrebné poznamenať, že metódy prípravy erytrocytov diagnosticum pre vírusové infekcie rôzne.

Technika nastavenia RNHA na detekciu a stanovenie titra protilátok je nasledovná:

k následným 2-násobným riedeniam séra pridajte rovnaké dávky erytrocytov senzibilizovaných antigénom;
zmes sa nechá 2-3 hodiny pri teplote miestnosti alebo 16-18 hodín pri 4 °C;
brať do úvahy výsledky. Ak sérum obsahuje protilátky proti vírusu, ktorým boli erytrocyty senzibilizované, pozoruje sa hemaglutinácia, ktorá sa hodnotí krížením.

Titer sérových protilátok sa považuje za najvyššie riedenie séra, ktoré ešte poskytuje hemaglutináciu aspoň dvoma kríženiami.

RNGA sprevádzajú všetky príslušné kontroly. Zvyčajne dávajú reakciu mikrometódou.

RNHA umožňuje riešiť nasledujúce diagnostické úlohy:

detekovať protilátky a určiť ich titer v krvnom sére pomocou známeho erytrocytárneho antigénneho diagnostika;
detekovať a identifikovať neznámy vírus pomocou známeho erytrocytárneho diagnostika protilátok.

Výhody RNGA: vysoká citlivosť, jednoduchá technika nastavenia a rýchla odozva. Je však dôležité poznamenať, že pri príprave stabilných erytrocytových diagnostik sú veľké ťažkosti (veľká závislosť od čistoty použitých komponentov, nutnosť výberu spôsobu fixácie, tanizácie a senzibilizácie erytrocytov pre každý typ vírusu) .

Ak nájdete chybu, vyberte časť textu a stlačte Ctrl+Enter.

V kontakte s

hemaglutinačná inhibičná reakcia (HAIT)

RGA je založená na schopnosti erytrocytov držať sa spolu, keď sú na ne adsorbované určité antigény. Ako testovací materiál na hemaglutináciu sa používa alantoický, plodová voda, suspenzia chorionalantoických membrán kuracích embryí, suspenzie a extrakty z kultúr alebo orgánov zvierat infikovaných vírusmi, natívny infekčný materiál. RGA nie je sérologický, pretože sa vyskytuje bez účasti imunitného séra a používa sa na výber pracovného riedenia antigénu na nastavenie RTGA alebo prítomnosti antigénu (vírusu) v testovanom materiáli (napríklad pri chrípke). Reakcia využíva erytrocyty zvierat, vtákov, krvnú skupinu človeka I (0).

Na nastavenie približného RGA sa na podložné sklíčko nanesie kvapka 5 % suspenzie erytrocytov a kvapka testovaného materiálu, pričom sa dôkladne premieša. S pozitívnym výsledkom po 1-2 minútach makroskopicky pozorujte výskyt flokulentnej aglutinácie erytrocytov.

Na nastavenie RHA v expandovanom rade v jamkách polystyrénových platní sa pripravia dvojnásobne sa zvyšujúce riedenia testovaného materiálu vo fyziologickom roztoku v objeme 0,5 ml. Do všetkých skúmaviek pridajte 0,5 ml 0,25 - 1% suspenzie erytrocytov. Výsledky sa berú do úvahy po úplnej sedimentácii erytrocytov v kontrole (erytrocyty + fyziologický roztok). Reakcia sa berie do úvahy podľa charakteru sedimentu erytrocytov. V pozitívnych prípadoch je stupeň aglutinácie označený plusmi. Štyri plusy hodnotia reakciu, ktorá má formu tenkého filmu zlepených erytrocytov pokrývajúcich dno skúmavky (dáždnik), reakcia s medzerami vo filme je označená tromi plusmi, prítomnosť filmu s vrúbkovanými krajkovými okrajmi zlepených erytrocytov je označený dvoma plusmi, vločkovitý sediment erytrocytov obklopený zónou zlepených hrčiek erytrocytov zodpovedá jednému plus. Ostro ohraničený sediment erytrocytov, na nerozoznanie od kontroly, vykazuje absenciu aglutinácie. Titer sa berie ako limitné riedenie testovaného materiálu, ktoré spôsobilo aglutináciu erytrocytov dvoma plusmi.

S pozitívnym výsledkom RHA štúdia pokračuje stanovením typu izolovaného vírusu pomocou hemaglutinačného inhibičného testu s typovo špecifickými sérami.

RTGA je založená na vlastnosti antiséra potláčať vírusovú hemaglutináciu, keďže vírus neutralizovaný špecifickými protilátkami stráca schopnosť aglutinovať červené krvinky. Na približnú typizáciu vírusov sa používa metóda kvapky na sklo. Na konečné určenie typovej príslušnosti izolovaného vírusu a titráciu protilátok v sére sa expandovaný RTHA umiestni do skúmaviek alebo do jamiek. Na tento účel sa pripravia dvojnásobné riedenia séra vo fyziologickom roztoku a nalejú sa do 0,25 ml. K riedeniu séra sa pridá jedna kvapka materiálu obsahujúceho vírus a jedna kvapka 1 % suspenzie erytrocytov.

Pri použití RTGA na určenie typu vírusu sa používajú typovo špecifické séra, ktoré sa pridávajú do rovnakého objemu pracovného riedenia antigénu. Typová príslušnosť izolovaného vírusu je určená špecifickým imunitným sérom, ktoré vykazovalo najvyšší titer protilátok proti tomuto vírusu.

RGA a RTGA sa široko používajú na diagnostiku vírusových infekcií ( kliešťová encefalitída, chrípka a pod.) s cieľom zistiť špecifické protilátky a identifikovať mnohé vírusy podľa ich antigénov.

Imunofluorescenčná reakcia (RIF)

RIF je založený na kombinácii antigénov baktérií, rickettsie a vírusov so špecifickými protilátkami značenými fluorescenčnými farbivami (fluoresceín izotiokyanát, rodamín, B-izotiokyanit, lyssatinrodamín B-200, sulfochlorid atď.) s reaktívnymi skupinami (sulfochlorid, izotiokyanit atď. .). Tieto skupiny sa kombinujú s voľnými aminoskupinami molekúl protilátok, ktoré pri pôsobení fluorochrómu nestrácajú svoju špecifickú afinitu k zodpovedajúcemu antigénu. Výsledné AG-AT komplexy sa pod fluorescenčným mikroskopom stávajú jasne viditeľnými, jasne svietiacimi štruktúrami (obr. 48). RIF dokáže detekovať malé množstvá bakteriálnych a vírusových antigénov. Metóda RIF sa používa v dvoch verziách: priama a nepriama metóda.

Priama metóda je založená na priamom spojení antigénu so značenou protilátkou. nepriama metóda– o postupnej detekcii komplexu AG-AT pomocou fluorescenčných farbív. Prvý stupeň spočíva vo vytvorení imunitných komplexov určitého antigénu so špecifickými protilátkami. Druhou fázou je identifikácia tohto komplexu jeho ošetrením značeným antigamaglobulínom.

Výhodou RIF je jednoduchosť, vysoká citlivosť, rýchlosť získania výsledku. RIF sa používa ako metóda na včasnú expresnú diagnostiku chrípky, dyzentérie, malárie, moru, tularémie, syfilisu atď. Na uskutočnenie takejto štúdie sa používa luminiscenčný mikroskop.

Rádioimunoanalýza (RIA)

RIA je jednou z najcitlivejších metód imunodiagnostiky. Používa sa na detekciu antigénu vírusu hepatitídy B u pacientov vírusová hepatitída. Na tento účel sa do testovacieho séra pridá referenčné sérum (sérum obsahujúce protilátky proti vírusu hepatitídy B). Zmes sa inkubuje 1-2 dni pri teplote 40 °C, potom sa pridá referenčný antigén (antigén značený izotopom 125J) a inkubácia pokračuje ďalších 24 hodín. Do výsledného komplexu antigén-protilátka sa pridávajú precipitujúce antiimunoglobulíny proti referenčným sérovým proteínom, čo vedie k vytvoreniu zrazeniny (obr. 49). Výsledok sa berie do úvahy prítomnosťou a počtom impulzov v zrazenine zaznamenaných počítadlom. Ak je v testovacom sére antigén naviazaný na špecifické protilátky, tieto sa neviažu na značený antigén, a preto sa v precipitáte nezistí. RIA je teda založená na princípe kompetitívnej interakcie stanoveného antigénu a známeho množstva značeného antigénu s aktívnymi centrami protilátok.

Metóda ELISA (ELISA)

Metóda sa používa na detekciu antigénov pomocou ich zodpovedajúcich protilátok konjugovaných so značkovacím enzýmom (chrenová peroxidáza, b-galaktóza alebo alkalická fosfatáza). Po spojení antigénu s enzýmom značeným imunitným sérom sa do zmesi pridá substrát a chromogén. . Substrát je štiepený enzýmom a jeho produkty degradácie spôsobujú chemickú modifikáciu chromogénu. V tomto prípade chromogén mení svoju farbu – intenzita farby je priamo úmerná počtu naviazaných molekúl antigénu a protilátky (obr. 50).

Najbežnejšia je ELISA na pevnej fáze, pri ktorej je jedna zo zložiek imunitnej odpovede (antigén alebo protilátka) adsorbovaná na pevnom nosiči. Ako pevný nosič sa používajú polystyrénové mikropanely. Pri stanovení protilátok sa do jamiek s adsorbovaným antigénom postupne pridáva krvné sérum pacientov, antiglobulínové sérum značené enzýmom a zmes roztokov substrátu pre enzým a chromogén. Vždy po pridaní ďalšej zložky sa nenaviazané činidlá z jamiek odstránia dôkladným premytím. S pozitívnym výsledkom sa zmení farba roztoku chromogénu.

Nosič v tuhej fáze môže byť senzibilizovaný nielen antigénom, ale aj protilátkou. Potom sa požadovaný antigén zavedie do jamiek s adsorbovanými protilátkami, pridá sa imunitné sérum proti antigénu označenému enzýmom a potom sa pridá zmes substrátových roztokov pre enzým a chromogén.

ELISA sa používa na diagnostiku chorôb spôsobených vírusovými a bakteriálnymi patogénmi.

ODDIEL VII. ZÁKLADY VIROLÓGIE

S pozitívnym výsledkom RHA štúdia pokračuje stanovením typu izolovaného vírusu pomocou hemaglutinačného inhibičného testu s typovo špecifickými sérami.

RGA a RTGA sa široko používajú na diagnostiku vírusových infekcií (kliešťová encefalitída, chrípka atď.) s cieľom zistiť špecifické protilátky a identifikovať mnohé vírusy podľa ich antigénov.

Hemaglutinačná reakcia (RHA)

RGA je založená na skutočnosti, že niektoré druhy baktérií a vírusov majú schopnosť adsorbovať sa na povrchu červených krviniek. odlišné typy zvierat (a vtákov), čo spôsobuje, že sa zlepujú a vytvárajú aglutináty (priame RGA).

Adsorpcia antigénu (baktérie, vírusy) na povrchu erytrocytov sa nie vždy prejaví tvorbou viditeľnej zrazeniny; okrem toho je RGA nešpecifická, pretože erytrocyty rovnakého živočíšneho druhu môžu adsorbovať rôzne antigény.

Reakcia pasívnej (nepriamej) hemaglutinácie (RPHA) je špecifická. Na jeho nastavenie je predbežne pripravené erytrocytové diagnosticum (erytrocyty, na ktorých je adsorbovaný antigén). Na tento účel sa sterilne získa krv barana (alebo kohúta), defibrinuje sa a niekoľkokrát sa premyje vo fosfátovom tlmivom roztoku (pH 7,2) s použitím 3- až 5-násobnej centrifugácie. Supernatant sa odstráni, koncentrácia erytrocytov sa upraví na 2,5 % (1:40). K 2,5 % suspenzii erytrocytov sa v rovnakom objeme (1 ml alebo 0,5 ml) pridá suspenzia baktérií študovaných druhov mikróbov v koncentrácii 5 až 10 miliárd buniek na 1 ml. Erytrocyty ľahko adsorbujú antigén polysacharidovej povahy. Na adsorpciu antigénu proteínovej povahy sa erytrocyty vopred ošetria tanínom v riedení 1:20 000. Erytrocyty v kombinácii s pridaným antigénom sa nechajú na senzibilizáciu (adsorpciu) 2 hodiny v termostate (37 °C) , potom opäť centrifugujte pri 3-4 000 ot./min. počas 5 minút s roztokom fosfátového pufra (obr. 9.13).

Výsledné erytrocytárne diagnosticum sa vloží do skúmaviek (alebo jamiek v plexisklovej doske) a pridá sa k nemu štandardné imunitné sérum.

V pozitívnych prípadoch dôjde k RGA - úbytku erytrocytov vo forme charakteristického vločkovitého alebo zrnitého sedimentu rozloženého po celom povrchu dna skúmavky (hemaglutinát). To znamená, že typ študovaného mikróbu (antigénu) je špecifický pre protilátky imunoséra. V negatívnych prípadoch sa nezlepené červené krvinky usadia na dne vo forme malého rovnomerného kruhu.

Pre väčšiu spoľahlivosť výsledkov RPGA, oneskorenie reakcie(brzdenie) fenomén hemaglutinácie(RZGA) alebo jeho modifikácia - protilátková neutralizačná reakcia(RIA).

Ryža. 9.13. Pasívna hemaglutinačná reakcia (schéma): Er - erytrocyty: AG - antigén: AT - protilátka

Podstata RZGA spočíva v tom, že aglutinačná reakcia sa nastaví špecifickým diagnostickým sérom a testovaným antigénom (ako antigén sa používa študovaný typ mikróbov). Táto zmes sa udržuje 1-2 hodiny pri 37 °C, potom sa pridajú erytrocyty. Ak je testovaný antigén homológny s protilátkami diagnostického séra, dochádza k ich vzájomnej interakcii a pridané erytrocyty neaglutinujú – výsledok reakcie je pozitívny. Ak testovaný antigén nie je homológny so sérovými protilátkami alebo nie je obsiahnutý v materiáli, potom pridané erytrocyty adsorbujú antigén a vzniká RHA - výsledok RHA je negatívny, typ testovaného mikróbu (antigénu) nie je zistený.

Spôsob nastavenia PH A spočíva v tom, že odoberú rovnaké objemy a zmiešajú diagnostické imunitné sérum s rôznymi riedeniami testovaného materiálu (požadovaný antigén), nechajú ho v kontakte 1-2 hodiny a potom pridajú erytrocyty senzibilizované určitým (známym) antigénom špecifickým pre sérum protilátky (erytrocyty diagnosticum). Pri reakcii požadovaného antigénu so sérovými protilátkami dochádza k ich neutralizácii a pridané erytrocyty neaglutinujú, RHA nevzniká – výsledok PHA je pozitívny. Ak testovaný materiál neobsahuje antigén špecifický pre protilátky použitého séra, nedôjde k neutralizácii protilátok. Keď sa teda pridá erytrocytové diagnosticum, objaví sa aglutinácia erytrocytov (hemaglutinácia) a výsledok RHA je negatívny. Protilátkový neutralizačný test je vysoko citlivá metóda na detekciu antigénu nielen v suspenzii živých (alebo usmrtených) baktérií, ale aj v suspenzii mletého tkaniva. rôzne telá, natívne a horúce tajomstvá a výlučky chorého organizmu.

Vidalova reakcia. Od druhého týždňa ochorenia sa v krvi pacientov hromadia protilátky proti infekčnému agens. Na ich identifikáciu sa v aglutinačnej reakcii vyšetruje krvné sérum pacienta. Ako antigén sa používajú usmrtené kultúry Salmonella – diagnosticums.

Na nastavenie Vidalovej reakcie sa používa sérum pacienta, sada diagnostických súprav a izotonický roztok chloridu sodného.

Krv (2-3 ml) z pulpy prsta alebo loketnej žily sa odoberie do sterilnej skúmavky a dodá sa do laboratória. V laboratóriu sa skúmavka umiestni na 20-30 minút do termostatu, aby sa vytvorila zrazenina, potom sa zrazenina zakrúži Pasteurovou pipetou, aby sa oddelila od steny skúmavky, a umiestni sa do chladu na 30- 40 minút. Oddelené sérum sa odsaje a použije sa na nastavenie aglutinačnej reakcie s diagnostickými látkami zo salmonelového týfusu a paratýfu. Na získanie séra je možné krv odstrediť.

Keď dôjde k infekčnému procesu - brušnému týfusu alebo paratýfusu - v tele sa vytvárajú O- a H-protilátky proti antigénom patogénu s rovnakým názvom.

O-protilátky sa objavia ako prvé a pomerne rýchlo miznú. H-protilátky pretrvávajú dlhú dobu. To isté sa deje s očkovaním, takže pozitívna reakcia Vidal s O- a H-antigénmi indikuje prítomnosť ochorenia a reakcia len s H-antigénmi môže byť u chorých (anamnestická reakcia), ako aj u očkovaných (očkovanie). Na základe toho je Vidalova reakcia umiestnená oddelene s O- a H-antigénmi (diagnostika).

Keďže klinicky brušný týfus a paratýfus A a B sú podobné, potom sa na identifikáciu povahy ochorenia testuje sérum pacienta súčasne s diagnostickými vyšetreniami zo Salmonella týfusu a paratýfusu A a B.

Vidalova reakcia je široko používaná, pretože je jednoduchá a nevyžaduje špeciálne podmienky.

Reakciu je možné nastaviť dvoma spôsobmi: kvapka a objem (pozri kapitolu 12). V praxi sa častejšie používa volumetrická metóda. Pri nastavovaní lineárnej aglutinačnej reakcie by mal počet riadkov zodpovedať počtu antigénov (diagnosticum). Za pôvodcu ochorenia sa považuje mikroorganizmus, z ktorého bolo diagnostikum aglutinované sérom pacienta. Niekedy je zaznamenaná skupinová aglutinácia, pretože pôvodcovia týfusu a paratýfusu majú spoločné skupinové antigény. V tomto prípade sa výsledok reakcie v sérii, v ktorej je zaznamenaná aglutinácia pri väčšom zriedení séra, považuje za pozitívny (tabuľka 36).

Tabuľka 36. Možný výsledok aglutinačnej reakcie

Poznámka. V praxi sa Vidalova reakcia uvádza so štyrmi diagnostikami: brušný týfus „O“ a „H“ a paratýfus A a B – s diagnózami „OH“.

Ak sa aglutinácia vyskytuje iba v malých riedeniach séra - 1:100, 1:200, potom na odlíšenie reakcie v prípade ochorenia od očkovania alebo anamnestiky sa uchyľujú k opätovnému štádium aglutinačnej reakcie po 5-7 dňoch. U pacienta titer protilátok stúpa, ale u očkovaného alebo uzdraveného pacienta sa nemení. Zvýšenie titra protilátok v krvnom sére teda slúži ako indikátor ochorenia.

Vi-aglutiníny sa objavujú v krvi pacienta ako odpoveď na zavedenie patogénov týfusu, ktoré majú Vi-antigén do tela. Stanovujú sa od 2. týždňa choroby, ale ich titer zvyčajne nepresahuje 1:10. Detekcia Vi-protilátok je spojená s prítomnosťou týfusových patogénov v tele, preto má stanovenie týchto protilátok veľký epidemiologický význam, pretože umožňuje identifikovať bakteriálnych nosičov.

Vi-hemaglutinačná reakcia. Toto je najcitlivejšia reakcia na detekciu protilátok.

Princíp reakcie spočíva v tom, že ľudské (I. skupina) alebo ovčie erytrocyty môžu po špeciálnej úprave adsorbovať Vi-antigén na svojom povrchu a získať schopnosť aglutinácie s príslušnými Vi-protilátkami.

Erytrocyty s antigénmi adsorbovanými na povrchu sa nazývajú erytrocytové diagnosticum.

Na nastavenie Vi-hemaglutinačnej reakcie použite:

1) krvné sérum pacienta (1-2 ml); 2) erytrocyt Salmonella Vi diagnosticum; H) Vi-sérum; 4) O-sérum; 5) izotonický roztok chloridu sodného.

Reakcia sa umiestni do aglutinačných skúmaviek alebo do plastových platní s jamkami.

Krv sa pacientovi odoberá rovnakým spôsobom ako pri Vidalovej reakcii. Získajte sérum. Zo séra sa pripravia dvojnásobné sériové riedenia, počínajúc od 1:10 do 1:160.

Do jamky sa pridá 0,5 ml každého riedenia a pridá sa 0,25 ml erytrocytárneho diagnosticum. Reakčná zmes sa vloží do objemu 0,75 ml.

Kontroly sú: 1) štandardné aglutinačné monoreceptorové sérum + diagnosticum - reakcia musí byť pozitívna do sérového titra; 2) diagnosticum v izotonickom roztoku chloridu sodného (kontrola) - reakcia by mala byť negatívna.

Obsah jamiek sa dôkladne premieša, umiestni sa na 2 hodiny do termostatu a nechá sa pri izbovej teplote do nasledujúceho dňa (18-24 hodín).

Účtovníctvo začína kontrolou. Reakcia sa hodnotí v závislosti od stupňa diagnostickej aglutinácie.

Výsledky sa berú do úvahy podľa štvorkrížového systému:

Erytrocyty sú úplne aglutinované - sediment na dne otvoru vo forme "dáždnika";

+++ "dáždnik" je menší, nie všetky erytrocyty boli aglutinované;

++ "dáždnik" je malý, na dne otvoru je sediment neaglutinovaných erytrocytov;

Reakcia je negatívna; erytrocyty neaglutinovali a usadili sa na dne jamky vo forme gombíka.

Kontrolné otázky

1. V akom období ochorenia je diagnostikovaná Vidalova reakcia?

2. Aké zložky sú potrebné na uskutočnenie Vidalovej reakcie?

3. Aké diagnostické metódy sa používajú na Vidalovu reakciu?

4. Ktorá zo sérologických reakcií je najcitlivejšia pri diagnostike týfusových a paratýfových infekcií?

5. Aké diagnostické činidlo sa používa pri formulácii Vi-hemaglutinačnej reakcie?

6. Aké sérum sa používa na stanovenie prítomnosti Vi-antigénu v skúmanej kultúre?

7. Aký význam má definícia typu Vi-fág?

Od učiteľa odoberte O- a H-diagnostiku zo salmonelového týfusu, paratýfusu A a paratýfu B a séra pacienta. Dajte Vidalovu reakciu.

Živné médiá

Prostredia EMS, Ploskirev, bizmutovo-sulfitový agar vyrába medicínsky priemysel vo forme suchého prášku. Pripravujú sa podľa návodu na etikete: odváži sa určité množstvo prášku, zaleje sa primerané množstvo vody, uvarí sa a naleje do sterilných Petriho misiek.

Streda Russell. Do 950 ml destilovanej vody pridajte 40 g suchého živného média a pridajte 5 g živného agaru. Zahrejte do varu a rozpustite prášky. Rozpustite 1 g x v 50 ml destilovanej vody. hodiny glukózy a pridá sa k pripravenej zmesi. Médium sa naleje do sterilných skúmaviek s objemom 5-7 ml, sterilizuje sa prúdom pary (2 dni po 2 minúty) a skosí sa tak, aby zostal stĺpec. Rovnakým spôsobom sa pripraví Russellovo médium s manitolom a sacharózou.

Olkenitského médium zo suchého agaru. 2,5 g suchého živného agaru sa rozpustí v 100 ml destilovanej vody. Všetky ingrediencie uvedené v recepte (štítku) sa pridajú do agaru ochladeného na 50 °C. Médium naliate do skúmaviek sa sterilizuje prúdiacou parou (3 dni po 20 minút) a potom sa skosí. Hotové médium by malo mať svetloružovú farbu.