Reaksiyon vi hemaglütinasyon. Vi antijeni ile tifo ateşi için kan testi. Hemadsorpsiyon reaksiyonunun virolojisinde kullanım

Ana Sayfa → Analizler → İmmünolojik yöntem → Hemaglutinasyon reaksiyonları (immünolojik yöntem)

Aglütinasyon reaksiyonları reaktifin (antikorların), hücrelerin yüzeyinde bulunan antijenlerle veya yabancı partiküllerle etkileşimine dayanır. Sonuç olarak, çökelen ve çıplak gözle bile görülebilen büyük boyutlu kümeler oluşur. Böylece kan grubu ABO sistemine, içinde Rh faktörünün varlığına vb.

Direkt hemaglütinasyon

Direkt hemaglütinasyon testi (RPHA), mikroorganizmaların ve eritrositlerin yüzey antijenlerini ve bunlara karşı antikorları tespit etmek için kullanılır.
Test materyali (kan), antikor içeren standart seruma eklenir. Doğrudan aglütinasyon reaksiyonunun hızı, test materyalinin miktarı, serum miktarı ve konsantrasyonu ve ortam sıcaklığı ile ilişkilidir.

Dolaylı hemaglütinasyon

Dolaylı hemaglütinasyon reaksiyonu, bir eritrosit diagnostik kullanarak hastanın kanındaki antikorları tespit etmek için gerçekleştirilir. Reaktif, yüzeyinde bir antijenin bulunduğu (mikroorganizma proteinleri, toksinler, alerjenler, vb.) Eritrositlerdir.
Hastanın kan serumu %0,9'luk sodyum klorür solüsyonu ile dilüe edildikten sonra eritrosit diyagnostik eklenir ve sonuç izlenir. Bu son derece hassas teşhis yöntemi, düşük konsantrasyonlarda bile antijenleri saptar.

Hemaglutinasyon reaksiyonu (RGA).

Laboratuvarda iki farklı hemaglütinasyon reaksiyonu kullanılmaktadır.

İlk RGA serolojik anlamına gelir. Bu reaksiyonda eritrositler, karşılık gelen antikorlarla (hemaglutininler) etkileşime girdiklerinde aglütine olurlar. Reaksiyon, kan gruplarını belirlemek için yaygın olarak kullanılır.

İkinci RHA serolojik değildir. İçinde eritrositlerin aglütinasyonuna neden olmaz

antikorlar, ancak virüslerin oluşturduğu özel maddeler. Örneğin, influenza virüsü tavuk eritrositlerini aglütine eder ve kobaylar, çocuk felci virüsü - koyun eritrositleri. Bu reaksiyon, test materyalinde belirli bir virüsün varlığını yargılamayı mümkün kılar.

Reaksiyon, test tüplerinde veya kuyucuklu özel plakalarda gerçekleştirilir. Virüsün varlığı için test edilecek malzeme, 1:10'dan 1:1280'e kadar izotonik solüsyonla seyreltilir; Her dilüsyondan 0,5 ml eşit hacimde %1-2 eritrosit süspansiyonu ile karıştırılır. Kontrolde 0,5 ml eritrosit 0,5 ml izotonik solüsyon ile karıştırılır. Test tüpleri 30 dakika termostata konur ve plakalar 45 dakika oda sıcaklığında bırakılır.

Sonuçların muhasebesi.-de olumlu bir sonuç tüpün veya kuyunun dibinde reaksiyon oluşursa, kuyunun tüm dibini kaplayan, kenarları taraklı ("şemsiye") olan bir eritrosit çökeltisi düşer. -de olumsuz sonuç eritrositler, pürüzsüz kenarlı ("düğme") yoğun bir çökelti oluşturur. Aynı çökelti kontrol altında olmalıdır. Reaksiyonun yoğunluğu "+" işaretleri ile ifade edilir.

hemaglütinasyon reaksiyonu

Virüsün titresi, aglütinasyonun meydana geldiği malzemenin maksimum dilüsyonudur.

Hemaglutinasyon inhibisyon reaksiyonu

Bu, virüsle (antijen) etkileşime giren spesifik antiviral antikorların onu nötralize ettiği ve kırmızı kan hücrelerini aglütine etme, yani hemaglütinasyon reaksiyonunu inhibe etme yeteneğinden mahrum bıraktığı serolojik bir reaksiyondur. Bu reaksiyon, virüslerin türünü ve türünü belirlemenizi sağlar.

Reaksiyon ayarı. 0,25 ml antiviral serum, virüsü içeren eşit hacimdeki malzeme ile karıştırılır. Karışım çalkalanır ve 30 dakika termostata konur, ardından 0.5 ml %1-2 eritrosit süspansiyonu eklenir.

Sonuçların muhasebesi. Serum ve eritrositlerin kontrolünde deneyin doğru ayarlanmasıyla, bir "düğme" oluşmalıdır - eritrositleri aglütine eden hiçbir faktör yoktur; antijen kontrolünde bir "şemsiye" oluşur - virüs eritrosit aglütinasyonuna neden olur. Serum çalışılan virüsle homolog ise, bir "düğme" oluşur - serum virüsü nötralize etmiştir.

Dolaylı hemaglütinasyon reaksiyonu

Dolaylı (pasif) hemaglütinasyonun (RIHA) reaksiyonu, eritrositlerin, eğer çözünür bir antijen yüzeylerinde adsorbe edilirse, adsorbe edilmiş antijene karşı antikorlarla etkileşime girerken aglütine olma yeteneği kazanması gerçeğine dayanır.

Reaksiyon ayarı. Serum 56 °C'de 30 dakika ısıtılır, sırayla 1:10 - 1:1280 oranında seyreltilir ve 0,25 ml'lik test tüplerine veya kuyucuklara dökülür, ardından üzerine antijen adsorbe edilmiş 2 damla eritrosit eklenir.

Kontroller: açık bir şekilde bağışıklık serumu ile üzerlerine adsorbe edilmiş antijenler içeren bir eritrosit süspansiyonu, normal serum ile üzerlerine adsorbe edilmiş antijenler ile eritrositlerin bir süspansiyonu; test edilen serum ile normal eritrositlerin süspansiyonu. Birinci kontrolde aglütinasyon oluşmalı, ikinci ve üçüncü kontrolde olmamalıdır.

Test soruları.

1. Eritrositler ile virüsün varlığı için test edilen materyal arasında pozitif bir RGA sonucu neyi gösterir?

2. Bir virüs ve buna karşılık gelen serum eklenirse eritrosit aglütinasyon reaksiyonu meydana gelir mi? Bu fenomeni ortaya çıkaran reaksiyonun adı nedir?

UYGULAMALI ÇALIŞMA №12.

Tamamlayıcı bağlanma reaksiyonu.

Kompleman bağlama reaksiyonu (RCT), spesifik bir antijen-antikor kompleksinin komplemanı her zaman kendi üzerine adsorbe ettiği (bağladığı) gerçeğine dayanır.

Bu reaksiyon, antijenlerin tanımlanmasında ve enfeksiyonların, özellikle spiroketlerin (Wassermann reaksiyonu), riketsiyaların ve virüslerin neden olduğu hastalıkların serodiagnozunda yaygın olarak kullanılmaktadır.

PCS karmaşık bir serolojik reaksiyondur. Bir tamamlayıcı ve iki antijen-antikor sistemi içerir. Temel olarak, bunlar iki serolojik reaksiyondur.

Sağ temel sistem, bir antijen ve bir antikordan (biri bilinir, diğeri bilinmez) oluşur. İçine belirli bir miktarda tamamlayıcı eklenir. Bu sistemin antijeni ve antikoru eşleşirse bir iltifat bağlayacak ve bağlayacaklardır. Ortaya çıkan kompleks ince bir şekilde dağılmıştır ve gözle görülmez.

Bu kompleksin oluşumu, ikinci bir hemolitik veya gösterge sistemi yardımıyla bilinir. Koyun eritrositlerini (antijen) ve bunlara karşılık gelen hemolitik serumu (antikor), yani hazır bağışıklık kompleksi. Bu sistemde eritrosit lizisi ancak kompleman varlığında gerçekleşebilir. Tamamlayıcı birinci sistem tarafından bağlanırsa, ikinci sistemde hemoliz olmaz; ücretsiz tamamlayıcı yok. Hemoliz olmaması (tüp içeriği bulanık veya tüpün dibinde eritrosit sedimenti var) pozitif RSK sonucu olarak kaydedilir.

Birinci sistemde antijen antikora karşılık gelmiyorsa, o zaman bağışıklık kompleksi oluşmaz ve iltifat serbest kalır. Serbest kalan iltifat, ikinci sisteme katılarak hemolize neden olur, RSK'nin sonucu negatiftir (tüplerin içeriği şeffaftır - "lake kanı").

Bileşenler, tamamlayıcı fiksasyon reaksiyonları:

1. Antijen - genellikle bir lizat, ekstrakt, hapten,

daha az sıklıkla bir mikroorganizma süspansiyonu.

2. Antikor - hastanın serumu.

3. Tamamlayıcı - kobay serumu.

4. Antijen - koyun eritrositleri.

5. Antikor - koyun eritrositlerine hemolizin.

6. İzotonik çözelti.

RSC'nin katıldığı gerçeği ışığında çok sayıda karmaşık bileşenler,

bunlar önceden titre edilmeli ve reaksiyona tam miktarlarda ve eşit hacimlerde alınmalıdır: 0,5 veya 0,25 ml, nadiren 0,2,1,25 veya 1,0 ml (daha büyük hacimler daha doğru sonuç verir). Reaksiyon bileşenlerinin titrasyonu, deneyle aynı hacimde gerçekleştirilir ve eksik bileşenler izotonik bir çözelti ile değiştirilir.

İlgili bilgi:

site araması:

Dolaylı veya pasif hemaglutinasyon reaksiyonu (RNHA veya RPHA), aglütinasyon reaksiyonundan daha hassas ve spesifiktir. Bu reaksiyon da iki şekilde kullanılır.

1) Hastanın kan serumundaki antikorları saptamak için, antijenin tanenle işlenmiş eritrositlerin yüzeyinde adsorbe edildiği eritrosit diagnostikleri kullanılır. Bu reaksiyonla ilgili olarak, RPHA terimi daha sık kullanılır.

Test serumu, plastik plakaların kuyularında seyreltilir ve eritrosit diagnostik eklenir. Pozitif bir reaksiyonla, deliğin duvarları boyunca "dantel şemsiye" şeklinde ince bir film belirir, negatif bir reaksiyonla, "düğme" şeklinde yoğun bir eritrosit tortusu belirir.

2) İncelenen materyaldeki toksinleri ve bakteriyel antijenleri saptamak için, antikorların eritrositler üzerine adsorpsiyonu ile elde edilen antikor eritrosit diagnostikleri kullanılır. Bu reaksiyonla ilgili olarak, RNGA terimi daha sık kullanılır. Örneğin, antikor diagnostikleri yardımıyla veba basili antijeni, difteri ekzotoksini, botulinum ekzotoksini saptanır.

Eritrosit tanı nedir? Antikor eritrosit tanı nedir?

Eritrosit tanılayıcılar, üzerlerinde adsorbe edilmiş bakterilerden ekstrakte edilmiş antijenlere sahip eritrositlerdir (tanen veya formalin ile işlenmiş) ve RPHA'da (pasif hemaglutinasyon reaksiyonu) kullanılır. RPGA'nın hastaların salgılarında, dokularda vb. bir antijeni tespit etmek için kullanıldığı durumda, "antikor diagnostikleri", yani antikorlarla duyarlı hale getirilmiş eritrositler kullanılır.

RNGA'da, kan serumu antikorları, üzerlerinde adsorbe edilmiş antijenlere sahip eritrositler olan bir antijenik eritrosit diagnostikum kullanılarak saptanır.

Sertleşme reaksiyonları tekniği. Pıhtılaşma reaksiyonu.

- eritrositlerin formaldehit veya glutarik veya akrilik aldehitlerle fiksasyonu. Bu tür işlenmiş eritrositler uzun süre saklanır. Daha sıklıkla koyun, insan, tavuk vb. eritrositler bu amaçla kullanılır;
— sabit eritrositlerin tanen solüsyonu ile tedavisi. Sonuç olarak eritrositler, yüzeylerinde geri dönüşümsüz olarak proteinleri (virüsler ve antikorlar) adsorbe etme özelliğini kazanır;
- Tanize eritrositlerin virüsler veya antikorlar tarafından hassaslaştırılması.

Pıhtılaşma reaksiyonu (RCA)

Pıhtılaşma reaksiyonu, stafilokok hücrelerinin protein A'sı (antikordiagnostikum) üzerinde adsorbe edilen antikorları kullanarak antijenleri belirlemek için kullanılır.
Protein A, immünoglobulinlerin Fc fragmanı için bir afiniteye sahiptir; bu nedenle, immün teşhis serumu ile tedavi edilen bu tür bakteriler, spesifik olmayan şekilde serum antikorlarını adsorbe eder ve bunlar daha sonra hastalardan izole edilen karşılık gelen mikroplarla aktif merkezlerle etkileşime girer. Pıhtılaşmanın bir sonucu olarak, stafilokoklardan oluşan pullar, teşhis serum antikorları ve tespit edilen mikrop oluşur.

Aglütinasyon serumları: ne içerirler; nasıl elde edildikleri, ne için kullanıldıkları; aglütinasyon serumunun titresi nedir?

Aglütinasyon serumu, tavşanlara (intravenöz, subkutan veya intraperitoneal) öldürülmüş bakteri süspansiyonu ile 5 gün aralıklarla 1 ml'de 200 milyon, ardından 500 milyon, 1 milyar, 2 milyar mikrobiyal cisimciği içeren bir dozla başlanarak elde edilir. Son aşılamadan 7-8 gün sonra kan alınarak antikor titresi belirlenir.

Aglütinasyon serumunun titresi, karşılık gelen mikroorganizma ile aglütinasyonun meydana geldiği maksimum serum dilüsyonudur.

Aglütinasyon serumları, uzun süreli aglütinasyon reaksiyonunda bir mikrobun tanımlanmasında kullanılır.

Hemaglutinasyon reaksiyonu (RHA)

İncelenen mikroorganizma serumla bir titreye veya titre değerinin yarısına kadar aglütine edilirse, adı ampul etiketinde belirtilen türe ait olarak kabul edilebilir.

Polivalan ve monovalan (monoreseptör) aglütine edici serumlar arasındaki farklar nelerdir; Bir tavşanın bir türün mikropları ile aşılanması neden birkaç antijene karşı antikor içeren bir serum üretir?

Monoreseptör sera - yalnızca bir antijene karşı antikorlar içeren serumlar ve ortak bir antijene sahip iki veya üç ilgili bakteri ile aglütinasyon reaksiyonları veren polivalan serumlar. Aglütinasyon serumları, aglütinasyon reaksiyonundaki mikroorganizmaları tanımlamak için kullanılır. Bu tür serumların dezavantajı, grup aglütinasyon reaksiyonları verebilmeleridir, tk. ortak antijenlere sahip bakterilere karşı antikorlar içerirler.

Hemaglutinasyon reaksiyonu. Açıklama ve uygulama

Antijenlerin önceden adsorbe edildiği eritrositlerin, homolog serumların (antikorların) varlığında aglütine olma yeteneği kazanmasına dayanır.

Bu durumda eritrositler, aglütinasyonu antijen + antikor reaksiyonunun bir sonucu olarak meydana gelen spesifik belirleyicilere sahip taşıyıcıların rolünü oynar.

Yüzeylerine antijenlerin sıkıca tutunduğu eritrositler, eritrosit antijenik tanı veya antijen tarafından duyarlı hale getirilen eritrositler olarak adlandırılır.

Başka bir RNHA tipi - antikorlar, eritrositlerin yüzeyinde adsorbe edilir ve ardından bunların aglütinasyonu, homolog bir antijen varlığında meydana gelir. Bu durumda, bu tür eritrositlere eritrosit antikor tanısal veya antikorlar tarafından duyarlı hale getirilmiş eritrositler denir.

Bu iki temel metodolojik yaklaşım temelinde, RNGA'nın birçok modifikasyonu geliştirilmiştir ve kullanılmaktadır. Bu nedenle, küçük standart lateks parçacıkları taşıyıcı olarak kullanılır. Bu durumda reaksiyona lateks aglütinasyon reaksiyonu (RLA) denir veya kullanılır. Stafilokok aureus- pıhtılaşma reaksiyonu vb. Genellikle eritrosit diagnostikleri biyolojik endüstrinin işletmelerinde hazırlanır ve RNGA'nın ana deneyimi zaten teşhis laboratuvarlarında kuruludur.

Eritrosit diagnostiklerinin hazırlanması aşağıdaki adımları içerir:

eritrositlerin formaldehit veya glutarik veya akrilik aldehitlerle fiksasyonu. Bu tür işlenmiş eritrositler uzun süre saklanır. Daha sıklıkla koyun, insan, tavuk vb. eritrositler bu amaçla kullanılır;
sabit eritrositlerin tanen solüsyonu ile tedavisi. Sonuç olarak eritrositler, yüzeylerinde geri dönüşümsüz olarak proteinleri (virüsler ve antikorlar) adsorbe etme özelliğini kazanır;
Tanize eritrositlerin virüsler veya antikorlar tarafından hassaslaştırılması.

Eritrosit diagnostiklerinin hazırlanma yöntemlerinin viral enfeksiyonlar farklı.

Antikor titresini saptamak ve belirlemek için RNHA'yı kurma tekniği aşağıdaki gibidir:

ardışık 2 kat serum dilüsyonlarına, antijen tarafından duyarlı hale getirilmiş eşit dozlarda eritrosit ekleyin;
karışım 2-3 saat oda sıcaklığında veya 16-18 saat 4°C'de bırakılır;
sonuçları dikkate alın. Serum, eritrositlerin duyarlılaştırıldığı virüse karşı antikorlar içeriyorsa, çaprazlarda değerlendirilen hemaglütinasyon gözlenir.

Serum antikor titresi, en az iki çapraz ile hala hemaglutinasyon sağlayan serumun en yüksek dilüsyonu olarak alınır.

RNGA'ya ilgili tüm kontroller eşlik eder. Genellikle reaksiyonu mikro yöntemle koyarlar.

RNHA, aşağıdaki teşhis görevlerinin çözülmesine izin verir:

bilinen bir eritrosit antijenik diagnostik kullanarak antikorları saptamak ve kan serumundaki titrelerini belirlemek;
bilinen bir eritrosit antikoru tanılama aracını kullanarak bilinmeyen bir virüsü tespit edin ve tanımlayın.

RNGA'nın avantajları: yüksek hassasiyet, ayar tekniği kolaylığı ve hızlı yanıt. Bununla birlikte, stabil eritrosit diagnostiklerinin hazırlanmasında büyük zorluklar olduğuna dikkat etmek önemlidir (kullanılan bileşenlerin saflığına büyük bağımlılık, her virüs türü için eritrositlerin fiksasyon, tanenleşme ve hassaslaşma modunu seçme ihtiyacı) .

Bir hata bulursanız, lütfen bir metin parçası seçin ve Ctrl+Enter tuşlarına basın.

Temas halinde

hemaglütinasyon inhibisyon reaksiyonu (HAIT)

RGA, eritrositlerin belirli antijenler üzerlerine adsorbe edildiğinde birbirine yapışma yeteneğine dayanır. Hemaglutinasyon için test materyali olarak allantoik, amniyotik sıvı, tavuk embriyolarının korionallantoik membranlarının süspansiyonu, virüslerle enfekte hayvanların kültürlerinden veya organlarından süspansiyonlar ve ekstraktlar, doğal enfeksiyöz materyal kullanılır. RGA serolojik değildir, çünkü bağışıklık serumunun katılımı olmadan gerçekleşir ve RTGA'yı ayarlamak için antijenin çalışma seyreltmesini veya test materyalinde (örneğin, influenza ile) bir antijenin (virüs) varlığını seçmek için kullanılır. Reaksiyon, hayvanların, kuşların, insan I (0) kan grubunun eritrositlerini kullanır.

Yaklaşık bir RGA oluşturmak için, bir damla %5 eritrosit süspansiyonu ve bir damla test materyali bir cam slayta uygulanır ve iyice karıştırılır. Pozitif bir sonuçla, 1-2 dakika sonra, eritrositlerin topaklaşmış aglütinasyonunun görünümünü makroskopik olarak gözlemleyin.

RHA'yı polistiren plakaların oyuklarında genişletilmiş bir sıra halinde ayarlamak için, test malzemesinin 0.5 ml'lik bir hacimde fizyolojik bir çözelti içinde iki kat artan seyreltileri hazırlanır. Tüm tüplerde 0.5 ml %0.25 - %1 eritrosit süspansiyonu eklenir. Sonuçlar, kontrolde (eritrositler + salin) eritrositlerin tamamen çökelmesinden sonra dikkate alınır. Reaksiyon, eritrosit tortusunun doğası gereği dikkate alınır. Pozitif vakalarda aglütinasyon derecesi artılarla işaretlenmiştir. Dört artı, test tüpünün (şemsiye) tabanını kaplayan ince bir yapıştırılmış eritrosit filmi şeklindeki reaksiyonu değerlendirir, filmdeki boşluklarla reaksiyon üç artı ile işaretlenir, kenarları fistolu dantelli bir filmin varlığı Yapıştırılmış eritrositlerin sayısı iki artı ile gösterilir, bir aglütine eritrosit yumruları bölgesi ile çevrelenmiş pul pul eritrosit tortusu bir artıya karşılık gelir. Kontrolden ayırt edilemeyen keskin bir şekilde tanımlanmış bir eritrosit tortusu, aglütinasyonun olmadığını gösterir. Titre, iki artı eritrosit aglütinasyonuna neden olan test materyalinin sınırlayıcı seyreltmesi olarak alınır.

RHA'nın pozitif sonucu ile, türe özgü serumlarla hemaglütinasyon inhibisyon testi kullanılarak izole edilen virüsün türünün belirlenmesiyle çalışmaya devam edilir.

RTGA, antiserumun viral hemaglütinasyonu baskılama özelliğine dayanır, çünkü spesifik antikorlar tarafından nötralize edilen virüs, kırmızı kan hücrelerini aglütine etme yeteneğini kaybeder. Virüslerin yaklaşık tiplenmesi için cam üzerine damla yöntemi kullanılır. İzole edilen virüsün tip bağlantısının nihai olarak belirlenmesi ve serumdaki antikorların titrasyonu için, test tüplerine veya kuyucuklara genişletilmiş bir RTHA yerleştirilir. Bu amaçla serum fizyolojik içinde iki kat dilüsyonlar hazırlanır ve 0,25 ml'ye dökülür. Serum seyreltilerine bir damla virüs içeren materyal ve bir damla %1 eritrosit süspansiyonu eklenir.

Virüs tipini belirlemek için RTGA kullanıldığında, antijenin çalışma seyreltisinin eşit hacmine eklenen tipe özgü serumlar kullanılır. İzole edilen virüsün tip bağlantısı, bu virüse karşı en yüksek antikor titresini gösteren spesifik bağışıklık serumu tarafından belirlenir.

RGA ve RTGA, viral enfeksiyonları teşhis etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. kene kaynaklı ensefalit, influenza, vb.) spesifik antikorları tespit etmek ve birçok virüsü antijenlerine göre tanımlamak için kullanılır.

İmmünofloresan reaksiyonu (RIF)

RIF, bakteri, riketsiya ve virüs antijenlerinin, reaktif gruplara (sülfoklorür, izotiyosiyanit, vb.) sahip floresan boyalarla (floresan izotiyosiyanat, rodamin, B-izotiyosiyanit, lizatinrhodamin B-200, sülfoklorür, vb.) etiketlenmiş spesifik antikorlarla kombinasyonuna dayanır. .) . Bu gruplar, bir florokrom ile işlendiğinde karşılık gelen antijene yönelik spesifik afinitelerini kaybetmeyen antikor moleküllerinin serbest amino gruplarıyla birleşir. Ortaya çıkan AG-AT kompleksleri, bir flüoresan mikroskobu altında açıkça görülebilen, parlak ışıklı yapılar haline gelir (Şekil 48). RIF, küçük miktarlarda bakteriyel ve viral antijenleri tespit edebilir. RIF yöntemi iki versiyonda kullanılır: doğrudan ve dolaylı yöntem.

Doğrudan yöntem, bir antijenin etiketli bir antikorla doğrudan ilişkisine dayanır. dolaylı yöntem– AG-AT kompleksinin flüoresan boyalar kullanılarak aşamalı olarak saptanmasında. İlk aşama, belirli bir antijenin belirli antikorlarla bağışıklık komplekslerinin oluşumundan oluşur. İkinci aşama, bu kompleksi etiketli antigamaglobulin ile tedavi ederek tanımlamaktır.

RIF'in avantajı basitlik, yüksek hassasiyet, sonuç elde etme hızıdır. RIF, grip, dizanteri, sıtma, veba, tularemi, frengi vb. hastalıkların erken ve hızlı teşhisi için bir yöntem olarak kullanılır. Böyle bir çalışmayı yürütmek için bir lüminesan mikroskop kullanılır.

Radyoimmünoassay (RIA)

RIA, immünodiagnostiklerin en hassas yöntemlerinden biridir. Hastalarda hepatit B virüsünün antijenini tespit etmek için kullanılır. viral hepatit. Bunu yapmak için test serumuna referans serum (hepatit B virüsüne karşı antikorlar içeren serum) eklenir. Karışım 1-2 gün 40 0C sıcaklıkta inkübe edilir, ardından referans antijen (125 J izotop ile işaretlenmiş bir antijen) eklenir ve 24 saat daha inkübasyona devam edilir. Referans serum proteinlerine karşı çökelen antiimmünoglobülinler, oluşan antijen-antikor kompleksine eklenir ve bu da bir çökelti oluşumuna yol açar (Şekil 49). Sonuç, sayaç tarafından kaydedilen çökeltideki darbelerin varlığı ve sayısı ile dikkate alınır. Test serumunda spesifik antikorlara bağlı bir antijen varsa, ikincisi işaretli antijene bağlanmaz ve bu nedenle çökeltide saptanmaz. Bu nedenle, RIA, belirlenen antijenin ve bilinen miktarda işaretlenmiş antijenin, antikorların aktif merkezleri ile rekabetçi etkileşimi ilkesine dayanmaktadır.

ELISA yöntemi (ELISA)

Yöntem, bir etiketleme enzimi (yaban turpu peroksidaz, b-galaktoz veya alkalin fosfataz) ile konjüge edilmiş karşılık gelen antikorları kullanarak antijenleri saptamak için kullanılır. Antijen, enzim etiketli immün serum ile birleştirildikten sonra, karışıma substrat ve kromojen eklenir. . Substrat enzim tarafından parçalanır ve bozunma ürünleri kromojenin kimyasal modifikasyonuna neden olur. Bu durumda, kromojen rengini değiştirir - renk yoğunluğu, bağlı antijen ve antikor moleküllerinin sayısı ile doğru orantılıdır (Şekil 50).

En yaygın olanı, bağışıklık tepkisinin bileşenlerinden birinin (antijen veya antikor) katı bir taşıyıcı üzerine adsorbe edildiği katı fazlı ELISA'dır. Katı taşıyıcı olarak polistiren mikropaneller kullanılmaktadır. Antikorları belirlerken, hastaların kan serumu, bir enzimle işaretlenmiş antiglobulin serumu ve enzim ve kromojen için substrat çözeltilerinin bir karışımı, adsorbe edilmiş antijen ile kuyucuklara sırayla eklenir. Bir sonraki bileşenin eklenmesinden sonra her defasında, bağlanmamış reaktifler iyice yıkanarak kuyulardan çıkarılır. Olumlu bir sonuçla kromojen çözeltisinin rengi değişir.

Katı fazlı bir taşıyıcı, yalnızca bir antijenle değil, aynı zamanda bir antikorla da duyarlı hale getirilebilir. Daha sonra adsorbe edilmiş antikorlar ile kuyucuklara istenen antijen verilir, enzimle işaretlenmiş antijene karşı immün serum eklenir ve ardından enzim ve kromojen için substrat çözeltileri karışımı eklenir.

ELISA, viral ve bakteriyel patojenlerin neden olduğu hastalıkları teşhis etmek için kullanılır.

BÖLÜM VII. VİROLOJİNİN TEMELLERİ

RHA'nın pozitif sonucu ile, türe özgü serumlarla hemaglütinasyon inhibisyon testi kullanılarak izole edilen virüsün türünün belirlenmesiyle çalışmaya devam edilir.

RGA ve RTGA, viral enfeksiyonların (kene kaynaklı ensefalit, grip vb.) tanısında, spesifik antikorları tespit etmek ve birçok virüsü antijenleriyle tanımlamak için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Hemaglutinasyon reaksiyonu (RHA)

RGA, bazı bakteri ve virüs türlerinin kırmızı kan hücrelerinin yüzeyinde adsorbe olma yeteneğine sahip olduğu gerçeğine dayanmaktadır. farklı şekiller hayvanların (ve kuşların) birbirine yapışmasına ve aglütinat oluşturmasına neden olur (doğrudan RGA).

Eritrositlerin yüzeyinde bir antijenin (bakteriler, virüsler) adsorpsiyonu her zaman görünür bir çökelti oluşumu ile kendini göstermez; ayrıca, aynı hayvan türüne ait eritrositler farklı antijenleri adsorbe edebildiğinden, RGA spesifik değildir.

Pasif (dolaylı) hemaglütinasyonun (RPHA) reaksiyonu spesifiktir. Ayarı için, ön olarak bir eritrosit tanılama hazırlanır (antijenin adsorbe edildiği eritrositler). Bu amaçla, koç (veya horoz) kanı steril olarak elde edilir, defibrine edilir ve 3-5 kat santrifüj kullanılarak bir fosfat tampon çözeltisinde (pH 7.2) birkaç kez yıkanır. Süpernatan çıkarılır, eritrosit konsantrasyonu %2.5'e (1:40) ayarlanır. Eritrositlerin %2,5 süspansiyonuna eşit hacimde (1 mi veya 0,5 mi) 1 ml'de 5-10 milyar hücre konsantrasyonunda çalışılan mikrop türlerinin bir bakteri süspansiyonu eklenir. Eritrositler, bir polisakarit yapısının antijenini kolayca adsorbe eder. Protein yapısındaki antijeni adsorbe etmek için eritrositler, 1:20.000 seyreltmede tanen ile ön işleme tabi tutulur Eritrositler, eklenen antijenle kombinasyon halinde bir termostatta (37 ° C) 2 saat duyarlılaştırma (adsorpsiyon) için bırakılır. , daha sonra fosfat tampon solüsyonu ile 3-4 bin rpm/dk'da 5 dk tekrar santrifüj edildi (Şekil 9.13).

Ortaya çıkan eritrosit diagnostikum test tüplerine (veya bir pleksiglas panodaki kuyucuklara) yerleştirilir ve buna standart immün serum eklenir.

Pozitif durumlarda, RGA meydana gelir - test tüpünün tabanının tüm yüzeyine dağılmış karakteristik bir pul pul veya granüler tortu (hemaglutinat) şeklinde eritrosit kaybı. Bu, incelenmekte olan mikrop tipinin (antijen) immün serum antikorlarına özgü olduğu anlamına gelir. Negatif durumlarda, yapıştırılmamış kırmızı kan hücreleri küçük, eşit bir daire şeklinde dibe yerleşir.

RPGA sonuçlarının daha fazla güvenilirliği için, gecikme tepkisi(frenleme) hemaglütinasyon fenomeni(RZGA) veya modifikasyonu - antikor nötralizasyon reaksiyonu(RIA).

Pirinç. 9.13. Pasif hemaglütinasyon reaksiyonu (şema): Er - eritrositler: AG - antijen: AT - antikor

RZGA'nın özü aglütinasyon reaksiyonunun spesifik bir teşhis serumu ve test edilen antijen (incelenen mikrop türü bir antijen olarak kullanılır) ile ayarlanması gerçeğinden oluşur. Bu karışım 37°C'de 1-2 saat bekletildikten sonra eritrositler eklenir. Test antijeni tanısal serum antikorları ile homolog ise, bunlar birbirleriyle etkileşime girer ve eklenen eritrositler aglütine olmaz - reaksiyonun sonucu pozitiftir. Test antijeni serum antikorlarına homolog değilse veya materyalde bulunmuyorsa, eklenen eritrositler antijeni adsorbe eder ve RHA oluşur - RHA sonucu negatiftir, test edilen mikrop (antijen) tipi belirlenmemiştir.

PH A'yı ayarlama yöntemi eşit hacimlerde almaları ve tanısal bağışıklık serumunu test materyalinin (istenen antijen) çeşitli dilüsyonlarıyla karıştırmaları, 1-2 saat temas için bırakmaları, ardından seruma özgü belirli (bilinen) bir antijenle duyarlı hale getirilmiş eritrositleri eklemeleridir. antikorlar (eritrosit diagnostik). İstenen antijen serum antikorları ile reaksiyona girdiğinde nötralize olurlar ve eklenen eritrositler aglütine olmaz, RHA oluşmaz - PHA sonucu pozitiftir. Test materyali, kullanılan serumun antikorlarına özgü bir antijen içermiyorsa, antikorların nötralizasyonu olmayacaktır. Bu nedenle eritrosit diagnostikum eklendiğinde eritrosit aglütinasyonu (hemaglütinasyon) ortaya çıkar ve RHA sonucu negatiftir. Antikor nötralizasyon testi, antijeni yalnızca canlı (veya öldürülmüş) bakterilerin bir süspansiyonunda değil, aynı zamanda bir zemin dokusu süspansiyonunda da saptamak için oldukça hassas bir yöntemdir. çeşitli organlar, hasta bir organizmanın yerli ve hararetli sırları ve dışkıları.

hayati reaksiyon. Hastalığın ikinci haftasından itibaren hastaların kanında enfeksiyöz ajana karşı antikorlar birikir. Bunları belirlemek için hastanın kan serumu aglütinasyon reaksiyonunda incelenir. Öldürülmüş Salmonella kültürleri -diagnostikumlar- antijen olarak kullanılır.

Vidal reaksiyonunu oluşturmak için hastanın serumu, bir dizi teşhis kiti ve izotonik sodyum klorür çözeltisi kullanılır.

Parmak özünden veya kübital venden alınan kan (2-3 ml) steril bir tüpe alınır ve laboratuvara gönderilir. Laboratuarda test tüpü termostatta 20-30 dakika pıhtı oluşması için bekletilir, ardından pıhtı Pasteur pipeti ile çevrelenerek test tüpünün duvarından ayrılır ve 30-30-30 dakika soğukta bekletilir. 40 dakika. Ayrılan serum emilir ve salmonella tifo ve paratifoitten teşhislerle bir aglütinasyon reaksiyonu oluşturmak için kullanılır. Serum elde etmek için kan santrifüjlenebilir.

Enfeksiyöz bir süreç meydana geldiğinde - tifo ateşi veya paratifo ateşi - vücutta aynı isimli patojen antijenlere karşı O- ve H-antikorları üretilir.

O-antikorları önce görünür ve oldukça hızlı bir şekilde kaybolur. H-antikorları uzun süre devam eder. Aynı şey aşılamada da olur, yani olumlu tepki O- ve H-antijenleri ile Vidal, bir hastalığın varlığını gösterir ve yalnızca H-antijenleri ile bir reaksiyon, hem hasta olanlarda (anamnestik reaksiyon) hem de aşılanmış olanlarda (aşılama) olabilir. Buna dayanarak, Vidal reaksiyonu, O- ve H-antijenleri (teşhis) ile ayrı ayrı yerleştirilir.

Klinik olarak Tifo ve paratifoid A ve B benzerse, hastalığın doğasını belirlemek için hastanın serumu, Salmonella tifo ve paratifoid A ve B'den elde edilen teşhislerle eş zamanlı olarak test edilir.

Vidal reaksiyonu, basit olması ve özel koşullar gerektirmemesi nedeniyle yaygın olarak kullanılmaktadır.

Reaksiyonu kurmanın iki yolu vardır: damla ve hacim (bkz. Bölüm 12). Uygulamada, hacimsel yöntem daha sık kullanılır. Doğrusal bir aglütinasyon reaksiyonu kurarken, sıra sayısı antijen sayısına (diagnosticum) karşılık gelmelidir. Hastalığa neden olan ajanın, tanı maddesinin hastanın serumu tarafından aglütine edildiği bir mikroorganizma olduğu kabul edilir. Tifo ve paratifoid ateşin nedensel ajanları ortak grup antijenlerine sahip olduğundan, bazen grup aglütinasyonu not edilir. Bu durumda daha fazla serum dilüsyonunda aglütinasyonun kaydedildiği serideki reaksiyon sonucu pozitif kabul edilir (Tablo 36).

Tablo 36. Aglütinasyon reaksiyonunun olası sonucu

Not. Uygulamada, Vidal reaksiyonu dört teşhis ile konur: tifo ateşi "O" ve "H" ve paratifoid A ve B - teşhis "OH" ile.

Aglütinasyon sadece küçük serum dilüsyonlarında - 1:100, 1:200 meydana gelirse, o zaman bir hastalık durumunda reaksiyonu aşılama veya anamnestikten ayırt etmek için, aglütinasyon reaksiyonunu 5-7 gün sonra yeniden evrelemeye başvururlar. Bir hastada antikor titresi yükselir, ancak aşılanmış veya iyileşmiş bir hastada değişmez. Böylece, kan serumundaki antikor titresindeki bir artış, hastalığın bir göstergesi olarak hizmet eder.

Vi-aglütininler, Vi-antijenine sahip tifo patojenlerinin vücuda girmesine yanıt olarak hastanın kanında belirir. Hastalığın 2. haftasından itibaren belirlenirler, ancak titreleri genellikle 1:10'u geçmez. Vi-antikorlarının saptanması, vücutta tifo patojenlerinin varlığı ile ilişkilidir; bu nedenle, bu antikorların belirlenmesi, bakteriyel taşıyıcıların tanımlanmasını mümkün kıldığından, büyük epidemiyolojik öneme sahiptir.

Vi-hemaglutinasyon reaksiyonu. Bu, antikorları tespit etmek için en hassas reaksiyondur.

Reaksiyonun prensibi, özel tedaviden sonra insan (grup I) veya koyun eritrositlerinin yüzeylerinde Vi-antijenini adsorbe edebilmesi ve karşılık gelen Vi-antikorları ile aglütine olma yeteneği kazanmasıdır.

Yüzeyinde adsorbe edilmiş antijenleri olan eritrositlere eritrosit tanı hücreleri denir.

Vi-hemaglutinasyon reaksiyonunu ayarlamak için şunları yapın:

1) hastanın kan serumu (1-2 ml); 2) eritrosit Salmonella Vi diagnostikum; H) Vi-serum; 4) O-serumu; 5) izotonik sodyum klorür çözeltisi.

Reaksiyon, aglütinasyon test tüplerine veya kuyucuklu plastik plakalara yerleştirilir.

Vidal reaksiyonunda olduğu gibi hastadan kan alınır. Serumu al. Serumdan 1:10'dan 1:160'a kadar iki kat seri dilüsyonlar hazırlanır.

Her dilüsyondan 0,5 ml kuyucuğa eklenir ve 0,25 ml eritrosit diagnostik eklenir. Reaksiyon, 0.75 ml'lik bir hacme konur.

Kontroller şunlardır: 1) standart aglütine edici monoreseptör serumu + diagnostik - reaksiyon, serum titresine kadar pozitif olmalıdır; 2) izotonik sodyum klorür solüsyonunda teşhis (kontrol) - reaksiyon negatif olmalıdır.

Kuyuların içerikleri iyice karıştırılarak 2 saat termostata konur ve ertesi güne kadar (18-24 saat) oda sıcaklığında bırakılır.

Muhasebe kontrol ile başlar. Diagnostik aglütinasyon derecesine göre reaksiyon değerlendirilir.

Sonuçlar dörtlü sisteme göre dikkate alınır:

Eritrositler tamamen aglütine edilir - deliğin dibinde bir "şemsiye" şeklinde tortu;

+++ "şemsiye" daha küçüktür, tüm eritrositler aglütine olmamıştır;

++ "şemsiye" küçüktür, deliğin dibinde aglütine olmamış eritrosit tortusu vardır;

Tepki negatiftir; eritrositler aglütine olmadı ve kuyunun dibine düğme şeklinde yerleşti.

test soruları

1. Vidal reaksiyonu hastalığın hangi döneminde teşhis edilir?

2. Vidal reaksiyonunu gerçekleştirmek için hangi bileşenlere ihtiyaç vardır?

3. Vidal'ın tepkisi için hangi teşhisler kullanılıyor?

4. Tifo ve paratifo enfeksiyonlarının teşhisinde serolojik reaksiyonlardan hangisi en duyarlıdır?

5. Vi-hemaglütinasyon reaksiyonunun formülasyonunda hangi teşhis kullanılır?

6. Çalışılan kültürde Vi-antijen varlığını belirlemek için hangi serum kullanılır?

7. Vi-faj tipi tanımının önemi nedir?

Öğretmenden salmonella tifo, paratifoid A ve paratifoid B'den O- ve H-diagnosticum'ları ve hastanın serumunu alın. Vidal'ın tepkisini koy.

Besin ortamı

Ortamlar EMS, Ploskirev, bizmut-sülfit agar tıp endüstrisi tarafından kuru toz halinde üretilir. Etiketteki talimatlara göre hazırlanırlar: Belli miktarda toz tartılır, uygun miktarda su dökülür, kaynatılır ve steril Petri kaplarına dökülür.

Çarşamba Russell. 950 ml damıtılmış suya 40 g kuru besin ortamı ve 5 g besleyici agar ekleyin. Tozları kaynatmak ve çözmek için ısıtın. 1 g x'i 50 ml damıtılmış suda çözün. saat glikoz ve hazırlanan karışıma ilave edildi. Ortam, 5-7 ml'lik steril test tüplerine dökülür, akan buharla sterilize edilir (2 gün, 2 dakika) ve bir sütun kalacak şekilde eğimli hale getirilir. Russell'ın manitol ve sükrozlu ortamı aynı şekilde hazırlanır.

Kuru agardan Olkenitsky besiyeri. 2,5 gr kuru besleyici agar 100 ml distile suda eritilir. Tarifte (etikette) belirtilen tüm bileşenler 50 °C'ye soğutulmuş agara eklenir. Test tüplerine dökülen besiyeri, akan buharla (3 gün 20 dakika) sterilize edildikten sonra pahlanır. Bitmiş ortam soluk pembe renkte olmalıdır.