Apoptozun hem hızlanması hem de yavaşlaması, vücuttaki bir dizi patolojik sürecin seyri üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Apoptozun düzenlenmesinde yer alan maddeler genellikle proteinlerdir ve bunların sentezi ilgili genler tarafından kontrol edilir. Apoptoz seviyesini düzenleyen aynı genler, evrim merdiveninin çeşitli aşamalarındaki canlılarda bulunabilir. Apoptozu uyaran genler arasında p53, Bax ve bcl-xS genleri bulunur. Öte yandan, apoptozu engelleyen proteinleri sentezleyen genler (Bcl-2, Ced-9, BHRF1, MCL-1) tanımlanmıştır. Pro- ve anti-apoptotik proteinler birbirleriyle birleşerek homo- ve heterodimerler oluşturabilirler. Örneğin, Bcl-2 proteininin bir apoptoz inhibitörü, apoptoz aktivatör proteini Bax ile birleştirildiğinde, sonuç (apoptozun inhibisyonu veya aktivasyonu), bu kombinasyonda hangi proteinin baskın olacağına göre belirlenecektir.
Hücre ve dokularda devam eden sentetik süreçleri yansıtan en çarpıcı ve bilgilendirici proteinler, apoptoz sürecinin düzenlenmesi çalışmasında merkezi bir yer tutan Bcl-2 ailesinin proteinleridir. Bu sürecin düzenleme mekanizmasının, bu ailenin proteinleri arasındaki yapısal ve fonksiyonel ilişkiler açısından, bunların tek bir ailede - Bcl-2 proteinleri - birleştirilmelerine izin vermesi tavsiye edilir. Bu Bcl-2 ailesinin proteinleri, sonuçta hücre apoptozunun gelişimini etkileyen homo- ve heterodimerler oluşturarak sürekli dinamik dengededir. Bu nedenle, bu proteinlerin aktif formlarının oranlarının, hücrenin yaşamı ve ölümü arasındaki dengeyi belirlediğine inanılmaktadır.
Şimdiye kadar, Bcl-2 ailesinin proteinlerinin ya apoptoz indükleyicileri (Bad, Bax, J3ik, Bid, Bak) ya da inhibitörleri (Bcl-2, Bcl-X) oldukları bilinmektedir. Bcl-2 ailesinin proteini, G sınıfı proteinlere aittir. Bcl-2 geni tarafından kodlanan 26 kJ protein, bir transmembran alanı içerir ve mitokondriyal membran, perinükleer endoplazmik retikulum, nükleer membran ve mitotik kromozomlarda lokalizedir.
Bcl-2, onu programlanmış ölümden koruyan bir hücre hayatta kalma faktörüdür ve apoptozu önlediği için onkojenik özellik gösterir. Bcl-2 geni, apoptozun negatif düzenleyicisi olarak işlev görür. Bcl-2 konsantrasyonundaki bir azalmanın apoptotik hücre ölümüne yol açtığı, aşırı ekspresyonunun ise hücreleri ölümden koruduğu tespit edilmiştir.
TNF ailesinden proteinlerin spesifik reseptörlerle etkileşiminin bir sonucu olarak bir hücreyi apoptoza götüren olayların dizisi en iyi çalışılandır. parlak temsilci bu protein grubu Apo-1/Fas/FasL sistemidir. Bu sistem için hücre apoptozunun uyarılmasından başka bir işlevin bilinmediği belirtilmelidir.
Apo-1/Fas/CD-95, TNF reseptör ailesi ile yapısal olarak ilişkili bir reseptördür. Apo-1/Fas'ın (reseptör) FasL (ligand) veya monoklonal antikorlarla etkileşimi, hücre apoptozuna yol açar. Apo-1/Fas, birçok hücre tipinin yüzeyinde yapısal olarak eksprese edilir: timositler, lenfoblastoid hücre dizileri, aktive edilmiş T- ve B-lenfositlerin yanı sıra fibroblastlar, hepatositler, keratinositler ve miyeloid hücreler üzerinde. İnsan Apo-1/Fas, 325 amino asit kalıntısından oluşur ve bir tip I membran proteinidir. Onlar. yapısı hücre dışı, transmembran ve sitoplazmik alanlara ayrılabilir. TNF ailesi reseptörleri arasında amino asit dizi homolojisi yüksektir. Yaklaşık 80 amino asit kalıntısı, sitoplazmik proteinlerle protein-protein etkileşiminde yer alan ve ölüm sinyalini üreten ölüm bölgesini (DD) oluşturur. Apo-1/Fas geni insanlarda 10. kromozomun uzun kolunda yer alır ve 9 ekzondan oluşur.
FasL bir sitokindir ve TNF sitokin ailesine aittir. FasL, aktive edilmiş T-lenfositleri ve doğal öldürücü hücrelerin yanı sıra gözün ön odasının Sertoli hücreleri ve parankimal hücrelerinde eksprese edilir; Bu mekanizma, bağışıklık sisteminden korunan yerlerin görünümünü belirler. FasL iki biçimde bulunur: çözünmez veya zara bağlı ve hücreden metaloproteinaz tarafından ayrılan çözünür. İnsan sFasL'sinin çözünür formu aktif kalır. Diğer TNF ailesi reseptör ligandları gibi, sFasL de 3 Apo-1/Fas molekülüne bağlanan bir homotrimerdir.
Ligand reseptöre bağlandığında, reseptörle ilgili DD (ölüm alanı) gibi sitoplazmik proteinlerin oligomerizasyonu, DED - ölüm efektör alanı ve procaspase- içeren bir adaptör protein - FADD (Fas-ilişkili ölüm alanı) meydana gelir. 8. Bu sürecin bir sonucu olarak, apoptoza özgü proteaz kaspaz-8 aktive edilir ve apoptoza özgü süreçler gelişir. fas genindeki veya FasL genindeki mutasyonlar gelişime yol açar otoimmün hastalıklar.
Apo-1/Fas, FasL'ye bağlanarak hedef hücrelerde apoptozu indükleyen 1 transmembran bölge içeren bir proteindir. Serumda ve diğer vücut sıvılarında bulunan transmembran içermeyen, çözünür bir Apo-1 formu (sApo-1/Fas) da vardır. Literatüre göre, bu salgı formu (sApo-1/Fas), hücreleri Apo-1/ligand kaynaklı apoptozdan koruyabilir ve transmembran alandan bir amino asit kalıntısının bölünmesiyle oluşturulur.
Son yıllarda, apoptozun tanımlanması genellikle hem başlatıcı hem de efektör olan kaspazların aktivitesinin belirlenmesiyle gerçekleştirilmektedir. Kaspaz aktivitesi çalışması ile yapılan çalışmaların çoğunda kaspaz-3 dikkate alınır, çünkü çeşitli apoptotik ölüm yolları üzerinde birleşir ve aktivasyonu apoptozun varlığını gösterir. Bununla birlikte, çalışmaya kaspaz-8 aktivitesinin belirlenmesi dahil edilirse, programlanmış hücre ölümünün bu şekilde tanımlanmasına ek olarak, tetiklenmesi için yolun belirlenmesi de mümkündür, çünkü kaspaz-8 aktivasyonu, proses başlatmanın reseptör (dış) mekanizmasına işaret eder. Bu önemli bir avantaj Bu method.
Bugüne kadar 60'tan fazla çeşitli metodlar apoptotik hücrelerin in vitro saptanması ve incelenmesi. Literatür, in vivo olarak apoptotik hücrelerin in vivo tespitine yönelik çeşitli metodolojik yaklaşımları açıklamaktadır. Bu yöntemler kalitatif veya niceleme hücrelerin dış zarındaki değişikliklerden, nükleer DNA'nın seçici parçalanmasından, hücre içi bileşenlerin yapısındaki değişikliklerden veya bunların yeniden dağılımından ve ayrıca sitoplazmanın pH'ındaki azalmadan kaynaklanan olaylar. Ek olarak, apoptotik değişikliklerin belirleyici olmadığı atipik apoptoz formları vardır.
Bariz nedenlerden dolayı, insanlarda in vivo olarak POAG'de GCS apoptoz mekanizmalarını incelemek imkansızdır. Apoptozun PAAG patogenezindeki rolüne ilişkin çalışmada dolaylı bir gösterge olarak, periferik kan lenfositlerindeki apoptotik belirteçler değerlendirildi ve ikincisinin apoptoza hazır olup olmadığını karakterize etti. Apoptotik hücreleri belirlemek için aşağıdakiler kullanılır: lazer tarama ve akış sitometrisi, tek foton emisyonu CT tarama, manyetik rezonans görüntüleme (MRI), manyetik rezonans spektroskopisi, pozitron emisyon tomografisi. Ayrıca, apoptotik hücre ölümünü belirlemek için, geleneksel sabitleme ve boyama yöntemleri kullanılarak ışık ve floresan mikroskopi, elektron mikroskobik yöntemler, yerinde oligonükleozomal DNA bozunmasının tespiti, proteinlerin immünohistokimyasal tespiti - programlanmış hücre ölümü veya parçalanmış DNA'da yer alan belirteçler, etkinlik kaspaz.
Standart yöntemlerle boyanmış preparasyonlar üzerinde apoptoz çalışması, bu yöntemlerin göreceli basitliği nedeniyle çok yaygın olarak kullanılmaktadır. Apoptotik olarak değiştirilmiş hücrelerin sayılmasıyla elde edilen sonuçlar, sözde apoptotik indeks olarak ifade edilir. Programlanmış hücre ölümü için kriterler, kromatin marjinasyonu ve piknoz, çekirdeğin konturlarındaki değişiklikler, konturlardaki değişiklikler ve hücrelerin parçalanması ve serbest duran çekirdeklerin görünümü olabilir.
Floresan mikroskopi, programlanmış hücre ölümünü tespit etmek için genellikle sübjektif bir yöntem olarak kullanılır. Hem süspansiyondaki vital olarak boyanmış hücreler hem de sabit preparasyonlar incelenir. Canlı hücrelerle çalışırken, plazma zarının dış tarafında apoptoz sırasında ortaya çıkan fosfatidilserin tespitini mümkün kılan annexin V etiketlemesi yaygın olarak kullanılır.
Floresan mikroskobu altında hücreleri analiz ederken, aşağıdaki özellikler dikkate alınır: çekirdeğin boyutu (azalma), kromatin dağılımının doğası (kümeler halinde yoğunlaşma) düzensiz şekil, sıkıştırma), kromatin gövdeleri (membran izolasyonunun korunması), DNA lüminesansının doğası. Apoptotik DNA, yoğun parlak sarı-yeşil olarak görünür. Canlı hücrelerde, akridin oranjı dağınık yeşil floresana neden olur.
İmmünohistokimyasal çalışmaların yardımıyla, apoptoza yol açan bir dizi biyokimyasal süreç oluşturan proteinlerin varlığı belirlenir. Genellikle bu yöntem grubu TUNEL ve ELISA'yı içerir.
Pek çok araştırmacı, diskteki yapısal değişikliklerde apoptoza öncü bir rol atfetmektedir. optik sinir(ONH), GCS kaybından kaynaklanır. Dejeneratif hastalıkların gelişiminde apoptozun rolü şüphesizdir. Apoptotik sürecin POAG'daki GON mekanizmasına katılımını gösteren inandırıcı deneysel materyal vardır. Bununla birlikte, genel olarak, farklı glokom evrelerine sahip hastalarda apoptoz faktörlerinin klinik çalışmaları çok sınırlıdır, bu da GON patogenezindeki rollerini incelemeyi zorlaştırır.
Kaynak sayfa: 265
CAD (kaspaz ile aktive edilmiş DNaz) 180-200 nükleotidin katları halinde parçalara bölünür. Apoptoz, apoptotik cisimlerin oluşumuyla sonuçlanır - entegre organelleri ve nükleer kromatin parçalarını içeren zar vezikülleri. Bu cisimler fagositoz yoluyla komşu hücreler veya makrofajlar tarafından alınır. Ekstrasellüler matriks, hücresel enzimlerden etkilenmediği için çok sayıda apoptotik hücrede dahi inflamasyon gözlenmez.
Apoptoz süreci, vücuttaki hücre sayısının fizyolojik olarak düzenlenmesi, yaşlı hücrelerin yok edilmesi, antijenlerine (kendi antijenleri) reaktif olmayan lenfositlerin oluşumu, sonbahar yapraklarının düşmesi için gereklidir. bitkiler, T-öldürücü lenfositlerin sitotoksik etkisi için, organizmanın embriyonik gelişimi için (kuş embriyolarında parmaklar arasındaki deri zarlarının kaybolması) ve diğerleri.
Normal hücre apoptozunun ihlali, kontrolsüz hücre çoğalmasına ve bir tümörün ortaya çıkmasına neden olur.
1. Apoptozun Önemi
Apoptoz, çoğu çok hücreli organizmanın hayati aktivitesinin ayrılmaz bir parçasıdır. Özellikle önemli rol gelişim süreçlerinde oynar. Örneğin, tetrapodların uzuvları kürek şeklinde büyür ve aralarındaki hücrelerin ölümü nedeniyle parmak oluşumu meydana gelir. Artık ihtiyaç duyulmayan hücreler de apoptoza tabi tutulur, bu nedenle iribaşlardaki kuyruk özellikle metamorfoz sırasında yok edilir. Embriyonik gelişim sırasında omurgalıların sinir dokusunda, nöronların yarısından fazlası oluşumdan hemen sonra apoptoz ile ölür.
Ayrıca apoptoz, hücrelerin "kalitesi" için kontrol sisteminin bir parçasıdır, yanlış yerleştirilmiş, hasar görmüş, işlevsiz veya vücut için potansiyel olarak tehlikeli olanları yok etmenizi sağlar. Bir örnek, yararlı antijene özgü reseptörler taşımadıklarında veya oto-reaktif olduklarında ölen B-lenfositlerdir. Apoptoz ile enfeksiyon sırasında aktive olan lenfositlerin çoğu yenildikten sonra da ölür.
Yetişkin organizmalarda, hücre proliferasyonu ve apoptozun eşzamanlı düzenlenmesi, tüm bireyin ve bireysel organlarının boyutunu korumayı mümkün kılar. Örneğin, hepatositlerin çoğalmasını uyaran fenobarbital ilacının implantasyonundan sonra, sıçanlarda karaciğer artar. Bununla birlikte, bu maddenin etkisinin kesilmesinden hemen sonra, tüm fazla hücreler apoptoz geçirir ve bu da karaciğerin boyutunun normale dönmesiyle sonuçlanır.
Apoptoz, bir hücre onaramayacağı büyük miktarda dahili hasar "hissettiğinde" de meydana gelir. Örneğin DNA'nın hasar görmesi durumunda bir hücre kanser hücresine dönüşebilir ki bu olmasın diye normal şartlarda "intihar eder". Ayrıca virüs bulaşmış çok sayıda hücre apoptoz ile ölür.
2. Apoptotik hücrelerin belirteçleri
Apoptoz belirteçleri
Apoptotik hücrelerde DNA fragmantasyonunun TUNEL yöntemi ile tespiti Fare karaciğer dokusunun hazırlanması, apoptotik hücre çekirdeği kahverengi renkte, optik mikroskopta.
Apoptotik hücrelerde DNA parçalanmasının agaroz jel elektroforezi ile saptanması. Solda: Apoptotik hücrelerden izole edilen DNA - "DNA merdiveni" görülüyor; orta: işaretçiler; vaka: Tedavi edilmemiş hücrelerden DNA kontrol numunesi. Hücre çizgisi H4IIE (sıçan hepatomu), apoptoz indükleyici - parakuat, etidyum bromür ile görselleştirme.
Üst: Floresan boya (Hoechst 34580) ile boyama yoluyla kromatin yoğunlaşması ve parçalanmasının saptanması. Orta: Annexin V ile boyanarak plazmalemmanın dış yaprakçığına fosfadidilserin translokasyonunun saptanması. Alt: Apoptotik hücrelerin parlak alan mikrografı. Hücre dizisi - Jurkat, apoptoz indükleyici - TRAIL, eş odaklı ve ışık, optik mikroskopi gördü.
Apoptoz ile ölen hücreler, bir dizi morfolojik özellik ile tanınabilir. Daha küçük ve daha yoğun hale gelirler (piknoz), psödopodiyi yuvarlaklaştırır ve kaybederler, hücre iskeleti içlerinde çöker, nükleer zar parçalanır, kromatin yoğunlaşır ve parçalanır. Hücrelerin yüzeyinde çok sayıda vezikül belirir, eğer hücreler yeterince büyükse, zarlarla çevrili parçalara ayrılırlar - apoptotik cisimler.
Apoptotik hücrelerde morfolojik değişikliklerin yanı sıra çok sayıda biyokimyasal değişiklik de meydana gelir. Özellikle DNA, nükleozomlar arasındaki bağlayıcı bölgelerdeki özel nükleazlar tarafından parçalara ayrılır. Eşit uzunluk. Bu nedenle, apoptotik bir hücrenin tüm DNA'sı elektroforez kullanılarak ayrılırken, karakteristik bir "merdiven" gözlemlenebilir. DNA fragmantasyonunu tespit etmenin bir başka yöntemi de serbest uçlarını TUNEL yöntemi ( T terminal deoksinükleotidil transferaz d sen TP N hasta e nd ben yanılma ) .
Apoptotik hücrelerin plazma zarı da değişikliklere uğrar. Normal koşullar altında, negatif yüklü fosfolipid fosfatidilserin, yalnızca iç (sitozole geri dönen) tabakasında bulunur, ancak apoptoz sırasında dış yaprakçığa "sıçrayır". Bu molekül, yakındaki fagositlere "beni ye" sinyali olarak hizmet eder. Apoptotik hücrelerin fosfatidilserin kaynaklı alımı, diğer fagositoz türlerinin aksine, enflamatuar mediatörlerin salınmasıyla sonuçlanmaz. Plazma zarında açıklanan değişiklik, apoptoz yoluyla ölen hücreleri saptamak için başka bir yöntemin temelini oluşturur - spesifik olarak fosfatidilserine bağlanan anexin V ile boyama.
3. Kaspaz - apoptoz aracıları
Apoptozun geçişini sağlayan hücresel sistemler tüm hayvanlarda benzerdir, kaspaz protein ailesi hayvanlarda merkezi bir yer tutar. Kaspazlar, aktif bölgelerinde bir sistein kalıntısına sahip olan ve substratlarını belirli bir aspartik asit kalıntısında kesen proteazlardır (dolayısıyla adı: C itibaren sistein Ve asp itibaren aspartik asit). Kaspazlar, hücrede, onları aspartat kalıntısında bir veya iki yerde kesen, halihazırda aktifleştirilmiş diğer kaspazlar için substrat haline gelebilen aktif olmayan prokaspazlar şeklinde sentezlenir. Oluşturulan iki parça - daha büyük ve daha küçük - birbirine bağlanır ve aynı dimmer ile ilişkilendirilen bir dimer oluşturur. Bu şekilde oluşan tetramer, substrat proteinlerini kesebilen aktif bir proteazdır. Daha büyük ve daha küçük alt birimlere karşılık gelen bölgelere ek olarak, procaspazlar bazen ayrıca bölünmeden sonra bozulan inhibitör prodomainler de içerir.
Bazı kaspazların diğerleri tarafından bölünmesi ve aktivasyonu sonucunda, sinyali önemli ölçüde artıran ve apoptozu belirli bir andan itibaren geri döndürülemez bir süreç haline getiren bir protealitik kaskad oluşur. Bu kaskadı başlatan procaspazlara başlatıcı olanlar, substratlarına da efektör olanlar denir. Aktivasyondan sonra efektör kaspazlar, diğer efektör prokaspazları veya hedef proteinleri parçalayabilir. Apoptoz sırasında yok edilen efektör kaspazların hedefleri, özellikle, bölünmesi bu yapının parçalanmasına yol açan nükleer lamina proteinlerini içerir. Ayrıca proteini bozar, normal koşullar altında CAD endonükleazlarını inhibe eder ve bunun sonucunda DNA parçalanması başlar. Kaspaz ve hücre iskeleti ve hücreler arası adezyon proteinleri parçalanır, bunun sonucunda apoptotik hücreler yuvarlaklaşır ve komşu hücrelerden ayrılır ve böylece fagositler için daha kolay hedefler haline gelir.
Apoptozun ilerlemesi için gereken kaspazlar doku tipine ve hücre ölümünün aktive edildiği yola bağlıdır. Örneğin farelerde, efektör kaspaz-3'ü kodlayan gen "kapatıldığında", beyinde apoptoz oluşmaz, normal olarak diğer dokularda ilerler.
Procaspase genleri sağlıklı hücrelerde aktiftir ve bu nedenle proteinler apoptozun meydana gelmesi için gereklidir ve sürekli olarak mevcuttur, hücre intiharını tetiklemek için sadece aktivasyonları gerekir. Başlatıcı procaspazlar, CARD ( caspase işe alım alanı , kaspaz çekim alanı). CARD, hücre apoptozu uyaran bir sinyal aldığında aktivasyon kompleksleri oluşturmak için procaspase başlatıcıların adaptör proteinlere bağlanmasına izin verir. Aktivasyon komplekslerinde, birkaç pro-kaspaz molekülü birbirine çok yakındır, bu da aktif duruma girmeleri için yeterlidir ve ardından birbirlerini keserler.
Memeli hücrelerinde kaspaz kaskadının aktivasyonu için en iyi anlaşılan iki sinyal yolu, her biri kendi başlatıcı prokaspazını kullanan dışsal ve içsel (mitokondriyal) olarak adlandırılır.
4. Apoptozu etkinleştirme yolları
4.1. dış yol
Hücre, dışarıdan, örneğin sitotoksik lenfositlerden apoptoz başlatan bir sinyal alabilir. Bu durumda, sözde harici yol etkinleştirilir ( dış yol) Ölüm reseptörlerinden başlayarak. Ölüm reseptörleri, TNF reseptörünün kendisi ve Fas ölüm reseptörü gibi tümör nekroz faktörü (TNF) reseptör ailesine ait transmembran proteinlerdir. Her bir monomerin bir hücre dışı ligand bağlama alanına, bir transmembran alanına ve bir sitoplazmik ölüm alanına sahip olduğu homotrimerler oluştururlar, adaptör proteinler yoluyla prokaspazları çeker ve aktive eder.
Ölüm reseptörü ligandları da homotrimeramlardır. Birbirleriyle ilişkilidirler ve tümör nekroz faktörü sinyal molekülü ailesine aittirler. Örneğin sitotoksik lenfositler, yüzeylerinde hedef hücrelerin plazmalemması üzerindeki Fas ölüm reseptörlerine bağlanabilen Fas ligandları taşırlar. Bu durumda, bu reseptörlerin hücre içi alanları adaptör proteinine bağlanır ( FADD, Fas ile ilişkili ölüm alanı ) ve sırayla pro-caspase 8 ve/veya 10'u başlatarak çekerler.Bu olaylar dizisinin bir sonucu olarak, ölüme neden olan bir sinyal kompleksi oluşur - DISC ( ölüme neden olan sinyal kompleksi ). Başlatıcı kaspazlar tarafından bu komplekste aktivasyon üzerine, bunlar efektör prokaspazları ayırır ve apoptotik kaskadı tetikler.
Pek çok hücre, onları apoptozun dış yolunun aktivasyonundan belirli bir dereceye kadar koruyan moleküller sentezler. Böyle bir korumanın bir örneği, sözde tuzak reseptörlerinin ifadesi olacaktır ( yem reseptörleri), hücre dışı ligand bağlama alanlarına sahip olan ancak sitoplazmik ölüm alanlarına sahip olmayan ve bu nedenle apoptozu tetikleyemeyen ve ligandlar için geleneksel ölüm reseptörleri ile rekabet edemeyen. Hücreler ayrıca yapı olarak procaspases 8 ve 10'a benzeyen ancak proteolitik aktiviteye sahip olmayan FLIP gibi apoptozun dışsal yolunu bloke eden proteinler üretebilir. Başlatıcı procaspazların DISC kompleksine bağlanmasını engeller.
4.2. iç yol
apoptozom
Apoptoz, örneğin yaralanma, DNA hasarı, oksijen eksikliği gibi durumlarda hücre içinden de tetiklenebilir. besinler veya hücre dışı hayatta kalma sinyalleri. Omurgalılarda, bu sinyal yolağına içsel denir ( içsel yol) veya mitokondriyal, önemli olay mitokondrinin zarlar arası boşluğundan belirli moleküllerin salınmasıdır. Sikrom c, mitokondrinin elektron taşıma mızraklarına giren bu tür zocrema moleküllerinden önce uzanır, sitoplazmadaki protein başka bir işlevi yerine getirir - adaptör proteini Apaf'a gelir ( apoptotik proteaz aktive edici faktör l ), apoptozom adı verilen tekerlek şeklindeki yedi üyeli bir yapıya oligomerize olmasına neden olur. Apoptozom, başlatıcı procaspase-9'u alır ve etkinleştirir, bu daha sonra başlatıcı procaspazı etkinleştirebilir.
Bazı hücrelerde, dışsal apoptoz yolu, hücreyi etkili bir şekilde yok etmek için içsel olanı aktive etmelidir. Dahili yol, Bcl-2 ailesi proteinleri tarafından yüksek oranda düzenlenir.
4.2.1. Bcl-2 ailesi proteinleri tarafından içsel yolun düzenlenmesi
Bcl-2 ailesi, ana işlevi mitokondrinin zarlar arası boşluğundan sitokrom c ve diğer moleküllerin salınımını düzenlemek olan evrimsel olarak korunmuş proteinleri içerir. Bunlar arasında çeşitli kombinasyonlarda birbirleriyle etkileşime girebilen, birbirlerini baskılayan, aktiviteleri arasındaki dengeyi sağlayan ve hücrenin kaderini belirleyen proapoptotik ve antiapoptotik moleküller bulunur.
Bu aileden yaklaşık 20 protein bilinmektedir ve bunların tümü BH1-4 olarak adlandırılan dört alfa sarmal Bcl2 homoloji alanından en az birini içerir ( bcl2 homolojisi). Bcl2 ailesinin anti-apoptotik proteinleri, Bcl-2'nin kendisi ve ayrıca Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1 ve A1 dahil olmak üzere dört alanın tümünü içerir. Proapoptotik proteinler, ilkinin üyeleri üç BH alanı (BH1-3) içeren iki gruba ayrılır, bunlar özellikle Bak, Bax ve Bok'tur (ikincisi yalnızca üreme organlarının dokularında ifade edilir) . Bcl-2 ailesi arasında en çok sayıda olanı, yalnızca BH3 alanını (yalnızca BH3) içeren ikinci proapoptotik protein grubudur, Bim, Bid, Bad, Bik/Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa'yı içerir. Puma.
Normal koşullar altında (yani, hücre apoptoz geçirmediğinde), Bcl-2 ve Bcl-XL gibi anti-apoptotik proteinler, pro-apoptotik BH123 proteinlerine (Bax ve Bak) bağlanır ve dış mitokondriyal zarda polimerleşmelerini önler. gözenekler oluşturmak için. Belirli bir apoptotik uyaranın etkisinin bir sonucu olarak, sadece BH3 alanını içeren proapoptotik proteinler hücrede aktive edilir veya sentezlenmeye başlar. Sırasıyla, anti-apoptotik proteinleri inhibe ederek Bak ve Bax üzerindeki inhibe edici etkiyi ortadan kaldırırlar veya ikincisi ile doğrudan etkileşime girerek bunların oligomerizasyonunu ve gözenek oluşumunu desteklerler. Dış zarın geçirgenliği nedeniyle, sitokrom c, AIF gibi diğer apoptoz aracılarının yanı sıra sitozole girer. apoptoz indükleyici faktör ).
Örneğin, hücrede hayatta kalma sinyalleri olmadığında, MAP kinaz JNK, apoptozun dahili yolunu tetikleyen BH3 proteini Bim'in ekspresyonunu aktive eder. DNA hasarı durumunda, aynı zamanda apoptoz geçişini sağlayan BH3 proteinleri Puma ve Noxa'yı kodlayan genlerin transkripsiyonunu uyaran tümör baskılayıcı p53 birikir. Başka bir BH3 proteini olan Bid, apoptozun dışsal ve içsel yolları arasında bir bağlantı sağlar. Ölüm reseptörlerinin ve sonuç olarak kaspaz-8'in aktivasyonundan sonra, kaspaz-8 Bid'i bölerek Bcl-2'yi baskıladığı mitokonriye hareket eden kesik bir tBid (kesilmiş Bid) formu oluşturur.
apoptoz- bu, dış veya iç sinyallerin hücreye enzimler oluşturması veya aktive etmesi için bir dürtü verdiği ve kendi kendini yok etmesine yol açan programlanmış, genetik olarak aracılık edilen bir hücre ölümü şeklidir. Morfolojik olarak apoptoz, hücrenin büzülmesi, çekirdeğin yoğunlaşması ve parçalanması, hücre iskeletinin yıkımı ve hücre zarının büllöz çıkıntısı ile karakterize edilir. Apoptozun bir özelliği, ölmekte olan bir hücrenin, süreç tamamlanana kadar zarının bütünlüğünü korumasıdır ve ancak o zaman zarının yok edilmesi, yakındaki fagositlerin kalan parçaları emmesi ve hücre bozunma sürecini tamamlaması için bir sinyaldir. Hemen fagositoza uğramayan apoptotik hücreler, "apoptotik cisimler" adı verilen küçük, zara bağlı parçalara dönüşür. Apoptozun önemli bir özelliği, ölmekte olan hücrelerin uzaklaştırılmasının iltihaplanma gelişmeden gerçekleşmesidir.
Apoptoz, fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar: organogenez, embriyonik gelişim, yetişkin bir organizmanın dokularındaki hücre popülasyonlarının kompozisyonunun ve sayısının düzenlenmesi, organizmadaki çeşitli hormonal değişiklikler. Apoptozun rolü çeşitli patolojik süreçlerde de önemlidir. En çok tümör büyümesinde incelenir.
Apoptoz süreci iki aşamaya ayrılabilir:
apoptotik sinyallerin oluşumu ve iletilmesi - karar verme aşaması;
sökme hücre yapıları- efektör faz.
Apoptoz mekanizmalarının uygulanması, endojen hücresel enzimlerin - sistein proteazlarının (kaspazlar) aktivasyonu ile ilişkilidir. Kaspazlar, aktif olmayan bir durumda (procaspazlar) hücrelerde bulunur. Aktivasyon, proteolitik bölünme ve ardından aktif alt birimlerin oluşumu ile dimerizasyon ile gerçekleşir. Kaspazlar için hedefler, hücrenin çeşitli yaşamsal işlevlerinden sorumlu proteinlerdir. Şu anda, 14 tip kaspaz tanımlanmıştır. işlevsel özellikler 3 gruba ayrılabilir:
sitokin aktivatörleri (kaspazlar 1, 4, 5, 13)
kaspazlar - efektör kaspazların aktivasyonunu indükleyenler (kaspazlar 2, 8, 9, 10)
efektör kaspazlar - apoptoz yapanlar (3, 6, 7)
Membrandan biri hücre reseptörleri apoptoz mekanizmalarından sorumlu Fas reseptörü (CD95/APO1) adı verilen bir proteindir. Fas reseptörü için ligand, tümör nekrotik faktörleri ailesine ait olan ve hem bir zar proteini formunda hem de çözünür bir formda sunulabilen bir protein - Fas ligandıdır (Fas-L). Fas reseptörünün Fas ligandına bağlanması, kaspaz indükleyicilerin aktivasyonu ile apoptoz mekanizmalarının aktivasyonuna yol açar. Efektör kaspazların müteakip aktivasyonu üzerine, amacı hücrenin apoptotik "parçalanması" olan bir proteolitik reaksiyonlar zinciri başlar: DNA parçalanması, hücrenin yapısal proteinlerinin doğrudan bölünmesi ve protein sentezinin düzensizliği. Böylece, efektör kaspazların apoptoza katılması, apoptotik hücrenin çevredeki hücrelerle birlikte parçalanmasına, hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesine, DNA onarımı ve replikasyonu olasılıklarının azalmasına, nükleer zarın yırtılmasına ve DNA yıkımına, hücreyi apoptoz için işaretleyen sinyallerin salınmasına yol açar. ve hücrenin apoptotik cisimlere diseksiyonu. Efektör kaspazlara "cellat kaspazları" denmesi tesadüf değildir.
Apoptozu incelemek için yöntemler oldukça çeşitlidir. Başlangıçta, apoptozu belirlemek için en yaygın yöntem, ekstrakte edilen DNA fraksiyonunun elektroforeziydi; bu, düşük moleküler ağırlıklı DNA'nın ayrıklığını mol cinsinden ortaya çıkarmayı mümkün kılar. kütle (DNA'nın internükleozomal bozunmasının bir sonucu olarak). Morfolojik çalışmalarda, DNA kırılmalarını tespit etmek için, oluşumu TdT enzimi tarafından katalize edilen DNA kırılma bölgelerinde etiketli oligonükleotid eklerinin oluşumuna dayanan TUNEL yöntemi kullanılır.
Şu anda, akış sitometrisine dayalı yöntemler, lenfositlerin apoptozunu kaydetmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu grup, aşağıda açıklanan bir floresan boya - propidyum iyodür kullanılarak hücreler (hipodiploid hücreler) tarafından DNA'nın bir kısmının kaybının saptanmasına dayanan bir yöntemi içerir. Apoptozu belirlemek için akış sitometrisine dayalı diğer yöntemler de kullanılır. Lenfositlerin apoptozisi, apoptoz geçiren hücrelerin zarında görünen fosfatidilserin'e bağlanan florokrom etiketli annexin V kullanılarak erken bir aşamada tespit edilebilir. Lenfositlerin apoptoz geliştirme "eğilimi" hakkında yaklaşık bir fikir, Fas reseptörünün (CD95) yüzeylerindeki ve bcl-2 protonkojenin mitokondrilerindeki ekspresyonu belirlenerek elde edilebilir.
Hastaların klinik ve immünolojik muayenesi sırasında apoptozu değerlendirmenin klinik önemi şüphesizdir, çünkü bir dizi hastalık ihlali ile ilişkilidir. Apoptozun zayıflaması, otoimmün hastalıkların oluşumundan kaynaklanır (otospesifik lenfosit klonlarını ayırma sürecinin ihlali nedeniyle). Bu nedenle, apoptozun zayıflamasının kaydedilmesi, sistemik lupus eritematozus gibi otoimmün hastalıkların patogenetik mekanizmaları hakkında bir bilgi kaynağı olarak hizmet edebilir. romatizmal eklem iltihabı, ayrıca temeli apoptotik sinyaller için reseptörleri belirleyen genlerin bir mutasyonu olan otoimmün lenfoproliferatif sendrom. Apoptozun ihlali, malign süreçlerin gelişimi için önemli bir mekanizmadır. Tümör hücrelerinde, DNA'da onarılmamış kırılmaların varlığı hakkında bir sinyal algılayan bir proteini kodlayan p53 geninin bir mutasyonu sıklıkla tespit edilir ve kromozomal mutasyonlar apoptoz gelişimine yol açar. Sonuç olarak, genetik olarak kusurlu hücreler atılmaz ve tümör oluşumunun kaynağı haline gelir.
Diğer bazı hastalıklarda ise aksine apoptozda bir artış kaydedilmiştir. Bu, enfeksiyöz süreçler (kitle T-hücresi apoptozunun nedeni genellikle mikrobiyal süper antijenlerdir), sepsis, çeşitli viral hastalıklar AIDS dahil. Apoptoz bir dizi kan hastalığında artar ve birincil immün yetmezlikler nedeni, rolü sitokinler tarafından oynanan hücre hayatta kalma faktörlerinin yetersiz üretimi olduğunda. Bu nedenle, IL-7 geninin bir mutasyonu veya sitokin reseptörlerinin ortak y-zinciri ile ilişkili şiddetli kombine immün yetmezlik formlarından birinde, IL-7 eksikliğine bağlı olarak lenfoid öncüllerin ölümü söz konusudur.
Bununla birlikte, en genel olarak önemli olan, mitojenler tarafından uyarıldığında lenfositlerin maruz kaldığı "aktivasyon apoptozunun" değerlendirilmesidir. Gerçek şu ki, apoptoz, proliferasyonla birlikte, lenfositlerin aktivasyon uyaranlarına verdiği bir yanıt biçimidir. Farklılaşmanın erken aşamalarında, apoptotik yanıt baskındır ve bunun sonucu, indükleyici antijene karşı tolerans oluşumudur. Olgun lenfositler, stimülasyona ağırlıklı olarak proliferasyonla yanıt verir (bu, İlk aşama ve bir bağışıklık tepkisinin gelişimi için bir ön koşul), ancak bunların aktivasyon apoptozuna girme olasılıkları bellidir. Bu durumda apoptoz, proliferasyona alternatif bir süreç olarak hareket ettiğinden, oranları, aktive edici sinyallere hücre yanıtının etkinliğinin bir ölçüsü olarak hizmet edebilir. Apoptozun lenfositlerin bir mitojene yanıtına katkısı ne kadar yüksek olursa, antijene özgü o kadar az etkili olur. bağışıklık savunması. Bu nedenle, lenfositlerin mitojenler tarafından aktivasyonu üzerine apoptozun belirlenmesi, hücrelerin aynı uyarana proliferatif tepkisinin paralel bir değerlendirmesi koşulu altında en bilgilendiricidir.
Hücrede apoptoz sürecinde, moleküler düzeyde karmaşık bir reaksiyon zinciri meydana gelir ve bu da metabolik süreçlerde ve hücrelerin fenotipik özelliklerinde bir değişikliğe yol açar. Bu değişiklikler biyokimyasal, mikroskobik veya sitometrik yöntemlerle belirlenebilir ve apoptozun belirteçleri olarak kullanılır.
Apoptozun erken belirteçlerinden biri, hücrenin sitoplazmik zarındaki görünümdür. anneksin için reseptörler. Apoptotik hücrelerde, fosfolipid fosfatildiserin (PS) yeniden yönlendirilir ve hücre zarının yüzeyinde lokalize olur. Membran yüzeyinde PS lokalizasyonundan başlayarak gözlenir.
erken aşama hücre yıkımını tamamlamak için apoptoz. rekombinant
yüksek afiniteye sahip olan ny annexin V-proteini (35-36 kDa)
Ca +2 iyonlarının varlığında PS'ye. Yüzeydeki FS ile temas kurmak
florokrom konjuge annexin V,
apoptoz belirteci. Genellikle annexin V ile kombinasyon halinde kullanılır.
eşzamanlı tanınmasına izin veren propidyum iyodür (PI)
bozulmamış hücreler (hem annexin V hem de PI için negatif), hücreler
"erken" apoptozda (annexin V için pozitif,
PI için negatif) ve geç apoptozdaki hücreler veya
nekrozda (hem annexin V hem de PI için pozitif).
CD95 Fas veya APO-1, tümör nekroz faktörü (TNF-a) reseptör ailesinin bir üyesi olan 45 kDa'lık bir transmembran glikoproteindir. CD95 antijeni, timositler, CD4+, CD8+ periferik kan lenfositleri üzerinde önemli miktarlarda, daha az ölçüde B-lenfositleri ve NK hücreleri üzerinde eksprese edilir. Bu antijen ayrıca granülositler ve monositler üzerinde de eksprese edilir, ancak trombositler ve eritrositler üzerinde ekspresyonu bulunmaz. CD95 reseptörü ayrıca normal doku ve tümörlerin hücrelerinde de gözlenir. CD95'in bir Fas ligandına (Fas-L, CD95L) bağlanması, onu eksprese eden hücrelerde apoptozu indükler. CD95'e yönelik monoklonal antikorlar, apoptoz için hazır bir hücre popülasyonunun tanımlanması için akış sitometrisi veya floresan mikroskopi yönteminin kullanılmasına izin verir.
CD95L (Fas-L)– Fas-ligandı olarak adlandırılan, bir zar proteinidir (40kD). Reseptör ailesinden (TNF-α) bir protein (26 kD) olan çözünür bir CD95L (sFas-L) formu da vardır. Bu antijen, sitotoksik E-lenfositler ve NK-hücreleri tarafından ifade edilir ve birçok tümör hücresinde de bulunur. Fas-L'nin CD95 reseptörüne bağlanması, hedef hücrelerde apoptoz sürecini indükler. CD95L'ye yönelik monoklonal antikorlar, apoptoz için hazır bir hücre popülasyonunun tanımlanması için akış sitometrisi veya floresan mikroskopi yönteminin kullanılmasına izin verir.
Bcl-2– aşırı ekspresyonu apoptozu bloke eden protein (26 kDa). Bcl-2, mitokondride lokalize bir hücre içi proteindir, bu nedenle, monoklonal antikorlar kullanarak belirlemek için, hücre zarının önceden geçirgenleştirilmesi gerekir.
İş bitimi -
Bu konu şuna aittir:
Tıp, pediatrik ve tıp-koruma fakülteleri öğrencileri için bir ders kitabının bağışıklık durumunu değerlendirme yöntemleri
Federal Sağlık ve Sosyal Kalkınma Ajansı Kursk Devlet Tıp Üniversitesi Klinik İmmünoloji ve Alerji Bölümü..
Bu konuyla ilgili ek malzemeye ihtiyacınız varsa veya aradığınızı bulamadıysanız, eser veritabanımızdaki aramayı kullanmanızı öneririz:
Alınan malzeme ile ne yapacağız:
Bu materyalin sizin için yararlı olduğu ortaya çıktıysa, onu sosyal ağlardaki sayfanıza kaydedebilirsiniz:
| cıvıldamak |
Bu bölümdeki tüm konular:
Bağışıklık durumu ve değerlendirilmesi için yöntemler
Bağışıklık durumu (IS), bağışıklık sistemi hücrelerinin kantitatif ve fonksiyonel aktivitesini karakterize eden bir dizi laboratuvar parametresidir. IP göstergeleri büyük ölçüde farklılık gösterir
İmmünolojik araştırmanın nesneleri ve yöntemleri
Çalışmanın nesneleri Çalışma yöntemleri fenotipik özellik immünokompetan hücreler Akış sitometrisi Imm
lenfositler
Bağışıklık sistemi hücrelerinin bir parçası olarak, gerçek immünositler, lenfositlerin tüm varyantlarıdır. Diğer beyaz kan hücresi türleri (nötrofiller, eozinofiller, bazofiller, monositler), makrofajlar, trombositler, mast hücreleri
MFS hücreleri
Periferik kan monositleri ve doku makrofajları pluripotent kök hücrelerden elde edilir. Kan dolaşımına girdikten sonra, monositler 2-3 gün içinde dokulara yerleşir ve burada dokuya dönüşür.
Antimikrobiyal oksijen bağımlı sistem
bakterisidal etkinin oksijene bağımlı mekanizmaları glikoz + NADP+ → Pentoz fosfat + NADPH Sitokrom b245 NADP + O2 ֛
aracı hücreler
Granülositler, kanda dolaşan ve monosit-makrofaj hücreleri gibi kemik iliğindeki bir miyeloid kök hücreden kaynaklanan polimorfonükleer lökositlerdir. Üç çeşit tahıl vardır
Lenfositlerin immünofenotiplemesi için yöntemler
Lenfositleri incelerken, periferik kandaki sayıları ve fonksiyonel aktiviteleri değerlendirilir. Hücre sayısının belirlenmesi, farklılaşma antijenleri dikkate alınarak gerçekleştirilir ve
mononükleer fraksiyonun izolasyonu
Mononükleer hücreleri izole etme yöntemi, çeşitli kan hücrelerinin farklı kaldırma kuvvetine dayanır. Belirli bir yoğunluk gradyanının kullanılması, mononükleer hücrelerin (lenfositler, monositler,
Akış sitometrisi
Akış sitometrisi, hücrelerin optik özelliklerinin ölçülmesine dayanır. Hücreler, odaklanmış bir ışığı geçtikleri bir kuvars akış hücresindeki laminer bir akışa tek tek sokulur.
Dolaylı immünofloresan yöntemi
Dolaylı immünofloresan, florokrom ile işaretlenmiş monoklonal antikorların kullanımına dayalı, floresan mikroskopi sırasında hücrelerin spesifik lüminesansını dikkate alarak sonuçların değerlendirilmesine dayanan bir yöntemdir.
immünositokimyasal yöntem
İmmunositokimyasal yöntemler, peroksidaz ve alkalin fosfataz gibi enzimlerin kullanımına dayanmaktadır. Şu anda en yaygın kullanılan yöntem PA (peroksidaz-antiperoksidaz), st.
Lenfositlerin fonksiyonel aktivitesini incelemek için yöntemler
Lenfositlerin fonksiyonel aktivitesi şu etkilerle değerlendirilir: antijenleri tanıma yeteneği, hücrelerin aktivasyonu, çoğalması ve farklılaşması. Lenfositlerin yeteneği
Lenfositlerin blast transformasyon reaksiyonu
Bir lenfositin yabancı bir antijen veya spesifik olmayan bir mitojen ile temasına, aktivasyon ve blast transformasyon reaksiyonu (RBTL) eşlik eder, yani; küçük lenfositlerin patlamaya dönüşmesiyle hücre çoğalması
Karışık lenfosit kültürü
Lenfositlerin farklı haplotipteki MHC-II molekülleri ile birlikte yetiştirilmesi, patlama transformasyonuna ve çoğalmasına neden olur. Yanıt veren hücreler T-lenfositlerdir ve yabancı maddeler tarafından uyarılırlar.
plazma proteinleri
İnsan plazmasında, çoğu izole edilmiş ve yapısal ve işlevsel olarak tanımlanmış iki yüzden fazla protein bulunur. Plazma proteinleri ağırlıklı olarak glikoproteinlerdir. elektrofo ile
Globulinler
α1-antitripsin, serum antiproteaz aktivitesinin %80'inden fazlasını oluşturan α1-globulindir ve α-bandının ana bileşenidir. Peynir altı suyu sodasında
Globulinler
Haptoglobin - yarılanma ömrü 2-4 gündür. Serumdaki haptoglobin içeriği normaldir, 0,3 - 2,0 g/l'dir. onun ana işlevsel değer- serumdaki serbest hemoglobini bağlar
Protein elektroforez yöntemleri
Elektroforez, serum proteinlerinin yarı kantitatif tayini ve paraproteinlerin tespiti için yaygın olarak kullanılmaktadır. Elektroforez plazma ile değil serumla yapılır, bu nedenle
İmmünoglobulinler
İmmünoglobulinler (Ig), bağışıklık sistemi tarafından yabancı antijenlere karşı reaksiyon sonucu üretilen ve kan serumunda ve diğer biyolojik sıvılarda biriken spesifik proteinlerdir.
İnsan immünoglobulinleri
Özellik IgM IgG IgA IgD IgE Moleküler form Pentamer
İmmünoglobulinlerin belirlenmesi için yöntemler
Kan serumu ve diğer biyolojik sıvılarda çeşitli sınıflardaki Ig içeriğinin kantitatif tayini için geniş uygulama jelde çökelme reaksiyonunu aşamalandırmak için çeşitli seçenekler buldu
paraproteinler
Paraproteinler, immünoglobulinler veya bunların fragmanlarıdır. Plazma hücreleri, B lenfositlerinin (monoklon) belirli bir hücre hattından oluşur. Paraproteinler genellikle
Kriyoglobulinler
Kriyoglobulinler, 37°C'nin altındaki sıcaklıklarda jöle benzeri bir duruma dönüşme özelliğine sahip patolojik plazma proteinleridir (10-80 mg/ml). Kriyoglobülinlerin çoğu poliklonal komplekslerdir.
Bağışıklık komplekslerinin belirlenmesi için yöntemler
Ig'nin bir antijene bağlanması, antijeni vücuttan uzaklaştırmayı amaçlayan immün komplekslerin (IC) oluşumuna yol açan fizyolojik bir süreçtir. Ancak belirli koşullar altında
Sistemik bağ dokusu hastalıklarının tanısında otoantikorların belirlenmesi
Modern kavramlara göre, otoimmünite, vücutta kendi dokularının normal antijenlerine karşı antikorların veya duyarlı lenfositlerin ortaya çıktığı bu tür durumları ifade eder.
Otoimmün hastalıkların başlıca serolojik belirteçleri
Antijen Orijinal adı Moleküler yapı Fonksiyon Teşhis değeri
Dolaylı immünofloresan reaksiyonunda ANA'nın belirlenmesi
Tipik bir testte, hastanın serumu antijenik substratlarla (hayvan karaciğeri veya böbrek dokusu, Hep-2 hücre kültürü) inkübe edilerek spesifik bağlanma sağlanır.
Dolaylı immünofloresan
Aydınlatma modeli Antijenik özgüllük Klinik önem Periferik veya marjinal dsDNA, l
ANA ve ENA'nın katı faz ELISA ile belirlenmesi
ANA ELISA test sistemi (UBI MAGIWELL) - antinükleer antikorlar için tarama analizi için yarı kantitatif belirleme sağlar geniş bir yelpazede kuyularda adsorbe edilen komplekse karşı antikorlar
otoimmün hastalıklar
Patoloji türü İmmünolojik araştırmanın sonuçları. Antikorların türü ve oluşma sıklığı (%)
sitokin sistemi
Sitokinler, bağışıklık sisteminin gelişimi, işleyişi ve diğer vücut sistemleriyle etkileşimi için gerekli olan bir çözünür peptid aracı sınıfıdır. onlar tanımlar
İnterlökinler
IL-1, enflamatuar reaksiyonlar, doku lezyonları ve enfeksiyonlar sırasında salınan bir immün düzenleyici aracıdır (pro-enflamatuar sitokin). IL-1 çoğalmayı ve farklılaşmayı uyarır
interferonlar
İnterferon (IFN), antiviral aktiviteye sahip bir protein olarak keşfedildi. Antiviral eylem IFN, aşamada virüsün hücre içi replikasyonunu önleme kabiliyetinden kaynaklanmaktadır.
Tümör nekroz faktörleri
Tümör nekroz faktörü (TNF), Gram-negatif bakterilere yanıt olarak vücut tarafından üretilen ana aracıdır. Gram negatif bakterilerin aktif maddesi, hücre duvarının LPS bileşenidir.
koloni uyarıcı faktörler
İmmün yanıtın gelişimi sırasında oluşan bir dizi sitokin, kemik iliği öncüllerinin farklılaşması üzerinde uyarıcı etkiye sahiptir. Bu sitokinlere koloni uyarıcı denir.
büyüme faktörleri
Dönüşen büyüme faktörü (TGFβ), genel büyüme düzenlemesi ve morfogenez süreçleri üzerinde çoklu etkileri olan ilgili peptitlerin bir ailesidir. TGFβ - ana sitok
Sitokinleri belirleme yöntemleri
Çeşitli biyolojik sıvılardaki sitokin içeriğinin belirlenmesi, büyük önem bağışıklık sistemi yeterli hücrelerin fonksiyonel aktivitesinin değerlendirilmesinde ve bağışıklık yanıtının düzenlenmesinde. ayrı satırlarda
Tamamlayıcı sistem
Kompleman sistemi, hümoral bağışıklık ve fagositoz reaksiyonlarının kendi kendini organize edebilen ve aracılık edebilen bir kan serumu proteinleri kompleksidir. Şu anda bilinmektedir ki,
Tamamlayıcı aktiviteyi belirleme yöntemleri
Komplementin toplam aktivitesi (titresi), ram eritrositler kullanılarak hemoliz reaksiyonunda belirlenir. Test serumunda bulunan tamamlayıcı, hassaslaştırılmış koçlarda hemolize neden olur.
%50 HE'de tamamlayıcı titre
Hemoliz,% K Hemoliz, % K Hemoliz, % K Hemoliz, % K
Tamamlayıcı bileşenlerin belirlenmesi
Tamamlayıcı bileşenleri belirlemek için, uygulaması teşhis test sistemlerine ekli talimatlarda açıklanan ELISA ve türbidimetrik yöntem kullanılır. İÇİNDE klinik uygulama Açık
tamamlayıcı bileşenler
tamamlayıcı bileşen Klinik bulgular C1 eksikliği Yediği için genellikle klinik olarak önemli bozukluklara neden olmaz.
Granülositlerin fagositik aktivitesini inceleme yöntemleri
en önemli özelliği Granülositlerin işlevi, fagositik aktivitelerinin değerlendirilmesidir. Azalması, hem serum opsonant faktörlerinin (antikorlar, kompleman) eksikliğinin bir sonucu olabilir.
NST testi
Nitrosin tetrazolyum testi (NCT-testi), sözde aktif granülositleri ve monositleri saptamak için kullanılır. Fagositlerin aktivasyonu, oksidatif reaksiyonlarda keskin bir artışa dayanır.
Araştırma metodolojisi
Gerekli reaktifler ve malzemeler: KN 42 ORO 44 0, Na 42 ORO 44 0, NaCl, glikoz, nitrozin tetrazolyum, heparin, metil alkol, %1 sulu metilen yeşili çözeltisi (olması durumunda
Miyeloperoksidaz tayini
Miyeloperoksidaz, bir renk reaksiyonunun eşlik ettiği hidrojen peroksit varlığında bir dizi substratı (benzidin, ortofenilepiamin) oksitler. Miyeloperoksidaz - faj granüllerinde bulunan bir enzim
kemilüminesans
Kimyasal reaksiyonlar sırasında reaksiyona giren maddelerin enerjisinden dolayı meydana gelen spontan lüminesans, kemilüminesans (CL) olarak adlandırılır. Yaşayan bir organizmanın tüm doku ve hücrelerinde doğal olarak bulunur.
IgE içeriğinin belirlenmesi
Çoğu atopik hastalıkta bağışıklık durumunun spesifik olmayan parametrelerini değerlendirmeye yönelik immünolojik yöntemler arasında, toplam IgE miktarının belirlenmesi en büyük öneme sahiptir. Fakat
Bazofil degranülasyon testi
Alerjik hastalarda, IgE'nin önemli bir kısmı, Fc reseptörleri aracılığıyla çeşitli lökositlere bağlanır. Antikor taşıyan hücrelerin varlığı, karşılık gelen alerjene karşı duyarlı olduklarını gösterir. B
Bazofil hücre antijen stimülasyon testi - CAST
IgE aracılı alerjik reaksiyonlar durumunda tetik mekanizması, alerjenin bazofillerin yüzeyindeki spesifik IgE moleküllerine bağlanmasıyla başlar veya Mast hücreleri. E
Lökosit migrasyonu inhibisyon reaksiyonu
Reaksiyon, iddia edilen alerjene duyarlı hale getirilmiş lenfositleri tanımlayacak şekilde ayarlanır. Hassaslaştırılmış lenfositler, belirli bir alerjenle etkileşime girdiklerinde aracıları serbest bırakır (FPML
Görev 1
23 yaşında hasta yüz ve bacaklarda lokalize tekrarlayan çıbanlardan yakınıyor. Sık soğuk algınlığı (yılda 7-8 defaya kadar), dudaklarda uçuk döküntüleri not eder.
görev #2
22 yaşındaki hasta N., sıklıkla kronik obstrüktif bronşitin alevlenmesinin eşlik ettiği tekrarlayan akut solunum yolu viral enfeksiyonları (yılda 7 defaya kadar) şikayetiyle bir immünoloğa başvurdu. İletilen antibakteriyel
Görev #3
27 yaşındaki hasta T., tekrarlayan akut solunum yolu viral enfeksiyonları, trakeobronşit, halsizlik ve halsizlik nedeniyle defalarca doktora başvurdu. Anamnezden, yıl boyunca altı kez, iki kez ARVI geçirdiği tespit edildi.
Görev #4
Hasta K, 45 yaşında. Teşhis: sistemik lupus eritematozus. İmmünolojik bir çalışma şunları ortaya çıkardı: Lökositler - 5,5 x 109/l Lenfositler -%37, abs. 2,03x109
görev numarası 5
5 yaşında bir çocuk, sık ve uzun süreli hasta çocuklar grubuna aittir, ayda bir ARVI nüksleri, kronik enfeksiyon odakları ( kronik sinüzit, adenoidit), genişlemiş servikal lenf düğümleri
İmmünolojik incelemede
Seviye 1 Testleri Toplam beyaz küre sayısı. Lökoformül T-lenfositleri B-lenfositleri
Genel kan analizi
Norm SI birimleri Hemoglobin MF 130,0-160,0 120,0-140,0 g/l
Bağışıklık sistemi hücrelerinin ana CD belirteçleri
CD işaretçisi Hücre popülasyonu % hücreleri CD2 T ve NK hücreleri
Çocuklarda lenfosit alt popülasyonu
lenfositler 4-5 gün - 3 ay 4-8 ay 1-2 yıl 2-5 yıl 5 yıldan fazla Güneş
Yetişkinlerin kan serumundaki immünoglobulin seviyesi
IgM IgG IgA IgE 1,3-1,7 g/l 12-14 g/l 2,1-2,9 g/l
Çeşitli grupların alerjenlerine karşı spesifik immünoglobülinlerin tespiti için alerjik MAST paneli (çoklu alergosorbent testi)
Yemek paneli Ig E Rus genişletilmiş paneli Ig E Yemek paneli Ig G Rus üniversal paneli Ig E
Terimler Sözlüğü
Avidite, bir antijenin, antikorların afinitesi ve değerliliği ile belirlenen bir antikora bağlanma gücüdür. Aglütinasyon - toplama
Kısaltmalar ve kurallar listesi
AG - antijen AFC - antikor üreten hücre APC - antijen sunan hücre AT - antikor VLS - efferent Lenfatik damar SVK virüs bulaşmış bir virüstür
3-15 yaş arası 45 çocuk muayene edildi. Çalışmanın amacı, apoptoz belirteçleri - CD95, CD95L, BSL2'yi belirleyerek periferik kan lenfositleri ve nötrofillerin apoptoza hazır olup olmadığını belirlemekti. İmmünokompetan hücrelerin apoptozunu değerlendirirken, lenfositlerin programlanmış hücre ölümüne hazır olma durumunda bir azalma ve nötrofilik granülositlerde bir artış bulundu. En belirgin değişiklikler, 3 yıldan fazla hastalık deneyimi olan 7-15 yaş grubunda kaydedilmiştir. Elde edilen veriler, bağışıklık tepkisinin uzamasına katkıda bulunan pankreas dokusundaki otoreaktif lenfositlerin programlanmış ölümünün baskılanmasının bir işareti olabilir. CD95L eksprese eden lökosit hücrelerinin oranındaki bir artış, immünokompetan hücrelerle sızmış pankreatik adacık β-hücrelerinde programlanmış hücre ölümü süreçlerini artırabilir.
nötrofil apoptozu
lenfositlerin apoptozu
tip 1 diyabet
1. Pekareva E. V. Hastalarda apoptoz belirteçleri diyabet Hastalığın başlangıcında Tip 1 / E. V. Pekareva ve diğerleri // Diabetes mellitus. - 2009. - Sayı 4. - S. 86-89.
2. Pekareva E. V. Tip 1 diabetes mellitus patogenezinde apoptozun rolü / E. V. Pekareva, T. V. Nikonova, O. M. Smirnova // Diabetes mellitus. - 2010. - No.1. - S.45-48.
3. Adeghate E. Diabetes mellitusun etiyolojisi ve epidemiyolojisi üzerine bir güncelleme / E. Adeghate, P. Schattner, E. Dunn // Ann NY. Acad Sci, 2006. - Cilt. 1084. – S. 1–29.
4. Tip 2 diabetes mellitus / C hastalarının periferik kanında nötrofil apoptozunun klinik önemi. Sudo ve ark. // Laboratuar Hematol. 2007; 13(3):108-12 (azaltılmış).
5. Filep J. G. Nötrofil apoptozu: enflamasyonun çözünürlüğünü artırmak için bir hedef / J. G. Filep, E. l. Kebir // J. Hücre Biyokimyası. - 2009. - Cilt. 108. – S. 1039–1046.
6. Sağlıklı ve diyabetik deneklerde Burkholderia pseudomallei'ye karşı insan polimorfonükleer nötrofil tepkileri / S. Chanchamroen ve ark. // Bağışıklığı enfekte et. - 2009. - Cilt. 77. - S. 456-463 (düşük apoptoz).
7. Diabetes mellitusta Lenfosit Apoptozunun Etkisi / K. A. Awadhesh ve ark. // Asya Tıp Bilimleri Dergisi. - 2011. - No. 2. - S. 1-6.
8. Tip 1 diyabetik farelerde iltihaplanma daha kalıcıdır / D. T. Graves ve ark. // J. Dent. Res., 2005. Cilt. 84. – S. 324–328.
9. Juliana C. Alves Diabetes mellituslu hastalarda enfeksiyonlar: Patogenezin gözden geçirilmesi / C. Juliana, C. Janine, C. Alves // Indian J. Endocrinol. Metab. – Mart 2012. – Ek l1. – No. 16. – S. 27–36.
10. Luo H. R. Yapıcı nötrofil apoptozu: mekanizmalar ve düzenleme / H. R Luo, F. Loison // Am. J. Hematol. - 2008. - Cilt. 83. – S. 288–295.
giriiş
Tip 1 diabetes mellitus (DM1), pankreatik β-hücrelerine otoantikorların ve otoreaktif T-lenfositlerin oluşumu ile ilişkili poligenik, çok faktörlü bir hastalıktır.
Patogenezde önde gelen bağlantılar otoimmün lezyonlar bağışıklık düzensizliği ve programlanmış hücre ölümüdür.
Kontrollü apoptoz, günümüzde enflamasyonun odağındaki hücrelerin optimal dengesini korumak, aktifleştirilmiş klonların genişlemesini sınırlamak ve otoimmün reaksiyonların gelişmesini önlemek için ana mekanizma olarak kabul edilmektedir. Uygulamasında bir kusur meydana gelirse, aktive edilmiş bağışıklık hücreleri birikebilir ve bu da otoimmün hastalıkların ortaya çıkmasına neden olur.
Bu çalışmanın amacı: çocuklarda tip 1 diabetes mellitusta periferik kan lenfositleri ve nötrofiller üzerindeki CD95, CD95L, Bsl2 apoptoz aktivasyon belirteçlerinin incelenmesi.
Materyal ve araştırma yöntemleri
3-15 yaş arası tip 1 diabetes mellituslu 45 çocuk muayene edildi. Grup I, 3-6 yaş arası 20 çocuk (okul öncesi), grup II - 7-15 yaş arası 12 çocuk (okul çocukları), hastalık süresi 3 yıldan az, grup III - 7-15 yaş arası 13 çocuk (okul çocukları) 3 yıldan fazla hastalık deneyimi ile. Kontrol grubu 3-6 (15) ve 7-15 (15) yaş arası 30 sağlıklı çocuktan oluşturuldu. Çalışma, adını taşıyan Çocuk Şehir Klinik Hastanesi'nin endokrinoloji bölümü temelinde gerçekleştirildi. G. K. Filippsky, Stavropol.
Programlanmış hücre ölümünü değerlendirmek için, apoptoz belirteçlerini ifade eden lenfositlerin ve nötrofilik granülositlerin sayısı belirlendi. Lenfositler, bir Ficoll-Paque yoğunluk gradyanı üzerinde izole edildi, nötrofiller, bir Ficoll-Paque çift yoğunluk gradyanı ve ficoll-urografin (GE Healthcare, İsveç) üzerinde izole edildi. Hücre süspansiyonu, RPMI-1640 ortamında (Vector-Best, Rusya) üç kez yıkandı. Lenfosit ve nötrofil kültürlerinde, CD95, CD95L, Bsl2 ifade eden hücrelerin sayısı, monoklonal antikorlar (Invitrogen, ABD) kullanılarak akış sitometrisi ile tahmin edildi.
İstatistiksel veri analizi için "Primer of Biostat 4.0", Attestat 10.5.1 yazılım paketi kullanıldı. Gruplar arası farklılıkları değerlendirmek için, Newman-Keuls, Dunn kriterlerinin hesaplanmasıyla tekrarlanan ölçümler varyans analizi kullanıldı.
Nicel değerler, anormal bir dağılımla karakterize edildi ve medyan ve nicelikler arası (25. ve 75. yüzdelik) aralık (Me (Q1-Q)) olarak sunuldu. p'deki farklılıklar<0,05.
Sonuçlar ve tartışması
Çalışma, sağlıklı çocuklara kıyasla tüm gruplardaki hastalarda Fas reseptörlerini (CD95) eksprese eden lenfosit sayısında bir azalma buldu (Tablo 1). Minimum göstergeler, 3 yıldan fazla hastalık deneyimi olan 7-15 yaş arası çocuklarda not edildi (Tablo 1).
tablo 1
Tip 1 diabetes mellituslu çocuklarda lenfosit apoptozunun göstergeleri
|
Klinik gruplar |
||||
|
3-6 yaşında |
DM1 (I) (n=20) |
17,7(15,9-19,43) * ** |
7,4(5,81- 8,94) * ** |
70,2(68,56-71,76) * ** |
|
Kontrol grubu |
28,0(26,08-30,0) |
9,2(8,04- 10,25) |
65,9(62,82-69,05) |
|
|
7-15 yaşında |
20,5(17,94-23,02) * ** |
11,6(10,12-13,14) * ** |
70,3(65,72-74,9) * ** |
|
|
13,9(10,04-17,73) * ** |
15,6(14,26-16,87) * ** |
79,5(75,47-83,59) * ** |
||
|
Kontrol grubu |
26,5 (24,20-28,84) |
8,14 (6,49-9,78) |
60,3(56,97-63,66) |
*- P<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- P<0,05 - по сравнению с группой
Anti-apoptotik belirteçlerin (Bsl2) ekspresyon seviyesini değerlendirirken, tüm gruplardaki çocukların lenfositlerinde artışı ortaya çıktı, bu, 3 yıldan fazla hastalık süresi olan okul çocuklarında daha belirgindi ve bu da Fas'a bağlı bir ihlale işaret ediyor. tip 1 diabetes mellituslu çocuklarda apoptoz, lenfositlerin otoreaktif formlarının hücre ölümü süreçlerinin yavaşlamasına yol açar.
Sonuçlarımız, bağışıklık tepkisinin uzamasına katkıda bulunan, pankreas dokusunda aktive edilmiş lenfositlerin programlanmış ölümünün baskılanmasının dolaylı bir işareti olabilir.
Lenfoid hücrelerin apoptotik hazırlık seviyesi, hastalığın süresine bağlıdır ve 3 yıldan fazla DM1 deneyimi olan çocuklarda azalır.
Daha önce diyabette apoptoza lenfosit direncinin saptandığı gösterilmişti, bu da otoimmün tepkinin doğasını ve süresini açıklayabilir.
Diabetes mellituslu çocuklardan alınan lenfosit kültüründe, sağlıklı çocuklar grubuyla karşılaştırıldığında CD95L ifade eden lenfosit yüzdesinde bir artış bulundu (Tablo 1). En yüksek oranlar 3 yıldan fazla hastalık deneyimi olan 7-15 yaş arası çocuklarda belirlendi (Tablo 1).
DM1 pankreas adacıklarında, membran reseptörlerinin anormal ekspresyonunun eşlik ettiği çok çeşitli sitokinler üreten immün hücrelerle infiltre olduğu bilinmektedir. Artan glikoz ve sitokin konsantrasyonunun etkisi altında, β-hücreleri yüzeylerinde neredeyse normda bulunmayan CD95'i ifade etmeye başlar.
Lenfoid hücrelerde CD95L ekspresyonundaki bir artış, muhtemelen pankreatik β-hücrelerinde daha belirgin bir apoptotik sürece ve ardından bunların çıkarılmasına neden olur.
Son yıllarda, nötrofilik granülositlerin otoimmün inflamasyon oluşumunda aktif rol aldığı gösterilmiştir. Otoantijenlerin lokalizasyonunu ve ortadan kaldırılmasını amaçlayan nötrofillerin reaksiyonu, büyük ölçüde, bağışıklık sistemi üzerindeki antijenik etkinin gücüne ve süresine ve ayrıca hücrelerin başlangıç fonksiyonel aktivitesinin düzeyine bağlıdır.
Çocuklarda diabetes mellitus seyrine, apoptoz belirteçleri (CD95) ifade eden nötrofillerin yüzdesinde bir artış ve yüzeylerinde Bsl2 antiapoptotik proteinleri bulunan hücrelerin oranında bir azalmanın eşlik ettiğini bulduk (Tablo 2).
Tablo 2
Tip 1 diabetes mellituslu çocuklarda nötrofil apoptozunun göstergeleri
|
klinik gruplar |
||||
|
3-6 yaşında |
DM1 (I) (n=20) |
75,1(71,49-78,72) * ** |
9,5 (8,63- 10,32) * ** |
3,68 (3,46-3,90 * ** |
|
kontrol grubu |
59,2 (56,31- 62,01) |
7,35 (6,58- 8,12) |
||
|
7-15 yaşında |
DM1, 3 yıldan az hastalık deneyimi (II) (n=12) |
77,6(71,15-83,99) * ** |
9,5(8,14-10,92) * ** |
3,99(2,9- 5,08) * ** |
|
DM1, 3 yıldan fazla hastalık deneyimi (III) (n=13) |
87,9(84,24-91,63) * ** |
12,1(10,22-13,96) * ** |
2,78(2,36-3,19) * ** |
|
|
kontrol grubu |
58,43(54,95- 1,90) |
*- P<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- P<0,05 - по сравнению с группой III (Newman-Keuls kriteri, Dunn kriteri).
Gruplar arası karşılaştırmalı bir özellik ile, CD95'in maksimum göstergeleri (p<0,05) и минимальные Bsl2 (p<0,05) отмечены у детей 7-15 лет с длительностью заболевания более 3-х лет.
Yüzeylerinde CD95L bulunan polimorfonükleer lökositlerin yüzdesinde bir artış ortaya çıktı. En yüksek oranlar, 3 yıldan fazla hastalık deneyimi olan okul çocuklarında kaydedildi.
Literatürde sunulan diabetes mellitusta PMNL apoptozis çalışmasının sonuçları tartışmalıdır. DM1 ve DM2'de periferik kan nötrofillerinin apoptoz oranında bir artış olduğuna dair kanıtlar vardır.
Bununla birlikte, bir dizi çalışma, özellikle muhtemelen doku hasarı ile kronik enflamasyon süreçlerini başlatan ve aynı zamanda tip 1 diyabetli hastalarda uzun süreli bakteriyel enfeksiyonlara zemin hazırlayan hiperglisemi koşulları altında, tip 1 diyabetli hastalarda nötrofilik granülositlerin apoptozunda bir azalma bulmuştur. şeker hastalığı.
Sonuçlarımız, DM1'li hastaların, oluşumu doku hasarını artıran aktif nötrofillerin "fazlalığını" ortadan kaldırmayı amaçlayan koruyucu bir reaksiyonun bir tezahürü olabilecek PMNL'nin apoptoza yatkınlığının arttığını göstermektedir.
Nötrofilik granülositlerin apoptotik potansiyelindeki bir artış, PMNL'nin hastalığın immünopatogenezindeki aktif katılımının bir yansımasıdır.
Diabetes mellituslu hastalarda nötrofilik granülositler üzerindeki CD95L ekspresyonundaki bir artış, muhtemelen sadece pankreatik hücrelerin değil, aynı zamanda kendi lökosit hücrelerinin de eliminasyonuna katkıda bulunabilir.
Bu nedenle, tip 1 diyabetli çocuklarda immün kompetan hücrelerin apoptozunu değerlendirirken, lenfositlerin programlanmış hücre ölümüne hazır oluşlarında azalma ve polimorfonükleer lökositlerde artış bulundu.
En belirgin değişiklikler, 3 yıldan fazla hastalık deneyimi olan 7-15 yaş grubunda kaydedilmektedir. Tüm gruplardaki çocuklarda, yüzeylerinde CD95L ifade eden lökosit hücrelerinin oranında bir artış ortaya çıktı.
PMNL'nin doğal ve kazanılmış bağışıklık arasında bir bağlantı olduğu ve antibakteriyel korumada öncü rol oynadığı bilinmektedir.
Apoptotik aktivitelerindeki bir artış, bir çocuğun düşük yaştaki direncine ve bulaşıcı hastalıklara karşı duyarlılığına neden olabilir.
Apoptoza duyarlı lenfoid hücrelerin sayısındaki azalma, programlanmış hücre ölümünün baskılanmasının ve lenfositlerin aktive formlarının bozulmuş eliminasyonunun dolaylı bir işaretidir.
sonuçlar
1. Tip 1 diyabetli çocuklarda, periferik kan lenfositlerinin apoptoza hazır olma durumunda bir azalma, nötrofilik granülositlerde bir artış vardır, buna CD95 ve Bsl2 ekspresyonunda bir değişiklik eşlik eder ve hastalığın süresine bağlıdır. .
2. DM1'de lenfositler ve nötrofilik granülositler üzerindeki CD95L ekspresyonundaki bir artış, immünokompetan hücrelerle sızmış pankreatik adacık β-hücrelerinde programlanmış hücre ölümü süreçlerini artırabilir.
İnceleyenler:
Shchetinin E.V., Tıp Bilimleri Doktoru, Profesör, Araştırma ve İnovasyondan Sorumlu Rektör Yardımcısı, SSMU, Rusya Federasyonu Sağlık Bakanlığı, Stavropol HBO HPE "Stavropol Devlet Tıp Üniversitesi" Bölüm Başkanı.
Golubeva M.V., Tıp Bilimleri Doktoru, Profesör, Pediatrik Bulaşıcı Hastalıklar Anabilim Dalı Başkanı, Stavropol Devlet Tıp Üniversitesi, Stavropol Devlet Tıp Üniversitesi, Stavropol.
bibliyografik bağlantı
Barycheva L.Yu., Erdni-Goryaeva N.E. ÇOCUKLARDA TİP 1 DIABETES MELLITUS'TA İMMÜNOKOMPETAN HÜCRELERİN APOPTOSİS BELİRTİCİLERİ // Modern bilim ve eğitim sorunları. - 2013. - 4 numara;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=9953 (erişim tarihi: 18.07.2019). "Academy of Natural History" yayınevi tarafından yayınlanan dergileri dikkatinize sunuyoruz.