Marcatori di apoptosi e proliferazione cellulare. Problemi moderni della scienza e dell'istruzione Indicatori di apoptosi

Sia l'accelerazione che la decelerazione dell'apoptosi possono avere un effetto cardinale sul corso di una serie di processi patologici nel corpo. Le sostanze coinvolte nella regolazione dell'apoptosi sono generalmente proteine ​​e la loro sintesi è controllata dai geni corrispondenti. Gli stessi geni che regolano il livello di apoptosi si possono trovare negli esseri viventi a vari stadi della scala evolutiva. I geni che stimolano l'apoptosi includono i geni p53, Bax e bcl-xS. D'altra parte, sono stati descritti geni che sintetizzano proteine ​​che inibiscono l'apoptosi (Bcl-2, Ced-9, BHRF1, MCL-1). Le proteine ​​​​pro e anti-apoptotiche sono in grado di combinarsi tra loro, formando omo ed eterodimeri. Ad esempio, quando un inibitore dell'apoptosi della proteina Bcl-2 è combinato con la proteina Bax dell'attivatore dell'apoptosi, il risultato (inibizione o attivazione dell'apoptosi) sarà determinato da quale proteina predominerà in questa combinazione.

Le proteine ​​più sorprendenti e informative che riflettono i processi sintetici in corso nelle cellule e nei tessuti sono le proteine ​​della famiglia Bcl-2, che occupano un posto centrale nello studio della regolazione del processo di apoptosi. Si consiglia di considerare il meccanismo di regolazione di questo processo dal punto di vista delle relazioni strutturali e funzionali tra le proteine ​​\u200b\u200bdi questa famiglia, che consentono loro di essere combinate in un'unica famiglia: le proteine ​​​​Bcl-2. Le proteine ​​di questa famiglia Bcl-2 sono in costante equilibrio dinamico, formando omo ed eterodimeri, che alla fine influenzano lo sviluppo dell'apoptosi cellulare. Pertanto, si ritiene che il rapporto tra le forme attive di queste proteine ​​determini l'equilibrio tra la vita e la morte della cellula.

Ormai è noto che le proteine ​​della famiglia Bcl-2 sono o induttori di apoptosi (Bad, Bax, J3ik, Bid, Bak) o inibitori (Bcl-2, Bcl-X). La proteina della famiglia Bcl-2 appartiene alla classe G - proteine. La proteina da 26 kJ codificata dal gene Bcl-2 contiene un dominio transmembrana ed è localizzata nella membrana mitocondriale, nel reticolo endoplasmatico perinucleare, nella membrana nucleare e nei cromosomi mitotici.

Bcl-2 è un fattore di sopravvivenza cellulare, la protegge dalla morte programmata e presenta proprietà oncogeniche, in quanto previene l'apoptosi. Il gene Bcl-2 funziona come un regolatore negativo dell'apoptosi. È stato stabilito che una diminuzione della concentrazione di Bcl-2 porta alla morte cellulare per apoptosi, mentre la sua sovraespressione protegge le cellule dalla morte.

La sequenza di eventi che portano una cellula all'apoptosi come risultato dell'interazione di proteine ​​della famiglia del TNF con recettori specifici è la meglio studiata. brillante rappresentante questo gruppo di proteine ​​è il sistema Apo-1/Fas/FasL. Va notato che per questo sistema non è nota alcuna funzione diversa dall'induzione dell'apoptosi cellulare.

Apo-1/Fas/CD-95 è un recettore strutturalmente correlato alla famiglia di recettori del TNF. L'interazione di Apo-1/Fas (recettore) con FasL (ligando) o con anticorpi monoclonali porta all'apoptosi cellulare. Apo-1/Fas è espresso costitutivamente sulla superficie di molti tipi di cellule: su timociti, linee cellulari linfoblastoidi, linfociti T e B attivati, nonché su fibroblasti, epatociti, cheratinociti e cellule mieloidi. L'Apo-1/Fas umano consiste di 325 residui di aminoacidi ed è una proteina di membrana di tipo I. Quelli. la sua struttura può essere suddivisa in domini extracellulari, transmembrana e citoplasmatici. L'omologia della sequenza amminoacidica tra i recettori della famiglia del TNF è elevata. Circa 80 residui amminoacidici formano il dominio della morte (DD), che è coinvolto nell'interazione proteina-proteina con le proteine ​​citoplasmatiche, generando il segnale di morte. Il gene Apo-1/Fas nell'uomo si trova sul braccio lungo del cromosoma 10 ed è composto da 9 esoni.

FasL è una citochina e appartiene alla famiglia delle citochine TNF. FasL è espresso su linfociti T attivati ​​e cellule natural killer, nonché su cellule di Sertoli e cellule parenchimali della camera anteriore dell'occhio, che consente a queste cellule di uccidere qualsiasi cellula che esprime Fas, incluso il linfocita T attivato. Questo meccanismo determina la comparsa di luoghi protetti dal sistema immunitario. FasL esiste in due forme: insolubile o legato alla membrana e solubile, che viene scisso dalla cellula dalla metalloproteinasi. La forma solubile di sFasL umano rimane attiva. Come altri ligandi del recettore della famiglia del TNF, sFasL è un omotrimero che si lega a 3 molecole Apo-1/Fas.

Quando il ligando si lega al recettore, si verifica l'oligomerizzazione delle proteine ​​citoplasmatiche, come DD (dominio della morte), correlata al recettore, una proteina adattatrice - FADD (Dominio della morte associato a Fas), contenente DED - il dominio effettore della morte e procaspasi- 8. Come risultato di questo processo, viene attivata la proteasi specifica dell'apoptosi, la caspasi-8, e si sviluppano i processi caratteristici dell'apoptosi. Le mutazioni nel gene fas o nel gene FasL portano allo sviluppo Malattie autoimmuni.

Apo-1/Fas è una proteina che contiene 1 regione transmembrana che, legandosi a FasL, induce l'apoptosi nelle cellule bersaglio. Esiste anche una forma solubile e priva di transmembrana di Apo-1 (sApo-1/Fas) che è presente nel siero e in altri fluidi corporei. Secondo la letteratura, questa forma secretoria (sApo-1/Fas) può proteggere le cellule dall'apoptosi indotta da Apo-1/ligando ed è formata dalla scissione di un residuo amminoacidico dal dominio transmembrana.

Negli ultimi anni, l'identificazione dell'apoptosi viene spesso effettuata determinando l'attività delle caspasi, sia iniziatori che effettrici. Nella maggior parte dei lavori svolti con lo studio dell'attività della caspasi, si considera la caspasi-3, poiché su di esso convergono vari percorsi di morte apoptotica e la sua attivazione indica la presenza di apoptosi. Tuttavia, se nello studio viene introdotta la determinazione dell'attività della caspasi-8, oltre a identificare la morte cellulare programmata in quanto tale, è anche possibile determinare il percorso per il suo innesco, poiché L'attivazione della caspasi-8 indica il meccanismo del recettore (esterno) di inizio del processo. Questo è un grande vantaggio questo metodo.

Ad oggi, più di 60 vari metodi rilevamento e studio di cellule apoptotiche in vitro. La letteratura descrive diversi approcci metodologici alla rilevazione in vivo di cellule apoptotiche in vivo. Questi metodi sono basati su qualitativo o quantificazione eventi causati da cambiamenti nella membrana esterna delle cellule, frammentazione selettiva del DNA nucleare, cambiamenti nella struttura dei componenti intracellulari o loro ridistribuzione, nonché diminuzione del pH del citoplasma. Inoltre, ci sono forme atipiche di apoptosi, in cui non ci sono cambiamenti apoptotici marcatori.

Per ovvie ragioni, è impossibile studiare i meccanismi dell'apoptosi GCS nel POAG nell'uomo in vivo. Come indicatore indiretto nello studio del ruolo dell'apoptosi nella patogenesi del POAG, sono stati valutati i marcatori apoptotici nei linfociti del sangue periferico, caratterizzando la prontezza di quest'ultimo per l'apoptosi. Per determinare le cellule apoptotiche si utilizzano: scansione laser e citometria a flusso, emissione di singolo fotone TAC, risonanza magnetica (MRI), spettroscopia di risonanza magnetica, tomografia ad emissione di positroni. Inoltre, per identificare la morte cellulare apoptotica, microscopia ottica e fluorescente utilizzando metodi convenzionali di fissazione e colorazione, metodi microscopici elettronici, rilevamento della degradazione del DNA oligonucleosomiale in situ, rilevamento immunoistochimico delle proteine ​​- marcatori coinvolti nella morte cellulare programmata o DNA frammentato, determinazione di attività caspasi.

Lo studio dell'apoptosi su preparati colorati con metodi standard è ampiamente utilizzato a causa della relativa semplicità di questi metodi. I risultati ottenuti contando le cellule alterate apoptoticamente sono espressi come il cosiddetto indice apoptotico. I criteri per la morte cellulare programmata possono essere la marginazione della cromatina e la picnosi, i cambiamenti nei contorni del nucleo, i cambiamenti nei contorni e la frammentazione delle cellule e la comparsa di nuclei liberi.

La microscopia a fluorescenza viene spesso utilizzata come metodo soggettivo per rilevare la morte cellulare programmata. Vengono esaminate sia le cellule colorate in modo vitale in sospensione che le preparazioni fissate. Quando si lavora con cellule viventi, l'etichettatura dell'annessina V è ampiamente utilizzata, il che rende possibile rilevare la fosfatidilserina che compare durante l'apoptosi sul lato esterno della membrana plasmatica.

Quando si analizzano le cellule al microscopio a fluorescenza, vengono prese in considerazione le seguenti caratteristiche: la dimensione del nucleo (diminuzione), la natura della distribuzione della cromatina (condensazione in grumi forma irregolare, compattazione), corpi di cromatina (conservazione dell'isolamento della membrana), natura della luminescenza del DNA. Il DNA apoptotico appare come un giallo-verde brillante condensato. Nelle cellule vitali, l'arancio di acridina provoca una diffusa fluorescenza verde.

Con l'aiuto di studi immunoistochimici, viene determinata la presenza di proteine ​​​​che formano una cascata di processi biochimici che portano all'apoptosi. Spesso questo gruppo di metodi include TUNEL ed ELISA.

Molti ricercatori assegnano un ruolo di primo piano all'apoptosi nei cambiamenti strutturali del disco. nervo ottico(ONH), causato dalla perdita di GCS. Il ruolo dell'apoptosi nello sviluppo di malattie degenerative è fuor di dubbio. C'è materiale sperimentale convincente che indica la partecipazione del processo apoptotico nel meccanismo di GON in POAG. Tuttavia, in generale, gli studi clinici sui fattori di apoptosi in pazienti con diversi stadi di glaucoma sono molto limitati, il che rende difficile studiare il loro ruolo nella patogenesi della GON.

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CAD (DNasi attivata dalla caspasi) in frammenti multipli di 180-200 nucleotidi. L'apoptosi provoca la formazione di corpi apoptotici - vescicole di membrana contenenti organelli integrali e frammenti di cromatina nucleare. Questi corpi vengono assorbiti dalle cellule vicine o dai macrofagi attraverso la fagocitosi. Poiché la matrice extracellulare non è influenzata dagli enzimi cellulari, anche con un gran numero di cellule apoptotiche, non si osserva infiammazione.

Il processo di apoptosi è necessario per la regolazione fisiologica del numero di cellule nel corpo, per la distruzione delle vecchie cellule, per la formazione di linfociti che non reagiscono ai loro antigeni (auto-antigeni), per la caduta delle foglie autunnali di piante, per l'azione citotossica dei linfociti T-killer, per lo sviluppo embrionale dell'organismo (scomparsa delle membrane cutanee tra le dita negli embrioni di uccelli) e altri.

La violazione dell'apoptosi cellulare normale porta alla proliferazione cellulare incontrollata e alla comparsa di un tumore.

1. Significato dell'apoptosi

L'apoptosi è parte integrante dell'attività vitale della maggior parte degli organismi multicellulari. Particolarmente ruolo importante gioca nei processi di sviluppo. Ad esempio, gli arti dei tetrapodi vengono deposti come una crescita a forma di vanga e la formazione delle dita avviene a causa della morte delle cellule tra di loro. Anche le cellule non più necessarie sono soggette ad apoptosi, quindi la coda nei girini viene distrutta in particolare durante la metamorfosi. Nel tessuto nervoso dei vertebrati durante lo sviluppo embrionale, più della metà dei neuroni muore per apoptosi subito dopo la formazione.

Inoltre, l'apoptosi fa parte del sistema di controllo della "qualità" delle cellule, consente di distruggere quelle localizzate in modo errato, danneggiate, non funzionali o potenzialmente pericolose per l'organismo. Un esempio sono i linfociti B, che muoiono se non portano recettori antigene-specifici utili o se sono autoreattivi. Per apoptosi, la maggior parte dei linfociti attivati ​​durante l'infezione muoiono anche dopo che è stata superata.

Negli organismi adulti, la regolazione simultanea della proliferazione cellulare e dell'apoptosi consente di mantenere la dimensione dell'intero individuo e dei suoi singoli organi. Ad esempio, dopo l'impianto del farmaco fenobarbital, che stimola la proliferazione degli epatociti, il fegato aumenta nei ratti. Tuttavia, subito dopo la cessazione dell'azione di questa sostanza, tutte le cellule in eccesso subiscono l'apoptosi, con conseguente ritorno alla normalità delle dimensioni del fegato.

L'apoptosi si verifica anche quando una cellula "sente" una grande quantità di danni interni che non può riparare. Ad esempio, in caso di danno al DNA, una cellula può trasformarsi in una cellula tumorale, in modo che ciò non accada, in condizioni normali "si suicida". Inoltre, un gran numero di cellule infette da virus muore per apoptosi.

2. Marcatori di cellule apoptotiche

Marcatori di apoptosi

Rilevazione della frammentazione del DNA nelle cellule apoptotiche mediante metodo TUNEL Preparazione del tessuto epatico di topo, il nucleo della cellula apoptotica ha un colore marrone, microscopia ottica.

Rilevazione della frammentazione del DNA nelle cellule apoptotiche mediante elettroforesi su gel di agarosio. A sinistra: DNA isolato da cellule apoptotiche - è visibile la "scala del DNA"; al centro: marcatori; caso: campione di controllo del DNA da cellule non trattate. Linea cellulare H4IIE (epatoma di ratto), induttore di apoptosi - paraquat, visualizzazione con bromuro di etidio.

In alto: rilevamento della condensazione e della frammentazione della cromatina mediante colorazione con colorante fluorescente (Hoechst 34580). Al centro: rilevamento della traslocazione della fosfatidilserina nel lembo esterno del plasmalemma mediante colorazione con annessina V. In basso: micrografia in campo chiaro di cellule apoptotiche. Linea cellulare - Jurkat, induttore di apoptosi - TRAIL, confocale e microscopia ottica con sega a luce.

Le cellule che muoiono per apoptosi possono essere riconosciute da una serie di caratteristiche morfologiche. Diventano più piccoli e più densi (picnosi), rotondi e perdono pseudopodi, il citoscheletro crolla in essi, la membrana nucleare si disintegra, la cromatina si condensa e si frammenta. Un gran numero di vescicole appare sulla superficie delle cellule, se le cellule sono abbastanza grandi, si disintegrano in frammenti circondati da membrane - corpi apoptotici.

Nelle cellule apoptotiche, oltre ai cambiamenti morfologici, si verificano anche un gran numero di cambiamenti biochimici. In particolare, il DNA viene tagliato da speciali nucleasi nelle regioni di collegamento tra i nucleosomi in frammenti uguale lunghezza. Pertanto, quando si separa l'intero DNA di una cellula apoptotica mediante elettroforesi, si può osservare una caratteristica "scala". Un altro metodo per rilevare la frammentazione del DNA consiste nel contrassegnare le sue estremità libere utilizzando il metodo TUNEL ( T erminale deossinucleotidil transferasi d U TP N schifo e nd l abeling ) .

Anche la membrana plasmatica delle cellule apoptotiche subisce dei cambiamenti. In condizioni normali, il fosfolipide fosfatidilserina caricato negativamente è contenuto solo nel suo strato interno (restituito al citosol), ma durante l'apoptosi "salta" nel foglio esterno. Questa molecola funge da segnale "mangiami" per i fagociti vicini. L'assorbimento indotto dalla fosfatidilserina delle cellule apoptotiche, a differenza di altri tipi di fagocitosi, non provoca il rilascio di mediatori dell'infiammazione. Il cambiamento descritto nella membrana plasmatica è alla base di un altro metodo per rilevare le cellule che muoiono per apoptosi: la colorazione con anexina V, che si lega specificamente alla fosfatidilserina.

3. Caspase - mediatori dell'apoptosi

I sistemi cellulari che assicurano il passaggio dell'apoptosi sono simili in tutti gli animali; la famiglia delle proteine ​​​​caspasi occupa un posto centrale in essi. Le caspasi sono proteasi che hanno un residuo di cisteina nel loro sito attivo e tagliano i loro substrati in corrispondenza di uno specifico residuo di acido aspartico (da qui il nome: C da cisteina E aspide da acido aspartico). Le caspasi sono sintetizzate nella cellula sotto forma di procaspasi inattive, che possono diventare substrati per altre caspasi già attivate, che le tagliano in uno o due punti al residuo di aspartato. Due frammenti formati - uno più grande e uno più piccolo - sono interconnessi, formando un dimero che si associa allo stesso dimmer. Il tetramero così formato è una proteasi attiva, che può tagliare le proteine ​​del substrato. Oltre alle regioni corrispondenti alle subunità più grandi e più piccole, le procaspasi a volte contengono anche prodomini inibitori che vengono degradati dopo la scissione.

Come risultato della scissione e dell'attivazione di alcune caspasi da parte di altre, si forma una cascata protealitica, che potenzia significativamente il segnale e rende l'apoptosi un processo irreversibile da un certo momento. Quelle procaspasi che danno inizio a questa cascata sono dette iniziatiche ei loro substrati sono detti effettrici. Dopo l'attivazione, le caspasi effettrici possono scindere altre procaspasi effettrici o proteine ​​bersaglio. I bersagli delle caspasi effettrici che vengono distrutte durante l'apoptosi includono, in particolare, le proteine ​​​​della lamina nucleare, la cui scissione porta alla rottura di questa struttura. Degrada anche la proteina, in condizioni normali inibisce le endonucleasi CAD, a seguito della quale inizia la frammentazione del DNA. La caspasi e le proteine ​​di adesione citoscheletrica e intercellulare vengono scisse, a seguito della quale le cellule apoptotiche si arrotondano e si staccano dalle cellule vicine, diventando così bersagli più facili per i fagociti.

L'insieme di caspasi richiesto per l'apoptosi dipende dal tipo di tessuto e dal percorso attraverso il quale viene attivata la morte cellulare. Ad esempio, nei topi, quando il gene che codifica per l'effettore caspasi-3 viene "disattivato", l'apoptosi non si verifica nel cervello, ma normalmente procede in altri tessuti.

I geni della procaspasi sono attivi nelle cellule sane, e quindi le proteine ​​​​sono necessarie per il verificarsi dell'apoptosi e sono costantemente presenti, solo la loro attivazione è necessaria per innescare il suicidio cellulare. Le procaspasi dell'iniziatore includono un lungo prodominio contenente CARD ( dominio di reclutamento caspase , dominio di attrazione delle caspasi). CARD consente agli iniziatori della procaspasi di attaccarsi alle proteine ​​adattatrici per formare complessi di attivazione quando la cellula riceve un segnale che stimola l'apoptosi. Nei complessi di attivazione, diverse molecole pro-caspasi si trovano in stretta vicinanza l'una all'altra, il che è sufficiente per entrare nello stato attivo, dopodiché si tagliano a vicenda.

I due percorsi di segnalazione meglio compresi per l'attivazione della cascata della caspasi nelle cellule di mammifero sono chiamati estrinseco e intrinseco (mitocondriale), ciascuno utilizzando il proprio iniziatore procaspasi.

4. Strade di attivazione dell'apoptosi

4.1. percorso esterno

La cellula può ricevere un segnale che induce l'apoptosi dall'esterno, ad esempio dai linfociti citotossici. In questo caso viene attivato il cosiddetto percorso esterno ( via estrinseca) A cominciare dai recettori della morte. I recettori della morte sono proteine ​​transmembrana appartenenti alla famiglia dei recettori del fattore di necrosi tumorale (TNF), come il recettore del TNF stesso e il recettore della morte Fas. Formano omotrimeri, in cui ogni monomero ha un dominio di legame al ligando extracellulare, un dominio transmembrana e un dominio di morte citoplasmatica, attrae e attiva le procaspasi tramite proteine ​​adattatrici.

Anche i ligandi del recettore della morte sono omotrimerami. Sono correlati tra loro e appartengono alla famiglia delle molecole di segnalazione del fattore di necrosi tumorale. Ad esempio, i linfociti citotossici portano ligandi Fas sulla loro superficie, che possono legarsi ai recettori della morte Fas sul plasmalemma delle cellule bersaglio. In questo caso, i domini intracellulari di questi recettori sono collegati alla proteina adattatrice ( FADD, dominio della morte associato a Fas ) e, a loro volta, attraggono con l'inizio la pro-caspasi 8 e/o 10. Come risultato di questa serie di eventi, si forma un complesso di segnalazione che induce la morte - DISC ( complesso di segnalazione che induce la morte ). Dopo l'attivazione in questo complesso da parte delle caspasi iniziatrici, esse scindono le procaspasi effettrici e innescano la cascata apoptotica.

Molte cellule sintetizzano molecole che, in una certa misura, le proteggono dall'attivazione della via esterna dell'apoptosi. Un esempio di tale protezione sarebbe l'espressione dei cosiddetti recettori decoy ( recettori esca), che hanno domini di legame del ligando extracellulare, ma non domini di morte citoplasmatica, e quindi non possono innescare l'apoptosi e competere con i recettori di morte convenzionali per i ligandi. Le cellule possono anche produrre proteine ​​che bloccano la via estrinseca dell'apoptosi, come FLIP, che è simile nella struttura alle procaspasi 8 e 10 ma non ha attività proteolitica. Inibisce il legame delle procaspasi dell'iniziatore al complesso DISC.

4.2. Percorso interiore

Apoptosoma

L'apoptosi può anche essere innescata dall'interno della cellula, ad esempio, in caso di lesioni, danni al DNA, mancanza di ossigeno, nutrienti o segnali di sopravvivenza extracellulare. Nei vertebrati, questa via di segnalazione è chiamata intrinseca ( percorso intrinseco) o mitocondriale, Evento chiave in esso è il rilascio di alcune molecole dallo spazio intermembrana dei mitocondri. Il ciclocromo c si trova davanti a tali molecole di zocrema, che entrano nella lancia di trasporto degli elettroni dei mitocondri, la prote nel citoplasma svolge un'altra funzione: arriva alla proteina dell'adattatore Apaf ( fattore di attivazione della proteasi apoptotica l ), facendolo oligomerizzare in una struttura a sette membri a forma di ruota chiamata apoptosoma. L'apoptosoma recluta e attiva l'iniziatore procaspasi-9, che può quindi attivare l'iniziatore procaspasi.

In alcune cellule, la via dell'apoptosi estrinseca deve attivare quella intrinseca per distruggere efficacemente la cellula. Il percorso interno è altamente regolato dalle proteine ​​della famiglia Bcl-2.

4.2.1. Regolazione della via intrinseca da parte delle proteine ​​della famiglia Bcl-2

La famiglia Bcl-2 comprende proteine ​​evolutivamente conservate la cui funzione principale è quella di regolare il rilascio del citocromo c e di altre molecole dallo spazio intermembrana dei mitocondri. Tra questi ci sono molecole pro-apoptotiche e anti-apoptotiche che possono interagire tra loro in varie combinazioni, sopprimendosi a vicenda, bilanciando la loro attività e determinando il destino della cellula.

Sono ora note circa 20 proteine ​​di questa famiglia, tutte contenenti almeno uno dei quattro domini di omologia Bcl2 alfa elicoidali chiamati BH1-4 ( bcl2 omologia). Le proteine ​​​​anti-apoptotiche della famiglia Bcl2 contengono tutti e quattro i domini, incluso lo stesso Bcl-2, nonché Bcl-X L, Bcl-w, Mcl-1 e A1. Le proteine ​​pro-apoptotiche sono divise in due gruppi, membri del primo dei quali contengono tre domini BH (BH1-3), questi sono in particolare Bak, Bax e Bok (quest'ultimo è espresso solo nei tessuti degli organi riproduttivi) . Il più numeroso della famiglia Bcl-2 è il secondo gruppo di proteine ​​proapoptotiche che contengono solo il dominio BH3 (solo BH3), include Bim, Bid, Bad, Bik/Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma.

In condizioni normali (cioè quando la cellula non sta subendo l'apoptosi), le proteine ​​anti-apoptotiche come Bcl-2 e Bcl-XL si legano alle proteine ​​pro-apoptotiche BH123 (Bax e Bak) e impediscono loro di polimerizzare nella membrana mitocondriale esterna formare pori. Come risultato dell'azione di un certo stimolo apoptotico, le proteine ​​​​proapoptotiche contenenti solo il dominio BH3 vengono attivate o iniziano a essere sintetizzate nella cellula. Essi, a loro volta, inibiscono le proteine ​​anti-apoptotiche, rimuovendo l'effetto inibitorio su Bak e Bax, oppure interagiscono direttamente con quest'ultimo e ne promuovono l'oligomerizzazione e la formazione di pori. A causa della permeabilizzazione della membrana esterna, il citocromo c entra nel citosol, così come altri mediatori dell'apoptosi, come l'AIF. fattore che induce l'apoptosi ).

Ad esempio, quando c'è una mancanza di segnali di sopravvivenza nella cellula, la MAP chinasi JNK attiva l'espressione della proteina BH3 Bim, che innesca la via interna dell'apoptosi. In caso di danno al DNA, si accumula il soppressore tumorale p53, che stimola la trascrizione dei geni che codificano per le proteine ​​​​BH3 Puma e Noxa, che assicurano anche il passaggio dell'apoptosi. Un'altra proteina BH3, Bid, fornisce un collegamento tra le vie estrinseche e intrinseche dell'apoptosi. Dopo l'attivazione dei recettori della morte e, di conseguenza, della caspasi-8, quest'ultima scinde Bid per formare una forma troncata di tBid (troncato Bid), che si sposta nei mitoconri, dove sopprime Bcl-2.

apoptosi- questa è una forma programmata, geneticamente mediata, di morte cellulare, in cui segnali esterni o interni danno un impulso alla cellula per formare o attivare enzimi, portandola all'autodistruzione. Morfologicamente, l'apoptosi è caratterizzata da restringimento della cellula, condensazione e frammentazione del nucleo, distruzione del citoscheletro e protrusione bollosa della membrana cellulare. Una caratteristica dell'apoptosi è che una cellula morente conserva l'integrità della sua membrana fino al completamento del processo, e solo allora la distruzione della sua membrana è un segnale per i fagociti vicini per assorbire i frammenti rimanenti e completare il processo di degradazione cellulare. Le cellule apoptotiche che non subiscono la fagocitosi immediata si trasformano in piccoli frammenti legati alla membrana chiamati "corpi apoptotici". Una caratteristica importante dell'apoptosi è che la rimozione delle cellule morenti avviene senza lo sviluppo dell'infiammazione.

L'apoptosi svolge un ruolo importante nei processi fisiologici: organogenesi, sviluppo embrionale, regolazione della composizione e del numero di popolazioni cellulari nei tessuti di un organismo adulto, vari cambiamenti ormonali nell'organismo. Il ruolo dell'apoptosi è importante anche in vari processi patologici. È più completamente studiato nella crescita del tumore.

Il processo di apoptosi può essere suddiviso in due fasi:

formazione e conduzione dei segnali apoptotici - la fase decisionale;

smantellamento strutture cellulari- fase effettrice.

L'implementazione dei meccanismi dell'apoptosi è associata all'attivazione di enzimi cellulari endogeni - cisteina proteasi (caspasi). Le caspasi si trovano nelle cellule in uno stato inattivo (procaspasi). L'attivazione avviene mediante la loro scissione proteolitica e la successiva dimerizzazione con la formazione di subunità attive. I bersagli delle caspasi sono proteine ​​responsabili di varie funzioni vitali della cellula. Attualmente sono stati descritti 14 tipi di caspasi, che, secondo caratteristiche funzionali possono essere divisi in 3 gruppi:

attivatori di citochine (caspasi 1, 4, 5, 13)

caspasi - induttori dell'attivazione delle caspasi effettrici (caspasi 2, 8, 9, 10)

caspasi effettrici - esecutori di apoptosi (3, 6, 7)

Uno della membrana recettori cellulari responsabile dei meccanismi dell'apoptosi è una proteina chiamata recettore Fas (CD95/APO1). Il ligando per il recettore Fas è una proteina - ligando Fas (Fas-L), che appartiene alla famiglia dei fattori necrotici tumorali e può essere presentato sia sotto forma di proteina di membrana che in forma solubile. Il legame del recettore Fas al ligando Fas porta all'attivazione di meccanismi di apoptosi con l'attivazione di induttori di caspasi. Alla successiva attivazione delle caspasi effettrici, inizia una catena di reazioni proteolitiche, il cui scopo è lo "smantellamento" apoptotico della cellula: frammentazione del DNA, scissione diretta delle proteine ​​​​strutturali della cellula e disregolazione della sintesi proteica. Pertanto, la partecipazione delle caspasi effettrici all'apoptosi porta alla rottura della cellula apoptotica con le cellule circostanti, riorganizzazione del citoscheletro, possibilità ridotte di riparazione e replicazione del DNA, rottura della membrana nucleare e distruzione del DNA, rilascio di segnali che segnano la cellula per l'apoptosi , e dissezione della cellula in corpi apoptotici. Non è un caso che le caspasi effettrici siano chiamate "caspasi boia".

I metodi per studiare l'apoptosi sono piuttosto diversi. Inizialmente, il metodo più comune per determinare l'apoptosi era l'elettroforesi della frazione di DNA estratta, che consente di rivelare la discretezza del DNA a basso peso molecolare per mol. massa (come risultato della degradazione internucleosomiale del DNA). Negli studi morfologici, per rilevare le rotture del DNA, viene utilizzato il metodo TUNEL, che si basa sulla formazione di inserti oligonucleotidici marcati nelle regioni delle rotture del DNA, la cui formazione è catalizzata dall'enzima TdT.

Attualmente, i metodi basati sulla citometria a flusso sono sempre più utilizzati per registrare l'apoptosi dei linfociti. Questo gruppo include un metodo basato sul rilevamento della perdita di una parte del DNA da parte delle cellule (cellule ipodiploidi) utilizzando un colorante fluorescente - ioduro di propidio, descritto di seguito. Altri metodi basati sulla citometria a flusso vengono utilizzati anche per determinare l'apoptosi. L'apoptosi dei linfociti può essere rilevata già in una fase iniziale utilizzando l'annessina V marcata con fluorocromo, che si lega alla fosfatidilserina che appare sulla membrana delle cellule in fase di apoptosi. Un'idea approssimativa della "tendenza" dei linfociti a sviluppare l'apoptosi può essere ottenuta determinando l'espressione sulla loro superficie del recettore Fas (CD95) e nei mitocondri del protoncogeno bcl-2.

Il significato clinico della valutazione dell'apoptosi durante l'esame clinico e immunologico dei pazienti è indubbio, poiché numerose malattie sono associate alla sua violazione. L'indebolimento dell'apoptosi è dovuto alla formazione di malattie autoimmuni (a causa di una violazione del processo di abbattimento di cloni autospecifici di linfociti). Pertanto, la registrazione dell'indebolimento dell'apoptosi può servire come fonte di informazioni sui meccanismi patogenetici di tali malattie autoimmuni come il lupus eritematoso sistemico, artrite reumatoide, così come la sindrome linfoproliferativa autoimmune, la cui base è una mutazione dei geni che determinano i recettori per i segnali apoptotici. La violazione dell'apoptosi è un meccanismo importante per lo sviluppo di processi maligni. Nelle cellule tumorali viene spesso rilevata una mutazione del gene p53, che codifica una proteina che percepisce un segnale sulla presenza di rotture non riparate nel DNA e mutazioni cromosomiche portando allo sviluppo dell'apoptosi. Di conseguenza, le cellule geneticamente difettose non vengono scartate e diventano una fonte di formazione del tumore.

In una serie di altre malattie, al contrario, si nota un aumento dell'apoptosi. Ciò si verifica durante i processi infettivi (la causa dell'apoptosi di massa delle cellule T è spesso superantigeni microbici), sepsi, vari malattie virali, compreso l'AIDS. L'apoptosi è potenziata in una serie di malattie del sangue e immunodeficienze primarie quando la sua causa è una produzione insufficiente di fattori di sopravvivenza cellulare, il cui ruolo è svolto dalle citochine. Pertanto, in una delle forme di immunodeficienza combinata grave associata a una mutazione del gene IL-7 o della catena γ comune dei recettori delle citochine, la morte dei precursori linfoidi a causa della carenza di IL-7 è.

Tuttavia, la più significativa in generale è la valutazione dell'"apoptosi di attivazione" a cui vanno incontro i linfociti quando stimolati dai mitogeni. Il fatto è che l'apoptosi, insieme alla proliferazione, è una forma di risposta dei linfociti agli stimoli di attivazione. Nelle prime fasi della differenziazione predomina la risposta apoptotica e il suo risultato è la formazione di tolleranza all'antigene induttore. I linfociti maturi rispondono alla stimolazione prevalentemente mediante proliferazione (che serve stato iniziale e un prerequisito per lo sviluppo di una risposta immunitaria), ma rimane una certa probabilità del loro ingresso nell'apoptosi di attivazione. Poiché l'apoptosi in questo caso agisce come un processo alternativo alla proliferazione, il loro rapporto può servire come misura dell'efficacia della risposta cellulare ai segnali di attivazione. Maggiore è il contributo dell'apoptosi alla risposta dei linfociti a un mitogeno, minore è l'efficacia antigene-specifica difesa immunitaria. Pertanto, la determinazione dell'apoptosi all'attivazione dei linfociti da parte dei mitogeni è la più informativa a condizione di una valutazione parallela della risposta proliferativa delle cellule allo stesso stimolo.

Nel processo di apoptosi nella cellula, si verifica una complessa catena di reazioni a livello molecolare, che porta a un cambiamento nei processi metabolici e nelle caratteristiche fenotipiche delle cellule. Questi cambiamenti possono essere determinati con metodi biochimici, microscopici o citometrici e sono usati come marcatori di apoptosi.

Uno dei primi marcatori dell'apoptosi è l'aspetto sulla membrana citoplasmatica della cellula recettori per annessina. Nelle cellule apoptotiche, il fosfolipide fosfatildiserina (PS) viene riorientato e localizzato sulla superficie della membrana cellulare. La localizzazione di PS sulla superficie della membrana è osservata a partire da
fase iniziale apoptosi fino alla completa degradazione della cellula. Ricombinante
ny annessina V-proteina (35-36 kDa), che ha un'elevata affinità
a PS in presenza di ioni Ca+2. Contattare le FS in superficie
L'annessina V coniugata con fluorocromo funge da
marcatore di apoptosi. Di solito l'annessina V è usata in combinazione con
ioduro di propidio (PI), che consente il riconoscimento simultaneo di
cellule intatte (negative sia per annessina V che PI), cellule
sono in apoptosi "precoce" (positivo per annessina V,
negativo per PI) e cellule in apoptosi tardiva o
in necrosi (positivo sia per annessina V che per PI).

CD95 Fas, o APO-1, è una glicoproteina transmembrana da 45 kDa che fa parte della famiglia dei recettori del fattore di necrosi tumorale (TNF-α). L'antigene CD95 è espresso in quantità significative su timociti, linfociti CD4+, CD8+ del sangue periferico, in misura minore su linfociti B e cellule NK. Questo antigene è espresso anche su granulociti e monociti, ma la sua espressione non si trova su piastrine ed eritrociti. Il recettore CD95 si osserva anche su cellule di tessuti normali e tumori. Il legame di CD95 a un ligando Fas (Fas-L, CD95L) induce l'apoptosi nelle cellule che lo esprimono. Gli anticorpi monoclonali contro CD95 consentono di utilizzare il metodo della citometria a flusso o della microscopia a fluorescenza per identificare una popolazione di cellule pronte per l'apoptosi.

CD95L (Fas-L)– chiamato Fas-ligand, è una proteina di membrana (40kD). Esiste anche una forma solubile di CD95L (sFas-L), che è una proteina (26 kD) della famiglia dei recettori (TNF-α). Questo antigene è espresso dai linfociti E citotossici e dalle cellule NK e si trova anche su molte cellule tumorali. Il legame di Fas-L al recettore CD95 induce il processo di apoptosi nelle cellule bersaglio. Gli anticorpi monoclonali contro CD95L consentono di utilizzare il metodo della citometria a flusso o della microscopia a fluorescenza per identificare una popolazione di cellule pronte per l'apoptosi.

Bcl-2– proteina (26 kDa), la cui sovraespressione blocca l'apoptosi. Bcl-2 è una proteina intracellulare localizzata sui mitocondri, pertanto per determinarla mediante anticorpi monoclonali è necessario permeabilizzare preliminarmente la membrana cellulare.

Fine del lavoro -

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Metodi per la valutazione dello stato immunitario di un libro di testo per studenti delle facoltà di medicina, pediatria e medico-profilattica

Kursk State Medical University dell'Agenzia Federale per la Salute e lo Sviluppo Sociale Dipartimento di Immunologia Clinica e Allergologia..

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Stato immunitario e metodi per la sua valutazione
Lo stato immunitario (IS) è un insieme di parametri di laboratorio che caratterizzano l'attività quantitativa e funzionale delle cellule del sistema immunitario. Gli indicatori IP differiscono in grande

Oggetti e metodi della ricerca immunologica
Oggetti di studio Metodi di studio Caratteristica fenotipica cellule immunocompetenti Citometria a flusso Imm

Linfociti
Come parte delle cellule del sistema immunitario, i veri immunociti sono tutte varianti dei linfociti. Altri tipi di globuli bianchi (neutrofili, eosinofili, basofili, monociti), macrofagi, piastrine, mastociti

cellule MFS
I monociti del sangue periferico e i macrofagi tissutali derivano da cellule staminali pluripotenti. Una volta nel flusso sanguigno, i monociti si depositano nei tessuti entro 2-3 giorni, dove si trasformano in tessuto.

Sistema antimicrobico dipendente dall'ossigeno
meccanismi di azione battericida dipendenti dall'ossigeno glucosio + NADP+ → pentoso fosfato + NADPH citocromo b245 NADP + O2 ͛

cellule mediatrici
I granulociti sono leucociti polimorfonucleati circolanti nel sangue e originati, come i monociti-macrofagi, da una cellula staminale mieloide del midollo osseo. Ci sono tre tipi di grano

Metodi di immunofenotipizzazione dei linfociti
Quando si studiano i linfociti, vengono valutati il ​​​​loro numero nel sangue periferico e l'attività funzionale. La determinazione del numero di cellule viene effettuata tenendo conto degli antigeni di differenziazione su e

Isolamento della frazione mononucleare
Il metodo di isolamento delle cellule mononucleate si basa sulla diversa galleggiabilità di varie cellule del sangue. L'uso di un certo gradiente di densità consente di separare le cellule mononucleate (linfociti, monociti,

Citometria a flusso
La citometria a flusso si basa sulla misurazione delle proprietà ottiche delle cellule. Le celle vengono introdotte singolarmente in un flusso laminare in una cella a flusso di quarzo dove attraversano una luce focalizzata

Metodo di immunofluorescenza indiretta
L'immunofluorescenza indiretta è un metodo basato sull'utilizzo di anticorpi monoclonali marcati con fluorocromo, con la valutazione dei risultati tenendo conto della luminescenza specifica delle cellule durante la microscopia a fluorescenza.

Metodo immunocitochimico
I metodi immunocitochimici si basano sull'uso di enzimi come la perossidasi e la fosfatasi alcalina. Attualmente, il metodo più comunemente usato è PA (perossidasi-antiperossidasi), st

Metodi per lo studio dell'attività funzionale dei linfociti
L'attività funzionale dei linfociti è valutata dai seguenti effetti: la capacità di riconoscere gli antigeni, l'attivazione, la proliferazione e la differenziazione delle cellule. La capacità dei linfociti di

Reazione di trasformazione blastica dei linfociti
Il contatto di un linfocita con un antigene estraneo o un mitogeno non specifico è accompagnato da reazione di attivazione e trasformazione blastica (RBTL), cioè proliferazione cellulare con la transizione di piccoli linfociti in un'esplosione

Coltura mista di linfociti
La co-coltivazione di linfociti con molecole MHC-II di diverso aplotipo provoca la loro trasformazione e proliferazione blastica. Le cellule che rispondono sono linfociti T e sono stimolate da corpi estranei

Proteine ​​plasmatiche
Nel plasma umano sono presenti più di duecento proteine, la maggior parte delle quali sono state isolate e descritte strutturalmente e funzionalmente. Le proteine ​​plasmatiche sono prevalentemente glicoproteine. Con elettrofo

Globuline
L'α1-antitripsina è l'α1-globulina, che rappresenta oltre l'80% dell'attività antiproteasica sierica, è il componente principale della banda α. Nella soda di siero di latte

Globuline
Aptoglobina - emivita 2-4 giorni. Il contenuto di aptoglobina nel siero è normale 0,3 - 2,0 g/l. Il suo principale valore funzionale- legare l'emoglobina libera nel siero

Metodi di elettroforesi delle proteine
L'elettroforesi è ampiamente utilizzata per la determinazione semiquantitativa delle proteine ​​sieriche e per la rilevazione delle paraproteine. L'elettroforesi viene eseguita con siero, non plasma, quindi

Immunoglobuline
Le immunoglobuline (Ig) sono proteine ​​specifiche prodotte dal sistema immunitario come risultato di una reazione ad antigeni estranei e si accumulano nel siero del sangue e in altri fluidi biologici.

Immunoglobuline umane
Proprietà IgM IgG IgA IgD IgE Forma molecolare Pentamero

Metodi per la determinazione delle immunoglobuline
Per la determinazione quantitativa del contenuto di Ig di varie classi nel siero del sangue e altri fluidi biologici ampia applicazione trovato varie opzioni per mettere in scena la reazione di precipitazione nel gel

Paraproteine
Le paraproteine ​​sono immunoglobuline o loro frammenti prodotti da plasmacellule, formato da una specifica linea cellulare di linfociti B (monocloni). Le paraproteine ​​spesso no

Crioglobuline
Le crioglobuline sono proteine ​​plasmatiche patologiche (10-80 mg/ml) che hanno la proprietà di trasformarsi in uno stato gelatinoso a temperature inferiori a 37°C. La maggior parte delle crioglobuline sono complessi policlonali

Metodi per la determinazione degli immunocomplessi
Il legame delle Ig ad un antigene è un processo fisiologico che porta alla formazione di immunocomplessi (IC) finalizzati all'eliminazione dell'antigene dall'organismo. Tuttavia, a determinate condizioni

Determinazione degli autoanticorpi nella diagnosi delle malattie sistemiche del tessuto connettivo
Secondo i concetti moderni, l'autoimmunità si riferisce a tali condizioni in cui anticorpi o linfociti sensibilizzati compaiono nel corpo contro i normali antigeni dei propri tessuti.

Principali marcatori sierologici di malattie autoimmuni
Antigene Nome originale Struttura molecolare Funzione Valore diagnostico

Determinazione degli ANA nella reazione di immunofluorescenza indiretta
In un test tipico, il siero del paziente viene incubato con substrati antigenici (fegato animale o tessuto renale, coltura cellulare Hep-2) per effettuare il legame specifico di

Immunofluorescenza indiretta
Schema di illuminazione Specificità antigenica Significato clinico DsDNA periferico o marginale, l

Determinazione di ANA ed ENA mediante ELISA in fase solida
Sistema di test ANA ELISA (UBI MAGIWELL) - per analisi di screening per anticorpi antinucleari fornisce determinazione semi-quantitativa un'ampia gamma anticorpi contro il complesso adsorbiti nei pozzetti

Malattie autoimmuni
Tipo di patologia Risultati della ricerca immunologica. Tipo di anticorpi e frequenza della loro comparsa (%)

Sistema di citochine
Le citochine sono una classe di mediatori peptidici solubili del sistema immunitario necessari per il suo sviluppo, funzionamento e interazione con altri sistemi del corpo. Definiscono

Interleuchine
IL-1 è un mediatore immunoregolatore rilasciato durante reazioni infiammatorie, lesioni tissutali e infezioni (citochina pro-infiammatoria). IL-1 stimola la proliferazione e la differenziazione

Interferoni
L'interferone (IFN) è stato scoperto come una proteina con attività antivirale. Azione antivirale IFN è dovuto alla sua capacità di prevenire la replicazione intracellulare del virus allo stadio

Fattori di necrosi tumorale
Il fattore di necrosi tumorale (TNF) è il principale mediatore prodotto dall'organismo in risposta ai batteri Gram-negativi. Il principio attivo dei batteri Gram-negativi è il componente LPS della parete cellulare.

fattori stimolanti le colonie
Un certo numero di citochine formate durante lo sviluppo della risposta immunitaria hanno un effetto stimolante sulla differenziazione dei precursori del midollo osseo. Queste citochine sono chiamate stimolanti le colonie

Fattori di crescita
Il fattore di crescita trasformante (TGFβ) è una famiglia di peptidi correlati con molteplici effetti sui processi generali di regolazione della crescita e morfogenesi. TGFβ - citok principale

Metodi per la determinazione delle citochine
Ha la determinazione del contenuto di citochine in vari fluidi biologici Grande importanza nella valutazione dell'attività funzionale delle cellule immunocompetenti e nella regolazione della risposta immunitaria. In righe separate

Sistema del complemento
Il sistema del complemento è un complesso di proteine ​​del siero del sangue in grado di auto-organizzarsi e mediare l'immunità umorale e le reazioni di fagocitosi. Attualmente è noto che il

Metodi per la determinazione dell'attività del complemento
L'attività totale (titolo) del complemento viene determinata nella reazione di emolisi utilizzando eritrociti di ariete. Il complemento contenuto nel siero in esame provoca emolisi nei montoni sensibilizzati.

Titolo del complemento in 50% HE
Emolisi,% K Emolisi,% K Emolisi,% K Emolisi,% K

Determinazione dei componenti del complemento
Per determinare i componenti del complemento vengono utilizzati l'ELISA e il metodo turbidimetrico, la cui implementazione è descritta nelle istruzioni allegate ai sistemi di test diagnostici. IN pratica clinica SU

Componenti complementari
Componente del complemento Manifestazioni cliniche Carenza di C1 Di solito non causa disturbi clinicamente significativi, poiché mangia

Metodi per lo studio dell'attività fagocitica dei granulociti
La caratteristica più importante funzione dei granulociti è la valutazione della loro attività fagocitica. La sua diminuzione può essere il risultato sia di una deficienza di fattori opsonanti sierici (anticorpi, complemento

Test NST
Il test nitrosine tetrazolio (test NCT) viene utilizzato per rilevare i cosiddetti granulociti e monociti attivati. L'attivazione dei fagociti si basa su un forte aumento delle reazioni ossidative

Metodologia di ricerca
Reagenti e materiali necessari: KN 42 ORO 44 0, Na 42 ORO 44 0, NaCI, glucosio, nitrosina tetrazolio, eparina, alcool metilico, soluzione acquosa all'1% di verde di metilene (nel caso di

Determinazione della mieloperossidasi
La mieloperossidasi ossida un certo numero di substrati (benzidina, ortofenilepiamina) in presenza di perossido di idrogeno, che è accompagnato da una reazione cromatica. Mieloperossidasi - un enzima presente nei granuli fagici

Chemiluminescenza
La luminescenza spontanea, che si verifica durante le reazioni chimiche a causa dell'energia delle sostanze reagenti, è chiamata chemiluminescenza (CL). È inerente a tutti i tessuti e le cellule di un organismo vivente, purché lo siano

Determinazione del contenuto di IgE
Tra i metodi immunologici per la valutazione dei parametri aspecifici dello stato immunitario nella maggior parte delle malattie atopiche, la determinazione della quantità di IgE totali è della massima importanza. Tuttavia

Test di degranulazione dei basofili
Nei pazienti allergici, una porzione significativa di IgE si lega a vari leucociti attraverso i loro recettori Fc. La presenza di cellule che trasportano anticorpi indica la loro sensibilizzazione all'allergene corrispondente. B

Test di stimolazione dell'antigene delle cellule basofile - CAST
Nel caso di reazioni allergiche IgE-mediate, il meccanismo di innesco inizia con il legame dell'allergene a specifiche molecole di IgE sulla superficie dei basofili o mastociti. E

Reazione di inibizione della migrazione dei leucociti
La reazione è impostata per identificare i linfociti sensibilizzati al presunto allergene. I linfociti sensibilizzati, quando interagiscono con uno specifico allergene, rilasciano mediatori (FPML

Compito n. 1
Un paziente di 23 anni lamenta foruncoli ricorrenti localizzati su viso e gambe. Rileva frequenti raffreddori (fino a 7-8 volte l'anno), eruzioni erpetiche sulle labbra.

Compito n. 2
Il paziente N., 22 anni, si è rivolto a un immunologo con lamentele di infezioni virali respiratorie acute ricorrenti (fino a 7 volte l'anno), spesso accompagnate da una esacerbazione di bronchite cronica ostruttiva. Antibatterico condotto

Compito n. 3
Il paziente T., 27 anni, ha ripetutamente consultato un medico per infezioni virali respiratorie acute ricorrenti, tracheobronchite, debolezza e malessere. Dall'anamnesi è stato stabilito che durante l'anno ha avuto ARVI sei volte, due volte

Compito n. 4
Paziente K, 45 anni. Diagnosi: lupus eritematoso sistemico. Uno studio immunologico ha rivelato: Leucociti - 5,5 x 109/l Linfociti -37%, ass. 2,03 x 109

Compito numero 5
Un bambino di 5 anni appartiene al gruppo di bambini malati frequentemente ea lungo termine, recidive di ARVI una volta al mese, focolai di infezione cronica ( sinusite cronica, adenoidite), ingrossamento dei linfonodi cervicali

All'esame immunologico
Test di livello 1 Conta totale dei globuli bianchi. Leukoformula T-linfociti B-linfociti

Analisi del sangue generale
Norma Unità SI Emoglobina M F 130,0-160,0 120,0-140,0 g/l

Principali marcatori CD delle cellule del sistema immunitario
Marcatore CD Popolazione cellulare % cellule CD2 Cellule T e NK

Sottopopolazione di linfociti nei bambini
linfociti 4-5 giorni - 3 mesi 4-8 mesi 1-2 anni 2-5 anni oltre 5 anni Sole

Il livello di immunoglobuline nel siero del sangue degli adulti
IgM IgG IgA IgE 1,3-1,7 g/l 12-14 g/l 2,1-2,9 g/l

Pannello allergologico MAST (multiple allergosorbent test) per la rilevazione di immunoglobuline specifiche per allergeni di vari gruppi
Pannello alimentare Ig E Pannello esteso russo Ig E Pannello alimentare Ig G Pannello universale russo Ig E

Glossario di termini
L'avidità è la forza di legame di un antigene a un anticorpo, che è determinata dall'affinità e dalla valenza degli anticorpi. Agglutinazione - aggregazione a

Elenco delle abbreviazioni e delle convenzioni
AG - antigene AFC - cellula produttrice di anticorpi APC - cellula presentante l'antigene AT - anticorpo VLS - efferente vaso linfatico SVK è un virus infetto

1

Sono stati esaminati 45 bambini di età compresa tra 3 e 15 anni. Lo scopo dello studio era determinare la prontezza all'apoptosi dei linfociti e dei neutrofili del sangue periferico determinando i marcatori di apoptosi - CD95, CD95L, BSL2. Durante la valutazione dell'apoptosi delle cellule immunocompetenti, è stata riscontrata una diminuzione della prontezza alla morte cellulare programmata dei linfociti e un aumento dei granulociti neutrofili. I cambiamenti più pronunciati si registrano nella fascia di età di 7-15 anni con un'esperienza di malattia superiore a 3 anni. I dati ottenuti possono essere un segno di soppressione della morte programmata dei linfociti autoreattivi nel tessuto pancreatico, che contribuisce al prolungamento della risposta immunitaria. Un aumento della percentuale di cellule leucocitarie che esprimono CD95L può migliorare i processi di morte cellulare programmata nelle cellule β delle isole pancreatiche infiltrate con cellule immunocompetenti.

apoptosi dei neutrofili

apoptosi dei linfociti

diabete di tipo 1

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introduzione

Il diabete mellito di tipo 1 (DM1) è una malattia poligenica e multifattoriale associata alla formazione di autoanticorpi e linfociti T autoreattivi contro le cellule beta pancreatiche.

Collegamenti principali nella patogenesi lesioni autoimmuni sono la disregolazione immunitaria e la morte cellulare programmata.

L'apoptosi controllata è oggi considerata il meccanismo principale per mantenere l'equilibrio ottimale delle cellule al centro dell'infiammazione, limitando l'espansione dei cloni attivati ​​e prevenendo lo sviluppo di reazioni autoimmuni. Se si verifica un difetto nella sua implementazione, le cellule immunitarie attivate possono accumularsi, il che porta al verificarsi di malattie autoimmuni.

Scopo dello studio: studio dei marcatori di attivazione dell'apoptosi CD95, CD95L, Bsl2 sui linfociti del sangue periferico e sui neutrofili nel diabete mellito di tipo 1 nei bambini.

Materiali e metodi di ricerca

Sono stati esaminati 45 bambini con diabete mellito di tipo 1 di età compresa tra 3 e 15 anni. Gruppo I comprendeva 20 bambini di età compresa tra 3 e 6 anni (bambini in età prescolare), gruppo II - 12 bambini di età compresa tra 7 e 15 anni (scolari) con una durata della malattia inferiore a 3 anni, gruppo III - 13 bambini di età compresa tra 7 e 15 anni (scolari) con esperienza della malattia da più di 3 anni. Il gruppo di controllo era composto da 30 bambini sani di età compresa tra 3-6 (15) e 7-15 (15) anni. Lo studio è stato condotto sulla base del dipartimento endocrinologico del Children's City Clinical Hospital che prende il nome. G. K. Filippsky, Stavropol.

Per valutare la morte cellulare programmata, è stato determinato il numero di linfociti e granulociti neutrofili che esprimono marcatori di apoptosi. I linfociti sono stati isolati su un gradiente di densità Ficoll-Paque, i neutrofili sono stati isolati su un gradiente a doppia densità Ficoll-Paque e ficoll-urografin (GE Healthcare, Svezia). La sospensione cellulare è stata lavata tre volte nel mezzo RPMI-1640 (Vector-Best, Russia). In colture di linfociti e neutrofili, il numero di cellule che esprimono CD95, CD95L, Bsl2 è stato stimato mediante citometria a flusso utilizzando anticorpi monoclonali (Invitrogen, USA).

Per l'analisi statistica dei dati è stato utilizzato il pacchetto software "Primer of Biostat 4.0", Attestat 10.5.1. Per valutare le differenze tra i gruppi, è stata utilizzata l'analisi della varianza per misure ripetute con il calcolo dei criteri di Newman-Keuls, Dunn.

I valori quantitativi sono stati caratterizzati da una distribuzione anormale e sono stati presentati come intervallo mediano e interquantile (25° e 75° percentile) (Me (Q1-Q)). Differenze a pag<0,05.

Risultati e sua discussione

Lo studio ha riscontrato una diminuzione del numero di linfociti che esprimono i recettori Fas (CD95) nei pazienti di tutti i gruppi rispetto ai bambini sani (Tabella 1). Gli indicatori minimi sono stati osservati nei bambini di età compresa tra 7 e 15 anni con un'esperienza di malattia superiore a 3 anni (Tabella 1).

Tabella 1

Indicatori di apoptosi dei linfociti nei bambini con diabete mellito di tipo 1

	Gruppi clinici
3-6 anni	DM1 (I) (n=20)	17,7(15,9-19,43) * **	7,4(5,81- 8,94) * **	70,2(68,56-71,76) * **
	Gruppo di controllo	28,0(26,08-30,0)	9,2(8,04- 10,25)	65,9(62,82-69,05)
7-15 anni		20,5(17,94-23,02) * **	11,6(10,12-13,14) * **	70,3(65,72-74,9) * **
		13,9(10,04-17,73) * **	15,6(14,26-16,87) * **	79,5(75,47-83,59) * **
	Gruppo di controllo	26,5 (24,20-28,84)	8,14 (6,49-9,78)	60,3(56,97-63,66)

*- P<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- P<0,05 - по сравнению с группой

Nel valutare il livello di espressione dei marcatori anti-apoptotici (Bsl2), il suo aumento è stato rivelato sui linfociti di bambini di tutti i gruppi, più pronunciato negli scolari con una durata della malattia superiore a 3 anni, che indica anche una violazione di Fas-dipendente apoptosi nei bambini con diabete mellito di tipo 1, che porta al rallentamento dei processi di morte cellulare delle forme autoreattive dei linfociti.

I nostri risultati possono essere un segno indiretto della soppressione della morte programmata dei linfociti attivati ​​nel tessuto pancreatico, che contribuisce al prolungamento della risposta immunitaria.

Il livello di prontezza apoptotica delle cellule linfoidi dipende dalla durata della malattia e diminuisce nei bambini con esperienza DM1 superiore a 3 anni.

In precedenza, è stato dimostrato che la resistenza dei linfociti all'apoptosi viene rilevata nel diabete mellito, il che potrebbe spiegare la natura e la durata della risposta autoimmune.

Nella coltura di linfociti di bambini con diabete mellito è stato riscontrato un aumento della percentuale di linfociti che esprimono CD95L (Tabella 1) rispetto al gruppo di bambini sani. I tassi più alti sono stati determinati nei bambini di età compresa tra 7 e 15 anni con un'esperienza di malattia superiore a 3 anni (Tabella 1).

È noto che nelle isole pancreatiche DM1 sono infiltrate cellule immunitarie che producono un'ampia gamma di citochine, che è accompagnata da un'espressione aberrante dei recettori di membrana. Sotto l'influenza di una maggiore concentrazione di glucosio e citochine, le cellule beta iniziano a esprimere CD95 sulla loro superficie, che è praticamente assente nella norma.

Un aumento dell'espressione di CD95L sulle cellule linfoidi probabilmente causa un processo apoptotico più pronunciato nelle cellule beta pancreatiche e la loro successiva rimozione.

Negli ultimi anni è stato dimostrato che i granulociti neutrofili sono attivamente coinvolti nella formazione dell'infiammazione autoimmune. La reazione dei neutrofili finalizzata alla localizzazione e all'eliminazione degli autoantigeni dipende in gran parte dalla forza e dalla durata dell'effetto antigenico sul sistema immunitario, nonché dal livello iniziale di attività funzionale delle cellule.

Abbiamo scoperto che il decorso del diabete mellito nei bambini è accompagnato da un aumento della percentuale di neutrofili che esprimono marcatori di apoptosi (CD95) e da una diminuzione della percentuale di cellule che hanno proteine ​​​​antiapoptotiche Bsl2 sulla loro superficie (Tabella 2).

Tavolo 2

Indicatori di apoptosi dei neutrofili nei bambini con diabete mellito di tipo 1

	gruppi clinici
3-6 anni	DM1 (I) (n=20)	75,1(71,49-78,72) * **	9,5 (8,63- 10,32) * **	3,68 (3,46-3,90 * **
	gruppo di controllo	59,2 (56,31- 62,01)	7,35 (6,58- 8,12)
7-15 anni	DM1, esperienza di malattia inferiore a 3 anni (II) (n=12)	77,6(71,15-83,99) * **	9,5(8,14-10,92) * **	3,99(2,9- 5,08) * **
	DM1, esperienza di malattia superiore a 3 anni (III) (n=13)	87,9(84,24-91,63) * **	12,1(10,22-13,96) * **	2,78(2,36-3,19) * **
	gruppo di controllo	58,43(54,95- 1,90)

*- P<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- P<0,05 - по сравнению с группой III (criterio di Newman-Keuls, criterio di Dunn).

Con una caratteristica intergruppo comparativa, gli indicatori massimi di CD95 (p<0,05) и минимальные Bsl2 (p<0,05) отмечены у детей 7-15 лет с длительностью заболевания более 3-х лет.

È stato rivelato un aumento della percentuale di leucociti polimorfonucleati con CD95L sulla loro superficie. I tassi più alti sono stati osservati nei figli di scolari con esperienza della malattia da più di 3 anni.

I risultati dello studio dell'apoptosi PMNL nel diabete mellito presentati in letteratura sono controversi. Esistono prove di un aumento del tasso di apoptosi dei neutrofili del sangue periferico in DM1 e DM2.

Tuttavia, numerosi studi hanno riscontrato una diminuzione dell'apoptosi dei granulociti neutrofili in pazienti con diabete di tipo 1, specialmente in condizioni di iperglicemia, che probabilmente avvia processi infiammatori cronici con danno tissutale e predispone anche a infezioni batteriche protratte in pazienti con diabete di tipo 1 diabete mellito.

I nostri risultati suggeriscono che i pazienti con DM1 hanno una maggiore predisposizione del PMNL all'apoptosi, che può essere una manifestazione di una reazione protettiva volta ad eliminare il "surplus" di neutrofili attivi, la cui formazione aumenta il danno tissutale.

Un aumento del potenziale apoptotico dei granulociti neutrofili è un riflesso del coinvolgimento attivo del PMNL nell'immunopatogenesi della malattia.

Un aumento dell'espressione di CD95L sui granulociti neutrofili nei pazienti con diabete mellito può probabilmente contribuire all'eliminazione non solo delle cellule pancreatiche, ma anche delle proprie cellule leucocitarie.

Pertanto, durante la valutazione dell'apoptosi delle cellule immunocompetenti nei bambini con diabete di tipo 1, è stata riscontrata una diminuzione della prontezza alla morte cellulare programmata dei linfociti e un aumento dei leucociti polimorfonucleati.

I cambiamenti più pronunciati si registrano nella fascia di età 7-15 anni con un'esperienza di malattia superiore a 3 anni. Nei bambini di tutti i gruppi è stato rivelato un aumento della percentuale di cellule leucocitarie che esprimono CD95L sulla loro superficie.

È noto che i PMNL sono un collegamento tra immunità innata e adattativa e svolgono un ruolo di primo piano nella protezione antibatterica.

Un aumento della loro attività apoptotica può causare una bassa resistenza all'età del bambino e suscettibilità alle malattie infettive.

Una diminuzione del numero di cellule linfoidi sensibili all'induzione dell'apoptosi è un segno indiretto della soppressione della morte cellulare programmata e dell'alterata eliminazione delle forme attivate di linfociti.

conclusioni

1. Nei bambini con diabete di tipo 1, vi è una diminuzione della disponibilità all'apoptosi dei linfociti del sangue periferico, un aumento dei granulociti neutrofili, che è accompagnato da un cambiamento nell'espressione di CD95 e Bsl2 e dipende dalla durata della malattia .

2. Un aumento dell'espressione di CD95L sui linfociti e granulociti neutrofili in DM1 può migliorare i processi di morte cellulare programmata nelle cellule β delle isole pancreatiche infiltrate con cellule immunocompetenti.

Revisori:

Shchetinin E.V., dottore in scienze mediche, professore, vicerettore per la ricerca e l'innovazione, SSMU, capo del dipartimento di HBO HPE "Stavropol State Medical University" del Ministero della salute della Federazione Russa, Stavropol.

Golubeva M.V., dottore in scienze mediche, professore, capo del dipartimento di malattie infettive pediatriche, Stavropol State Medical University, Stavropol State Medical University, Stavropol.

Link bibliografico

Barycheva L.Yu., Erdni-Goryaeva N.E. MARCATORI DI APOPTOSI DI CELLULE IMMUNOCOMPETENTI NEL DIABETE MELLITO DI TIPO 1 NEI BAMBINI // Problemi moderni della scienza e dell'educazione. - 2013. - N. 4.;
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=9953 (data di accesso: 18/07/2019). Portiamo alla vostra attenzione le riviste pubblicate dalla casa editrice "Academy of Natural History"