Zrýchlenie aj spomalenie apoptózy môže mať zásadný vplyv na priebeh množstva patologických procesov v organizme. Látky, ktoré sa podieľajú na regulácii apoptózy, sú zvyčajne proteíny a ich syntéza je riadená zodpovedajúcimi génmi. Rovnaké gény, ktoré regulujú úroveň apoptózy, možno nájsť u živých bytostí na rôznych stupňoch evolučného rebríčka. Gény, ktoré stimulujú apoptózu, zahŕňajú gény p53, Bax a bcl-xS. Na druhej strane boli opísané gény syntetizujúce proteíny, ktoré inhibujú apoptózu (Bcl-2, Ced-9, BHRF1, MCL-1). Pro- a antiapoptotické proteíny sú schopné sa navzájom kombinovať a vytvárať homo- a heterodiméry. Napríklad, keď sa inhibítor apoptózy proteínu Bcl-2 kombinuje s proteínom aktivátora apoptózy Bax, výsledok (inhibícia alebo aktivácia apoptózy) bude určený podľa toho, ktorý proteín bude v tejto kombinácii prevládať.
Najvýraznejšie a najinformatívnejšie proteíny odrážajúce prebiehajúce syntetické procesy v bunkách a tkanivách sú proteíny rodiny Bcl-2, ktoré zaujímajú ústredné miesto v štúdiu regulácie procesu apoptózy. Mechanizmus regulácie tohto procesu je vhodné zvážiť z hľadiska štruktúrnych a funkčných vzťahov medzi proteínmi tejto rodiny, ktoré umožňujú ich spojenie do jednej rodiny – proteínov Bcl-2. Proteíny tejto rodiny Bcl-2 sú v konštantnej dynamickej rovnováhe a tvoria homo- a heterodiméry, čo v konečnom dôsledku ovplyvňuje vývoj bunkovej apoptózy. Preto sa predpokladá, že pomer aktívnych foriem týchto proteínov určuje rovnováhu medzi životom a smrťou bunky.
V súčasnosti je známe, že proteíny rodiny Bcl-2 sú buď induktory apoptózy (Bad, Bax, J3ik, Bid, Bak) alebo inhibítory (Bcl-2, Bcl-X). Proteín rodiny Bcl-2 patrí do triedy G - proteínov. Proteín 26 kJ kódovaný génom Bcl-2 obsahuje transmembránovú doménu a je lokalizovaný v mitochondriálnej membráne, perinukleárnom endoplazmatickom retikule, jadrovej membráne a mitotických chromozómoch.
Bcl-2 je faktor prežitia buniek, ktorý ich chráni pred programovanou smrťou a vykazuje onkogénne vlastnosti, pretože zabraňuje apoptóze. Gén Bcl-2 funguje ako negatívny regulátor apoptózy. Zistilo sa, že zníženie koncentrácie Bcl-2 vedie k apoptotickej bunkovej smrti, zatiaľ čo jeho nadmerná expresia chráni bunky pred smrťou.
Sekvencia udalostí, ktoré vedú bunku k apoptóze v dôsledku interakcie proteínov z rodiny TNF so špecifickými receptormi, je najlepšie preštudovaná. svetlý predstaviteľ touto skupinou proteínov je systém Apo-1/Fas/FasL. Je potrebné poznamenať, že pre tento systém nie je známa žiadna iná funkcia ako indukcia bunkovej apoptózy.
Apo-1/Fas/CD-95 je receptor štruktúrne príbuzný rodine receptorov TNF. Interakcia Apo-1/Fas (receptor) s FasL (ligand) alebo s monoklonálnymi protilátkami vedie k apoptóze buniek. Apo-1/Fas je konštitutívne exprimovaný na povrchu mnohých typov buniek: na tymocytoch, lymfoblastoidných bunkových líniách, aktivovaných T- a B-lymfocytoch, ako aj na fibroblastoch, hepatocytoch, keratinocytoch a myeloidných bunkách. Ľudský Apo-1/Fas pozostáva z 325 aminokyselinových zvyškov a je to membránový proteín typu I. Tie. jeho štruktúru možno rozdeliť na extracelulárne, transmembránové a cytoplazmatické domény. Homológia aminokyselinovej sekvencie medzi receptormi rodiny TNF je vysoká. Približne 80 aminokyselinových zvyškov tvorí doménu smrti (DD), ktorá sa podieľa na interakcii proteín-proteín s cytoplazmatickými proteínmi, čím sa generuje signál smrti. Gén Apo-1/Fas u ľudí sa nachádza na dlhom ramene chromozómu 10 a pozostáva z 9 exónov.
FasL je cytokín a patrí do rodiny cytokínov TNF. FasL je exprimovaný na aktivovaných T-lymfocytoch a prirodzených zabíjačských bunkách, ako aj na Sertoliho bunkách a parenchymálnych bunkách prednej komory oka, čo umožňuje týmto bunkám zabiť akúkoľvek bunku exprimujúcu Fas, vrátane aktivovaného T-lymfocytu. Tento mechanizmus určuje vzhľad miest chránených pred imunitným systémom. FasL existuje v dvoch formách: nerozpustný alebo viazaný na membránu a rozpustný, ktorý je z bunky odštiepený metaloproteinázou. Rozpustná forma ľudského sFasL zostáva aktívna. Podobne ako iné ligandy receptorov rodiny TNF, sFasL je homotrimér, ktorý sa viaže na 3 molekuly Apo-1/Fas.
Keď sa ligand naviaže na receptor, dôjde k oligomerizácii cytoplazmatických proteínov, ako je DD (doména smrti), súvisiaca s receptorom, adaptorový proteín - FADD (Fas-associated death domain), obsahujúci DED - doménu efektora smrti a prokaspázu- 8. V dôsledku tohto procesu sa aktivuje proteáza špecifická pre apoptózu, kaspáza-8, a rozvinú sa procesy charakteristické pre apoptózu. K rozvoju vedú mutácie v géne fas alebo v géne FasL autoimunitné ochorenia.
Apo-1/Fas je proteín, ktorý obsahuje 1 transmembránovú oblasť, ktorá väzbou na FasL indukuje apoptózu v cieľových bunkách. Existuje aj beztransmembránová rozpustná forma Apo-1 (sApo-1/Fas), ktorá je prítomná v sére a iných telesných tekutinách. Podľa literatúry môže táto sekrečná forma (sApo-1/Fas) chrániť bunky pred apoptózou indukovanou Apo-1/ligandom a vzniká odštiepením aminokyselinového zvyšku z transmembránovej domény .
V posledných rokoch sa identifikácia apoptózy často uskutočňuje stanovením aktivity kaspáz, tak iniciátorov, ako aj efektorov. Vo väčšine prác uskutočňovaných so štúdiom aktivity kaspázy sa uvažuje o kaspáze-3, od r zbiehajú sa na ňom rôzne dráhy apoptotickej smrti a jeho aktivácia indikuje prítomnosť apoptózy. Ak sa však do štúdie zavedie stanovenie aktivity kaspázy-8, potom okrem identifikácie programovanej bunkovej smrti ako takej je možné určiť aj cestu jej spustenia, keďže aktivácia kaspázy-8 poukazuje na receptorový (vonkajší) mechanizmus iniciácie procesu. To je hlavná výhoda túto metódu.
K dnešnému dňu viac ako 60 rôzne metódy detekcia a štúdium apoptotických buniek in vitro. Literatúra opisuje niekoľko metodologických prístupov k in vivo detekcii apoptotických buniek in vivo. Tieto metódy sú založené na kvalitatívnych resp kvantifikácia dejov spôsobených zmenami vonkajšej membrány buniek, selektívnou fragmentáciou jadrovej DNA, zmenami v štruktúre intracelulárnych komponentov alebo ich redistribúciou, ako aj poklesom pH cytoplazmy. Okrem toho existujú atypické formy apoptózy, pri ktorých nie sú žiadne markerové apoptotické zmeny.
Zo zrejmých dôvodov nie je možné študovať mechanizmy apoptózy GCS v POAG u ľudí in vivo. Ako nepriamy indikátor v štúdii úlohy apoptózy v patogenéze POAG sa hodnotili apoptotické markery v lymfocytoch periférnej krvi, ktoré charakterizovali ich pripravenosť na apoptózu. Na stanovenie apoptotických buniek sa používajú: laserové skenovanie a prietoková cytometria, emisia jedného fotónu CT vyšetrenie, magnetická rezonancia (MRI), magnetická rezonančná spektroskopia, pozitrónová emisná tomografia. Taktiež na identifikáciu apoptotickej bunkovej smrti, svetelnej a fluorescenčnej mikroskopie s využitím konvenčných metód fixácie a farbenia, elektrónových mikroskopických metód, detekcie degradácie oligonukleozomálnej DNA in situ, imunohistochemickej detekcie proteínov - markerov podieľajúcich sa na programovanej bunkovej smrti, prípadne fragmentovanej DNA, stanovenie aktivita kaspáza.
Štúdium apoptózy na preparátoch farbených štandardnými metódami sa používa veľmi široko kvôli relatívnej jednoduchosti týchto metód. Výsledky získané počítaním apoptoticky zmenených buniek sú vyjadrené ako takzvaný apoptotický index. Kritériom programovanej bunkovej smrti môže byť marginácia chromatínu a pyknóza, zmeny v kontúrach jadra, zmeny v kontúrach a fragmentácia buniek a výskyt voľne ležiacich jadier.
Fluorescenčná mikroskopia sa často používa ako subjektívna metóda na detekciu programovanej bunkovej smrti. Skúmajú sa vitálne zafarbené bunky v suspenzii aj fixované prípravky. Pri práci so živými bunkami sa široko používa značenie anexínom V, ktoré umožňuje detekovať fosfatidylserín objavujúci sa počas apoptózy na vonkajšej strane plazmatickej membrány.
Pri analýze buniek pod fluorescenčnou mikroskopiou sa berú do úvahy tieto vlastnosti: veľkosť jadra (pokles), povaha distribúcie chromatínu (kondenzácia do zhlukov nepravidelný tvar, zhutnenie), chromatínové telieska (zachovanie membránovej izolácie), povaha luminiscencie DNA. Apoptotická DNA sa javí ako kondenzovaná jasne žltozelená. V životaschopných bunkách akridínová oranž spôsobuje difúznu zelenú fluorescenciu.
Pomocou imunohistochemických štúdií sa zisťuje prítomnosť proteínov, ktoré tvoria kaskádu biochemických procesov vedúcich k apoptóze. Často táto skupina metód zahŕňa TUNEL a ELISA.
Mnoho výskumníkov pripisuje vedúcu úlohu apoptóze pri štrukturálnych zmenách na disku. optický nerv(ONH), spôsobené stratou GCS. Úloha apoptózy pri rozvoji degeneratívnych ochorení je nepochybná. Existuje presvedčivý experimentálny materiál naznačujúci účasť apoptotického procesu na mechanizme GON v POAG. Vo všeobecnosti sú však klinické štúdie faktorov apoptózy u pacientov s rôznymi štádiami glaukómu veľmi obmedzené, čo sťažuje štúdium ich úlohy v patogenéze GON.
Zdrojová stránka: 265
CAD (kaspázou aktivovaná DNáza) na fragmenty v násobkoch 180-200 nukleotidov. Výsledkom apoptózy je vytvorenie apoptotických teliesok - membránových vezikúl obsahujúcich integrálne organely a fragmenty jadrového chromatínu. Tieto telá sú prijímané susednými bunkami alebo makrofágmi prostredníctvom fagocytózy. Pretože extracelulárna matrica nie je ovplyvnená bunkovými enzýmami, dokonca ani pri veľkom počte apoptotických buniek nie je pozorovaný zápal.
Proces apoptózy je nevyhnutný pre fyziologickú reguláciu počtu buniek v tele, pre deštrukciu starých buniek, pre tvorbu lymfocytov, ktoré nereagujú na svoje antigény (vlastné antigény), pre jesenný opad listov rastlín, na cytotoxické pôsobenie T-killer lymfocytov, na embryonálny vývoj organizmu (miznutie kožných membrán medzi prstami u vtáčích embryí) a iné.
Porušenie normálnej bunkovej apoptózy vedie k nekontrolovanej bunkovej proliferácii a objaveniu sa nádoru.
1. Význam apoptózy
Apoptóza je neoddeliteľnou súčasťou životne dôležitej činnosti väčšiny mnohobunkových organizmov. Predovšetkým dôležitá úloha hrá v procesoch vývoja. Napríklad končatiny tetrapodov sú položené tak, ako rastú v tvare rýľa a k tvorbe prstov dochádza v dôsledku odumierania buniek medzi nimi. Bunky, ktoré už nie sú potrebné, tiež podliehajú apoptóze, takže chvost u pulcov je zničený najmä počas metamorfózy. V nervovom tkanive stavovcov počas embryonálneho vývoja viac ako polovica neurónov odumiera apoptózou hneď po vytvorení.
Taktiež apoptóza je súčasťou kontrolného systému pre „kvalitu“ buniek, umožňuje ničiť tie, ktoré sú nesprávne umiestnené, poškodené, nefunkčné alebo pre telo potenciálne nebezpečné. Príkladom sú B-lymfocyty, ktoré odumierajú, ak nenesú užitočné receptory špecifické pre antigén alebo sú autoreaktívne. Apoptózou väčšina lymfocytov, ktoré sa aktivujú počas infekcie, po jej prekonaní aj odumiera.
V dospelých organizmoch súčasná regulácia bunkovej proliferácie a apoptózy umožňuje zachovať veľkosť celého jedinca a jeho jednotlivých orgánov. Napríklad po implantácii lieku fenobarbital, ktorý stimuluje proliferáciu hepatocytov, sa u potkanov zvýši pečeň. Okamžite po ukončení pôsobenia tejto látky však všetky nadbytočné bunky prechádzajú apoptózou, v dôsledku čoho sa veľkosť pečene vráti do normálu.
K apoptóze dochádza aj vtedy, keď bunka „cíti“ veľké množstvo vnútorného poškodenia, ktoré nedokáže opraviť. Napríklad v prípade poškodenia DNA sa bunka môže premeniť na rakovinovú bunku, takže sa tak nestane, za normálnych podmienok „spácha samovraždu“. Tiež veľké množstvo buniek infikovaných vírusmi odumiera apoptózou.
2. Markery apoptotických buniek
Markery apoptózy
Detekcia fragmentácie DNA v apoptotických bunkách metódou TUNEL Príprava tkaniva pečene myši, jadro apoptotických buniek má hnedú farbu, optická mikroskopia.
Detekcia fragmentácie DNA v apoptotických bunkách elektroforézou na agarózovom géli. Vľavo: DNA izolovaná z apoptotických buniek – je viditeľný „rebrík DNA“; stred: značky; prípad: kontrolná vzorka DNA z neošetrených buniek. Bunková línia H4IIE (potkaní hepatóm), induktor apoptózy - paraquat, vizualizácia etidium bromidom.
Hore: Detekcia kondenzácie a fragmentácie chromatínu farbením fluorescenčným farbivom (Hoechst 34580). Stred: Detekcia translokácie fosfadidylserínu do vonkajšieho cípu plazmalemy farbením anexínom V. Dole: Mikrosnímka apoptotických buniek v jasnom poli. Bunková línia - Jurkat, induktor apoptózy - TRAIL, konfokálny a svetelná píla optická mikroskopia.
Bunky, ktoré odumierajú apoptózou, možno rozpoznať podľa množstva morfologických znakov. Stávajú sa menšie a hustejšie (pyknóza), zaobľujú sa a strácajú pseudopódia, cytoskelet v nich kolabuje, jadrová membrána sa rozpadá, chromatín kondenzuje a fragmentuje sa. Na povrchu buniek sa objavuje veľké množstvo vezikúl, ak sú bunky dostatočne veľké, potom sa rozpadajú na fragmenty obklopené membránami – apoptotické telieska.
V apoptotických bunkách dochádza okrem morfologických zmien aj k veľkému množstvu biochemických zmien. Najmä DNA je štiepená špeciálnymi nukleázami v spojovacích oblastiach medzi nukleozómami na fragmenty rovnakú dĺžku. Preto pri separácii celej DNA apoptotickej bunky pomocou elektroforézy možno pozorovať charakteristický „rebrík“. Ďalšou metódou detekcie fragmentácie DNA je označenie jej voľných koncov pomocou metódy TUNEL ( T erminálna deoxynukleotidyltransferáza d U TP n ick e nd l abeling ) .
Plazmatická membrána apoptotických buniek tiež prechádza zmenami. Za normálnych podmienok je negatívne nabitý fosfolipid fosfatidylserín obsiahnutý len vo svojej vnútornej (vrátenej do cytosólovej) vrstvy, no pri apoptóze „preskočí“ do vonkajšieho cípu. Táto molekula slúži ako signál „zjedz ma“ blízkym fagocytom. Vychytávanie apoptotických buniek vyvolané fosfatidylserínom, na rozdiel od iných typov fagocytózy, nevedie k uvoľneniu zápalových mediátorov. Opísaná zmena plazmatickej membrány je základom ďalšej metódy detekcie buniek, ktoré odumierajú apoptózou – farbenie anexínom V, ktorý sa špecificky viaže na fosfatidylserín.
3. Kaspáza – mediátory apoptózy
Bunkové systémy, ktoré zabezpečujú prechod apoptózy, sú u všetkých živočíchov podobné, ústredné miesto v nich zaujíma rodina proteínov kaspáz. Kaspázy sú proteázy, ktoré majú vo svojom aktívnom mieste cysteínový zvyšok a štiepia svoje substráty na špecifický zvyšok kyseliny asparágovej (odtiaľ názov: c od cysteín A asp od kyselina asparágová). Kaspázy sa v bunke syntetizujú vo forme neaktívnych prokaspáz, ktoré sa môžu stať substrátmi pre iné už aktivované kaspázy, ktoré ich na jednom alebo dvoch miestach rozrežú na aspartátovom zvyšku. Dva vytvorené fragmenty - väčší a menší - sú vzájomne prepojené a vytvárajú dimér, ktorý sa spája s rovnakým stmievačom. Takto vytvorený tetramér je aktívna proteáza, ktorá môže štiepiť substrátové proteíny. Okrem oblastí zodpovedajúcich väčším a menším podjednotkám prokaspázy niekedy obsahujú aj inhibičné prodomény, ktoré sú po štiepení degradované.
V dôsledku štiepenia a aktivácie niektorých kaspáz inými sa vytvára protealytická kaskáda, ktorá výrazne zosilňuje signál a od určitého momentu robí z apoptózy nezvratný proces. Tie prokaspázy, ktoré spúšťajú túto kaskádu, sa nazývajú iniciačné a ich substráty sa nazývajú efektorové. Po aktivácii môžu efektorové kaspázy štiepiť iné efektorové prokaspázy alebo cieľové proteíny. Medzi ciele efektorových kaspáz, ktoré sú zničené pri apoptóze, patria najmä proteíny jadrovej laminy, ktorých štiepenie vedie k rozpadu tejto štruktúry. Tiež degraduje proteín, za normálnych podmienok inhibuje endonukleázy CAD, v dôsledku čoho začína fragmentácia DNA. Kaspáza a cytoskeletálne a intercelulárne adhézne proteíny sú štiepené, v dôsledku čoho sa apoptotické bunky zaobľujú a oddeľujú od susedných buniek, a tak sa stávajú ľahšími cieľmi pre fagocyty.
Súbor kaspáz potrebných na priebeh apoptózy závisí od typu tkaniva a dráhy, ktorou sa aktivuje bunková smrť. Napríklad u myší, keď je gén kódujúci efektorové kaspázy-3 "vypnutý", apoptóza nenastáva v mozgu, ale normálne prebieha v iných tkanivách.
Gény prokaspázy sú aktívne v zdravých bunkách, a preto sú proteíny nevyhnutné pre vznik apoptózy a sú neustále prítomné, na spustenie bunkovej samovraždy je potrebná len ich aktivácia. Iniciátorové prokaspázy zahŕňajú dlhú prodoménu obsahujúcu CARD ( doména náboru kaspázy doména príťažlivosti kaspázy). CARD umožňuje iniciátorom prokaspázy pripojiť sa k adaptorovým proteínom za vzniku aktivačných komplexov, keď bunka prijme signál, ktorý stimuluje apoptózu. V aktivačných komplexoch je niekoľko pro-kaspázových molekúl vo vzájomnej tesnej blízkosti, čo im stačí na to, aby vstúpili do aktívneho stavu, po ktorom sa navzájom rozrežú.
Dve najlepšie pochopené signálne dráhy na aktiváciu kaspázovej kaskády v cicavčích bunkách sa nazývajú vonkajšia a vnútorná (mitochondriálna), pričom každá používa svoj vlastný iniciátor prokaspázy.
4. Spôsoby aktivácie apoptózy
4.1. vonkajšia cesta
Bunka môže prijímať signál indukujúci apoptózu zvonku, napríklad z cytotoxických lymfocytov. V tomto prípade sa aktivuje tzv. externá cesta ( vonkajšia cesta) Počnúc receptormi smrti. Receptory smrti sú transmembránové proteíny patriace do rodiny receptorov faktora nekrózy nádorov (TNF), ako je samotný receptor TNF a receptor smrti Fas. Tvoria homotriméry, v ktorých má každý monomér extracelulárnu doménu viažucu ligand, transmembránovú doménu a doménu cytoplazmatickej smrti, priťahuje a aktivuje prokaspázy prostredníctvom adaptorových proteínov.
Ligandy receptorov smrti sú tiež homotriméry. Sú navzájom príbuzné a patria do rodiny signálnych molekúl faktora nekrózy nádorov. Napríklad cytotoxické lymfocyty nesú na svojom povrchu ligandy Fas, ktoré sa môžu viazať na receptory smrti Fas na plazmaléme cieľových buniek. V tomto prípade sú intracelulárne domény týchto receptorov spojené s adaptorovým proteínom ( FADD, doména smrti spojená s Fas ), a tie zase priťahujú iniciáciou pro-kaspázu 8 a/alebo 10. V dôsledku tejto série udalostí sa vytvorí signálny komplex vyvolávajúci smrť - DISC ( signálny komplex vyvolávajúci smrť ). Po aktivácii v tomto komplexe iniciačnými kaspázami štiepia efektorové prokaspázy a spúšťajú apoptotickú kaskádu.
Mnohé bunky syntetizujú molekuly, ktoré ich do určitej miery chránia pred aktiváciou vonkajšej dráhy apoptózy. Príkladom takejto ochrany môže byť expresia takzvaných návnadových receptorov ( návnadové receptory), ktoré majú extracelulárne domény viažuce ligand, ale nie domény cytoplazmatickej smrti, a preto nemôžu spustiť apoptózu a súťažiť s konvenčnými receptormi smrti o ligandy. Bunky môžu tiež produkovať proteíny, ktoré blokujú vonkajšiu dráhu apoptózy, ako je FLIP, ktorý je svojou štruktúrou podobný prokaspázam 8 a 10, ale nemá proteolytickú aktivitu. Inhibuje väzbu iniciačných prokaspáz na komplex DISC.
4.2. Vnútorná cesta
Apoptozóm
Apoptóza môže byť spustená aj zvnútra bunky, napríklad v prípade poranenia, poškodenia DNA, nedostatku kyslíka, živiny alebo signály extracelulárneho prežitia. U stavovcov sa táto signálna dráha nazýva vnútorná ( vnútorná dráha) alebo mitochondriálne, kľúčová udalosť v ňom dochádza k uvoľneniu určitých molekúl z medzimembránového priestoru mitochondrií. Cychróm c leží pred takými molekulami zocremy, ktoré vstupujú do elektrón-transportnej dýzy mitochondrií, prote v cytoplazme plní ďalšiu funkciu - prichádza k adaptorovému proteínu Apaf ( apoptotický faktor aktivujúci proteázu l ), čo spôsobuje, že sa oligomerizuje do kolesovej sedemčlennej štruktúry nazývanej apoptozóm. Apoptozóm získava a aktivuje iniciátor prokaspázu-9, ktorý potom môže aktivovať iniciátor prokaspázu.
V niektorých bunkách musí vonkajšia dráha apoptózy aktivovať vnútornú dráhu, aby bunku účinne zničila. Vnútorná dráha je vysoko regulovaná proteínmi rodiny Bcl-2.
4.2.1. Regulácia vnútornej dráhy proteínmi rodiny Bcl-2
Rodina Bcl-2 zahŕňa evolučne konzervované proteíny, ktorých hlavnou funkciou je regulovať uvoľňovanie cytochrómu c a iných molekúl z medzimembránového priestoru mitochondrií. Sú medzi nimi proapoptotické a antiapoptotické molekuly, ktoré môžu navzájom interagovať v rôznych kombináciách, potláčať sa navzájom, rovnováhu medzi ich aktivitou a určovať osud bunky.
V súčasnosti je známych asi 20 proteínov z tejto rodiny, z ktorých všetky obsahujú aspoň jednu zo štyroch alfa helikálnych Bcl2 homologických domén nazývaných BH1-4 ( bcl2 homológia). Antiapoptotické proteíny rodiny Bcl2 obsahujú všetky štyri domény, vrátane Bcl-2 samotnej, ako aj Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1 a A1. Proapoptotické proteíny sa delia do dvoch skupín, pričom členovia prvej z nich obsahujú tri BH domény (BH1-3), sú to najmä Bak, Bax a Bok (ten je exprimovaný len v tkanivách reprodukčných orgánov) . Najpočetnejšia z rodiny Bcl-2 je druhá skupina proapoptotických proteínov, ktoré obsahujú iba doménu BH3 (len BH3), patria sem Bim, Bid, Bad, Bik/Nbk, Bmf, Nix/BNIP3, Hrk, Noxa, Puma.
Za normálnych podmienok (t.j. keď bunka neprechádza apoptózou) sa antiapoptotické proteíny ako Bcl-2 a Bcl-XL viažu na proapoptotické proteíny BH123 (Bax a Bak) a bránia im v polymerizácii vo vonkajšej mitochondriálnej membráne. na vytvorenie pórov. V dôsledku pôsobenia určitého apoptotického podnetu sa v bunke aktivujú alebo začnú syntetizovať proapoptotické proteíny obsahujúce len doménu BH3. Na druhej strane inhibujú antiapoptotické proteíny, odstraňujú inhibičný účinok na Bak a Bax, alebo interagujú priamo s Bax a podporujú ich oligomerizáciu a tvorbu pórov. V dôsledku permeabilizácie vonkajšej membrány sa cytochróm c dostáva do cytosolu, ako aj do iných mediátorov apoptózy, ako je AIF. faktor indukujúci apoptózu ).
Napríklad, keď v bunke chýbajú signály prežitia, MAP kináza JNK aktivuje expresiu BH3 proteínu Bim, ktorý spúšťa vnútornú dráhu apoptózy. V prípade poškodenia DNA sa hromadí tumor supresor p53, ktorý stimuluje transkripciu génov kódujúcich BH3 proteíny Puma a Noxa, ktoré zároveň zabezpečujú prechod apoptózy. Ďalší proteín BH3, Bid, poskytuje spojenie medzi vonkajšou a vnútornou dráhou apoptózy. Po aktivácii receptorov smrti a v dôsledku toho kaspázy-8 táto štiepi Bid za vzniku skrátenej formy tBid (skrátený Bid), ktorá sa presúva do mitochónrie, kde potláča Bcl-2.
apoptóza- ide o naprogramovanú, geneticky sprostredkovanú formu bunkovej smrti, pri ktorej vonkajšie alebo vnútorné signály dávajú bunke impulz, aby vytvorila alebo aktivovala enzýmy, čo ju vedie k samodeštrukcii. Morfologicky je apoptóza charakterizovaná zmršťovaním bunky, kondenzáciou a fragmentáciou jadra, deštrukciou cytoskeletu a bulóznym výbežkom bunkovej membrány. Charakteristickým znakom apoptózy je, že umierajúca bunka si zachováva integritu svojej membrány, kým sa proces nedokončí, a až potom je deštrukcia jej membrány signálom pre fagocyty v okolí, aby absorbovali zostávajúce fragmenty a dokončili proces bunkovej degradácie. Apoptotické bunky, ktoré neprechádzajú okamžitou fagocytózou, sa premenia na malé, membránou viazané fragmenty nazývané „apoptotické telá“. Dôležitým znakom apoptózy je, že k odstráneniu umierajúcich buniek dochádza bez rozvoja zápalu.
Apoptóza hrá dôležitú úlohu vo fyziologických procesoch: organogenéza, embryonálny vývoj, regulácia zloženia a počtu bunkových populácií v tkanivách dospelého organizmu, rôzne hormonálne zmeny v organizme. Úloha apoptózy je dôležitá aj pri rôznych patologických procesoch. Najviac sa študuje pri raste nádorov.
Proces apoptózy možno rozdeliť do dvoch fáz:
tvorba a vedenie apoptotických signálov – fáza rozhodovania;
demontáž bunkových štruktúr- efektorová fáza.
Implementácia mechanizmov apoptózy je spojená s aktiváciou endogénnych bunkových enzýmov - cysteínových proteáz (kaspáz). Kaspázy sa nachádzajú v bunkách v neaktívnom stave (prokaspázy). K aktivácii dochádza ich proteolytickým štiepením a následnou dimerizáciou s tvorbou aktívnych podjednotiek. Cieľmi kaspáz sú proteíny zodpovedné za rôzne vitálne funkcie bunky. V súčasnosti je popísaných 14 druhov kaspáz, ktoré podľa funkčné vlastnosti možno rozdeliť do 3 skupín:
cytokínové aktivátory (kaspáza 1, 4, 5, 13)
kaspázy - induktory aktivácie efektorových kaspáz (kaspázy 2, 8, 9, 10)
efektorové kaspázy - aktéri apoptózy (3, 6, 7)
Jedna z membrán bunkové receptory zodpovedný za mechanizmy apoptózy je proteín nazývaný Fas receptor (CD95/APO1). Ligandom pre Fas receptor je proteín - Fas ligand (Fas-L), ktorý patrí do rodiny nádorových nekrotických faktorov a môže byť prítomný ako vo forme membránového proteínu, tak aj v rozpustnej forme. Väzba Fas receptora na Fas ligand vedie k aktivácii mechanizmov apoptózy s aktiváciou kaspázových induktorov. Pri následnej aktivácii efektorových kaspáz začína reťazec proteolytických reakcií, ktorých účelom je apoptotické „rozoberanie“ bunky: fragmentácia DNA, priame štiepenie štruktúrnych proteínov bunky a dysregulácia syntézy proteínov. Účasť efektorových kaspáz na apoptóze teda vedie k ruptúre apoptotickej bunky s okolitými bunkami, reorganizácii cytoskeletu, zníženým možnostiam opravy a replikácie DNA, prasknutiu jadrovej membrány a deštrukcii DNA, uvoľneniu signálov označujúcich bunku pre apoptózu. a disekcia bunky na apoptotické telá. Nie je náhoda, že efektorové kaspázy sa nazývajú „kaspázy popravcov“.
Metódy na štúdium apoptózy sú dosť rôznorodé. Spočiatku bola najbežnejšou metódou na stanovenie apoptózy elektroforéza extrahovanej DNA frakcie, ktorá umožňuje odhaliť diskrétnosť DNA s nízkou molekulovou hmotnosťou mol. hmoty (v dôsledku internukleozomálnej degradácie DNA). V morfologických štúdiách sa na detekciu zlomov DNA využíva metóda TUNEL, ktorá je založená na tvorbe značených oligonukleotidových inzertov v oblastiach zlomov DNA, ktorých vznik je katalyzovaný enzýmom TdT.
V súčasnosti sa na registráciu apoptózy lymfocytov čoraz viac využívajú metódy založené na prietokovej cytometrii. Do tejto skupiny patrí metóda založená na detekcii straty časti DNA bunkami (hypodiploidnými bunkami) pomocou fluorescenčného farbiva - propidium jodidu, ktorá je popísaná nižšie. Na stanovenie apoptózy sa používajú aj iné metódy založené na prietokovej cytometrii. Apoptózu lymfocytov možno detegovať už v skorom štádiu pomocou anexínu V značeného fluorochrómom, ktorý sa viaže na fosfatidylserín, ktorý sa objavuje na membráne buniek, ktoré prechádzajú apoptózou. Približnú predstavu o „sklone“ lymfocytov k rozvoju apoptózy možno získať stanovením expresie na ich povrchu receptora Fas (CD95) a v mitochondriách protokogénu bcl-2.
Klinický význam hodnotenia apoptózy počas klinického a imunologického vyšetrenia pacientov je nepochybný, keďže s jej porušením je spojených množstvo ochorení. Oslabenie apoptózy je spôsobené tvorbou autoimunitných ochorení (kvôli narušeniu procesu likvidácie autošpecifických klonov lymfocytov). Preto registrácia oslabenia apoptózy môže slúžiť ako zdroj informácií o patogenetických mechanizmoch takých autoimunitných ochorení, ako je systémový lupus erythematosus, reumatoidná artritída, ako aj autoimunitný lymfoproliferatívny syndróm, ktorého základom je mutácia génov určujúcich receptory pre apoptotické signály. Porušenie apoptózy je dôležitým mechanizmom pre rozvoj malígnych procesov. V nádorových bunkách sa často zistí mutácia génu p53 kódujúceho proteín, ktorý vníma signál o prítomnosti neopravených zlomov v DNA a chromozomálne mutáciečo vedie k rozvoju apoptózy. V dôsledku toho nie sú geneticky defektné bunky vyradené a stávajú sa zdrojom tvorby nádorov.
Pri mnohých iných ochoreniach je naopak zaznamenaný nárast apoptózy. K tomu dochádza pri infekčných procesoch (príčinou hromadnej apoptózy T-buniek sú často mikrobiálne superantigény), sepse, rôznych vírusové ochorenia vrátane AIDS. Apoptóza je zvýšená pri mnohých krvných ochoreniach a primárne imunodeficiencie keď je jej príčinou nedostatočná produkcia faktorov prežitia buniek, ktorých úlohu zohrávajú cytokíny. Pri jednej z foriem závažnej kombinovanej imunodeficiencie spojenej s mutáciou génu IL-7 alebo spoločného y-reťazca cytokínových receptorov je teda smrť lymfoidných prekurzorov v dôsledku nedostatku IL-7.
Najdôležitejšie je však hodnotenie "aktivačnej apoptózy", ktorej podstupujú lymfocyty, keď sú stimulované mitogénmi. Faktom je, že apoptóza je spolu s proliferáciou formou reakcie lymfocytov na aktivačné stimuly. V skorých štádiách diferenciácie prevažuje apoptotická odpoveď, ktorej výsledkom je vytvorenie tolerancie na induktorový antigén. Zrelé lymfocyty reagujú na stimuláciu prevažne proliferáciou (ktorá slúži počiatočná fáza a predpokladom pre rozvoj imunitnej odpovede), ale určitá pravdepodobnosť ich vstupu do aktivačnej apoptózy zostáva. Keďže apoptóza v tomto prípade pôsobí ako alternatívny proces k proliferácii, ich pomer môže slúžiť ako miera účinnosti bunkovej odpovede na aktivačné signály. Čím vyšší je príspevok apoptózy k odpovedi lymfocytov na mitogén, tým je menej účinný antigén-špecifický imunitnú obranu. Stanovenie apoptózy po aktivácii lymfocytov mitogénmi je teda najinformatívnejšie za podmienky paralelného hodnotenia proliferatívnej odpovede buniek na rovnaký stimul.
V procese apoptózy v bunke dochádza na molekulárnej úrovni ku komplexnému reťazcu reakcií, ktoré vedú k zmene metabolických procesov a fenotypových charakteristík buniek. Tieto zmeny môžu byť stanovené biochemickými, mikroskopickými alebo cytometrickými metódami a používajú sa ako markery apoptózy.
Jedným zo skorých markerov apoptózy je objavenie sa na cytoplazmatickej membráne bunky receptory pre anexín. V apoptotických bunkách je fosfolipid fosfatyldiserín (PS) preorientovaný a lokalizovaný na povrchu bunkovej membrány. PS lokalizácia na povrchu membrány sa pozoruje od
skoré štádium apoptózy až po úplnú degradáciu bunky. Rekombinantný
ny anexín V-proteín (35-36 kDa), ktorý má vysokú afinitu
na PS v prítomnosti Ca +2 iónov. Kontaktovanie FS na povrchu
anexín V konjugovaný s fluorochrómom slúži ako
marker apoptózy. Anexín V sa zvyčajne používa v kombinácii s
propidium jodid (PI), ktorý umožňuje súčasné rozpoznanie
intaktné bunky (negatívne pre anexín V aj PI), bunky
sú v „skorej“ apoptóze (pozitívne na anexín V,
negatívne na PI) a bunky v neskorej apoptóze resp
pri nekróze (pozitívne pre anexín V aj PI).
CD95 Fas alebo APO-1 je 45 kDa transmembránový glykoproteín, ktorý je členom rodiny receptorov tumor nekrotizujúceho faktora (TNF-a). Antigén CD95 je exprimovaný vo významných množstvách na tymocytoch, CD4+, CD8+ lymfocytoch periférnej krvi, v menšom rozsahu na B-lymfocytoch a NK bunkách. Tento antigén je tiež exprimovaný na granulocytoch a monocytoch, ale jeho expresia sa nenachádza na krvných doštičkách a erytrocytoch. Receptor CD95 je tiež pozorovaný na bunkách normálnych tkanív a nádorov. Väzba CD95 na Fas ligand (Fas-L, CD95L) indukuje apoptózu v bunkách, ktoré ho exprimujú. Monoklonálne protilátky proti CD95 umožňujú použitie metódy prietokovej cytometrie alebo fluorescenčnej mikroskopie na identifikáciu populácie buniek pripravených na apoptózu.
CD95L (Fas-L)– nazývaný Fas-ligand, je membránový proteín (40 kD). Existuje aj rozpustná forma CD95L (sFas-L), čo je proteín (26 kD) z rodiny receptorov (TNF-a). Tento antigén je exprimovaný cytotoxickými E-lymfocytmi a NK-bunkami a nachádza sa aj na mnohých nádorových bunkách. Väzba Fas-L na receptor CD95 indukuje proces apoptózy v cieľových bunkách. Monoklonálne protilátky proti CD95L umožňujú použitie metódy prietokovej cytometrie alebo fluorescenčnej mikroskopie na identifikáciu populácie buniek pripravených na apoptózu.
Bcl-2– proteín (26 kDa), ktorého nadmerná expresia blokuje apoptózu. Bcl-2 je intracelulárny proteín lokalizovaný na mitochondriách, preto na jeho stanovenie pomocou monoklonálnych protilátok je potrebné predbežne permeabilizovať bunkovú membránu.
Koniec práce -
Táto téma patrí:
Metódy hodnotenia imunitného stavu učebnice pre študentov lekárskych, pediatrických a medicínsko-profylaktických fakúlt
Štátna lekárska univerzita v Kursku Federálnej agentúry pre zdravie a sociálny rozvoj Katedra klinickej imunológie a alergológie..
Ak potrebujete ďalší materiál k tejto téme, alebo ste nenašli to, čo ste hľadali, odporúčame použiť vyhľadávanie v našej databáze diel:
Čo urobíme s prijatým materiálom:
Ak sa tento materiál ukázal byť pre vás užitočný, môžete si ho uložiť na svoju stránku v sociálnych sieťach:
| pípanie |
Všetky témy v tejto sekcii:
Imunitný stav a metódy jeho hodnotenia
Imunitný stav (IS) je súbor laboratórnych parametrov, ktoré charakterizujú kvantitatívnu a funkčnú aktivitu buniek imunitného systému. Indikátory IP sa vo veľkom líšia
Objekty a metódy imunologického výskumu
Predmety štúdia Metódy štúdia Fenotypová charakteristika imunokompetentné bunky Prietoková cytometria Imm
Lymfocyty
Ako súčasť buniek imunitného systému sú pravé imunocyty všetky varianty lymfocytov. Iné typy bielych krviniek (neutrofily, eozinofily, bazofily, monocyty), makrofágy, krvné doštičky, žírne bunky
MFS bunky
Monocyty periférnej krvi a tkanivové makrofágy pochádzajú z pluripotentných kmeňových buniek. Keď sa monocyty dostanú do krvného obehu, do 2-3 dní sa usadia v tkanivách, kde sa zmenia na tkanivo.
Antimikrobiálny systém závislý od kyslíka
na kyslíku závislé mechanizmy baktericídneho účinku glukóza + NADP+ → fosfát pentózy + NADPH Cytochróm b245 NADP + O2 ͛
mediátorových buniek
Granulocyty sú polymorfonukleárne leukocyty cirkulujúce v krvi a vznikajúce, podobne ako monocyty-makrofágové bunky, z myeloidnej kmeňovej bunky v kostnej dreni. Existujú tri druhy obilia
Metódy imunofenotypizácie lymfocytov
Pri štúdiu lymfocytov sa hodnotí ich počet v periférnej krvi a funkčná aktivita. Stanovenie počtu buniek sa uskutočňuje s prihliadnutím na diferenciačné antigény na a
Izolácia mononukleárnej frakcie
Metóda izolácie mononukleárnych buniek je založená na rozdielnom vztlaku rôznych krviniek. Použitie určitého hustotného gradientu umožňuje oddeliť mononukleárne bunky (lymfocyty, monocyty,
Prietoková cytometria
Prietoková cytometria je založená na meraní optických vlastností buniek. Bunky sa zavádzajú jednotlivo do laminárneho toku v kremennej kyvete, kde prechádzajú sústredeným svetlom
Metóda nepriamej imunofluorescencie
Nepriama imunofluorescencia je metóda založená na použití monoklonálnych protilátok značených fluorochrómom s vyhodnotením výsledkov s prihliadnutím na špecifickú luminiscenciu buniek pri fluorescenčnej mikroskopii.
Imunocytochemická metóda
Imunocytochemické metódy sú založené na použití enzýmov, ako je peroxidáza a alkalická fosfatáza. V súčasnosti sa najčastejšie používa metóda PA (peroxidáza-antiperoxidáza), st
Metódy štúdia funkčnej aktivity lymfocytov
Funkčná aktivita lymfocytov sa hodnotí nasledujúcimi účinkami: schopnosťou rozpoznávať antigény, aktiváciou, proliferáciou a diferenciáciou buniek. Schopnosť lymfocytov k
Reakcia blastickej transformácie lymfocytov
Kontakt lymfocytu s cudzím antigénom alebo nešpecifickým mitogénom je sprevádzaný reakciou aktivácie a blastickej transformácie (RBTL), t.j. proliferácia buniek s prechodom malých lymfocytov na blast
Zmiešaná kultúra lymfocytov
Kokultivácia lymfocytov s molekulami MHC-II rôzneho haplotypu spôsobuje ich blastickú transformáciu a proliferáciu. Reagujúce bunky sú T-lymfocyty a sú stimulované cudzími
Plazmatické proteíny
V ľudskej plazme je prítomných viac ako dvesto proteínov, z ktorých väčšina bola izolovaná a popísaná štrukturálne a funkčne. Plazmatické proteíny sú prevažne glykoproteíny. S elektrofó
Globulíny
α1-antitrypsín je α1-globulín, ktorý predstavuje viac ako 80 % sérovej antiproteázovej aktivity, je hlavnou zložkou α-pásma. V srvátkovej sóde
Globulíny
Haptoglobín - polčas rozpadu 2-4 dni. Obsah haptoglobínu v sére je v norme 0,3 – 2,0 g/l. Jeho hlavné funkčná hodnota- viazať voľný hemoglobín v sére
Metódy elektroforézy proteínov
Elektroforéza sa široko používa na semikvantitatívne stanovenie sérových proteínov a na detekciu paraproteínov. Elektroforéza sa vykonáva sérom, nie plazmou, tzv
Imunoglobulíny
Imunoglobulíny (Ig) sú špecifické proteíny, ktoré produkuje imunitný systém ako výsledok reakcie na cudzie antigény a hromadia sa v krvnom sére a iných biologických tekutinách.
Ľudské imunoglobulíny
Vlastnosť IgM IgG IgA IgD IgE Molekulárna forma Pentamer
Metódy stanovenia imunoglobulínov
Na kvantitatívne stanovenie obsahu Ig rôznych tried v krvnom sére a iných biologických tekutinách široké uplatnenie našli rôzne možnosti na usporiadanie precipitačnej reakcie v géli
Paraproteíny
Paraproteíny sú imunoglobulíny alebo ich fragmenty produkované tzv plazmatické bunky, vytvorený z jednej špecifickej bunkovej línie B-lymfocytov (monoklon). Paraproteíny často nie
Kryoglobulíny
Kryoglobulíny sú patologické plazmatické proteíny (10-80 mg / ml), ktoré majú vlastnosť premeniť sa na rôsolovitý stav pri teplotách pod 37 ° C. Väčšina kryoglobulínov sú polyklonálne komplexy
Metódy stanovenia imunitných komplexov
Väzba Ig na antigén je fyziologický proces vedúci k tvorbe imunitných komplexov (IC) zameraných na elimináciu antigénu z tela. Avšak za určitých podmienok
Stanovenie autoprotilátok v diagnostike systémových ochorení spojivového tkaniva
Podľa moderných koncepcií autoimunita označuje také stavy, pri ktorých sa v tele objavia protilátky alebo senzibilizované lymfocyty proti normálnym antigénom vlastných tkanív.
Hlavné sérologické markery autoimunitných ochorení
Antigén Pôvodný názov Molekulárna štruktúra Funkcia Diagnostická hodnota
Stanovenie ANA v reakcii nepriamej imunofluorescencie
V typickom teste sa pacientovo sérum inkubuje s antigénnymi substrátmi (zvieracie pečeňové alebo obličkové tkanivo, bunková kultúra Hep-2), aby sa dosiahla špecifická väzba
Nepriama imunofluorescencia
Vzor osvetlenia Antigénna špecifickosť Klinický význam Periférna alebo okrajová dsDNA, l
Stanovenie ANA a ENA pomocou ELISA na pevnej fáze
Testovací systém ANA ELISA (UBI MAGIWELL) - na skríningovú analýzu antinukleárnych protilátok poskytuje semikvantitatívne stanovenie široký rozsah protilátky proti komplexu adsorbovanému v jamkách
autoimunitné ochorenia
Typ patológie Výsledky imunologického výskumu. Typ protilátok a frekvencia ich výskytu (%)
Cytokínový systém
Cytokíny sú triedou rozpustných peptidových mediátorov imunitného systému, ktoré sú nevyhnutné pre jeho vývoj, fungovanie a interakciu s inými telesnými systémami. Oni definujú
interleukíny
IL-1 je imunoregulačný mediátor uvoľňovaný počas zápalových reakcií, tkanivových lézií a infekcií (prozápalový cytokín). IL-1 stimuluje proliferáciu a diferenciáciu
Interferóny
Interferón (IFN) bol objavený ako proteín s antivírusovou aktivitou. Antivírusové pôsobenie IFN je spôsobený jeho schopnosťou zabrániť intracelulárnej replikácii vírusu v štádiu
Faktory nekrózy nádorov
Faktor nekrózy nádorov (TNF) je hlavným mediátorom produkovaným organizmom v reakcii na gramnegatívne baktérie. Účinnou látkou gramnegatívnych baktérií je LPS zložka bunkovej steny.
faktory stimulujúce kolónie
Množstvo cytokínov vytvorených počas vývoja imunitnej odpovede má stimulačný účinok na diferenciáciu prekurzorov kostnej drene. Tieto cytokíny sa nazývajú stimulujúce kolónie
rastové faktory
Transformujúci rastový faktor (TGFβ) je rodina príbuzných peptidov s viacerými účinkami na všeobecné procesy regulácie rastu a morfogenézy. TGFβ - hlavný cytok
Metódy stanovenia cytokínov
Stanovenie obsahu cytokínov v rôznych biologických tekutinách má veľký význam pri hodnotení funkčnej aktivity imunokompetentných buniek a regulácii imunitnej odpovede. V samostatných riadkoch
Doplnkový systém
Systém komplementu je komplex proteínov krvného séra schopných samoorganizácie a sprostredkovania humorálnej imunity a reakcií fagocytózy. V súčasnosti je známe, že
Metódy stanovenia aktivity komplementu
Celková aktivita (titer) komplementu sa stanovuje v hemolytickej reakcii pomocou baraních erytrocytov. Komplement obsiahnutý v testovacom sére spôsobuje hemolýzu u senzibilizovaných baranov.
Doplňte titer v 50 % HE
Hemolýza, % K Hemolýza, % K Hemolýza, % K Hemolýza, % K
Stanovenie zložiek komplementu
Na stanovenie zložiek komplementu sa používa ELISA a turbidimetrická metóda, ktorej implementácia je opísaná v návode priloženom k diagnostickým testovacím systémom. IN klinickej praxi na
Doplňte komponenty
Doplnkový komponent Klinické prejavy Nedostatok C1 Zvyčajne nespôsobuje klinicky významné poruchy, pretože jedia
Metódy štúdia fagocytárnej aktivity granulocytov
Najdôležitejšia charakteristika funkciou granulocytov je hodnotenie ich fagocytárnej aktivity. Jeho pokles môže byť dôsledkom deficitu sérových opsonačných faktorov (protilátky, komplement
NST-test
Nitrozínový tetrazóliový test (NCT-test) sa používa na detekciu takzvaných aktivovaných granulocytov a monocytov. Aktivácia fagocytov je založená na prudkom zvýšení oxidačných reakcií
Metodológie výskumu
Potrebné reagencie a materiály: KN 42 ORO 44 0, Na 42 ORO 44 0, NaCl, glukóza, nitrózíntetrazolium, heparín, metylalkohol, 1% vodný roztok metylénovej zelene (v prípade
Stanovenie myeloperoxidázy
Myeloperoxidáza oxiduje množstvo substrátov (benzidín, ortofenylepiamín) v prítomnosti peroxidu vodíka, čo je sprevádzané farebnou reakciou. Myeloperoxidáza – enzým nachádzajúci sa vo fágových granulách
Chemiluminiscencia
Spontánna luminiscencia, ktorá vzniká pri chemických reakciách v dôsledku energie reagujúcich látok, sa nazýva chemiluminiscencia (CL). Je súčasťou všetkých tkanív a buniek živého organizmu, pokiaľ sú
Stanovenie obsahu IgE
Spomedzi imunologických metód na hodnotenie nešpecifických parametrov imunitného stavu pri väčšine atopických ochorení má najväčší význam stanovenie množstva celkového IgE. Avšak
Basofilný degranulačný test
U alergických pacientov sa významná časť IgE viaže na rôzne leukocyty prostredníctvom ich Fc receptorov. Prítomnosť buniek nesúcich protilátky indikuje ich senzibilizáciu na zodpovedajúci alergén. B
Stimulačný test bazofilných buniek antigénom - CAST
V prípade alergických reakcií sprostredkovaných IgE sa spúšťací mechanizmus začína väzbou alergénu na špecifické molekuly IgE na povrchu bazofilov resp. žírne bunky. E
Reakcia inhibície migrácie leukocytov
Reakcia je nastavená na identifikáciu lymfocytov senzibilizovaných na údajný alergén. Senzibilizované lymfocyty pri interakcii so špecifickým alergénom uvoľňujú mediátory (FPML
Úloha č.1
23-ročný pacient sa sťažuje na opakujúce sa vriedky lokalizované na tvári a nohách. Zaznamenáva časté prechladnutia (až 7-8 krát za rok), herpetické vyrážky na perách.
Úloha č. 2
Pacient N. vo veku 22 rokov sa obrátil na imunológa so sťažnosťami na opakované akútne respiračné vírusové infekcie (až 7-krát do roka), často sprevádzané exacerbáciou chronickej obštrukčnej bronchitídy. Vedené antibakteriálne
Úloha č. 3
Pacient T. vo veku 27 rokov opakovane konzultoval s lekárom opakované akútne respiračné vírusové infekcie, tracheobronchitídu, slabosť a malátnosť. Z anamnézy sa zistilo, že v priebehu roka mal ARVI šesťkrát, dvakrát
Úloha č. 4
Pacient K, 45 rokov. Diagnóza: systémový lupus erythematosus. Imunologická štúdia odhalila: Leukocyty - 5,5 x 109/l Lymfocyty -37 %, abs. 2,03 x 109
Úloha číslo 5
5-ročné dieťa patrí do skupiny často a dlhodobo chorých detí, recidívy ARVI raz za mesiac, ložiská chronickej infekcie ( chronická sinusitída, adenoiditída), zväčšené krčné lymfatické uzliny
Na imunologickom vysetreni
Testy úrovne 1 Celkový počet bielych krviniek. Leukoformula T-lymfocyty B-lymfocyty
Všeobecná analýza krvi
Normálne jednotky SI Hemoglobín M F 130,0-160,0 120,0-140,0 g/l
Hlavné CD markery buniek imunitného systému
CD marker Bunková populácia % buniek CD2 T a NK bunky
Subpopulácia lymfocytov u detí
lymfocyty 4-5 dní - 3 mesiace 4-8 mesiacov 1-2 roky 2-5 rokov nad 5 rokov Sln.
Hladina imunoglobulínov v krvnom sére dospelých
IgM IgG IgA IgE 1,3-1,7 g/l 12-14 g/l 2,1-2,9 g/l
Alergologický MAST-panel (viacnásobný alergosorbentový test) na detekciu špecifických imunoglobulínov na alergény rôznych skupín
Panel potravín Ig E Ruský rozšírený panel Ig E Panel potravín Ig G Ruský univerzálny panel Ig E
Slovníček pojmov
Avidita je sila väzby antigénu na protilátku, ktorá je určená afinitou a valenciou protilátok. Aglutinácia - agregácia do
Zoznam skratiek a konvencií
AG - antigén AFC - bunka produkujúca protilátku APC - bunka prezentujúca antigén AT - protilátka VLS - eferentná lymfatická cieva SVK je infikovaný vírus
Vyšetrených bolo 45 detí vo veku 3–15 rokov. Cieľom štúdie bolo zistiť pripravenosť na apoptózu lymfocytov a neutrofilov periférnej krvi stanovením markerov apoptózy – CD95, CD95L, BSL2. Pri hodnotení apoptózy imunokompetentných buniek sa zistil pokles pripravenosti na programovanú bunkovú smrť lymfocytov a nárast neutrofilných granulocytov. Najvýraznejšie zmeny zaznamenávame vo vekovej skupine 7–15 rokov so skúsenosťou s ochorením viac ako 3 roky. Získané údaje môžu byť znakom potlačenia programovanej smrti autoreaktívnych lymfocytov v tkanive pankreasu, čo prispieva k predĺženiu imunitnej odpovede. Zvýšenie podielu leukocytových buniek exprimujúcich CD95L môže posilniť procesy programovanej bunkovej smrti v β-bunkách ostrovčekov pankreasu infiltrovaných imunokompetentnými bunkami.
apoptóza neutrofilov
apoptóza lymfocytov
diabetes 1. typu
1. Pekareva E. V. Markery apoptózy u pacientov cukrovka Typ 1 na začiatku ochorenia / E. V. Pekareva a kol. // Diabetes mellitus. - 2009. - č. 4. - S. 86-89.
2. Pekareva E. V. Úloha apoptózy v patogenéze diabetes mellitus 1. typu / E. V. Pekareva, T. V. Nikonova, O. M. Smirnova // Diabetes mellitus. - 2010. - č. 1. - S.45-48.
3. Adeghate E. Aktualizácia etiológie a epidemiológie diabetes mellitus / E. Adeghate, P. Schattner, E. Dunn // Ann NY. Acad Sci, 2006. - Vol. 1084. – S. 1–29.
4. Klinický význam apoptózy neutrofilov v periférnej krvi pacientov s diabetes mellitus 2. typu / C. Sudo et al. // Laboratórny hematol. 2007; 13(3):108-12 (redukované).
5. Filep J. G. Apoptóza neutrofilov: cieľ na zlepšenie riešenia zápalu / J. G. Filep, E. l. Kebir // J. Cell Biochem. - 2009. - Zv. 108. – S. 1039–1046.
6. Ľudské polymorfonukleárne neutrofilné reakcie na Burkholderia pseudomallei u zdravých a diabetických subjektov / S. Chanchamroen a kol. // Infect Immun. - 2009. - Zv. 77. - str. 456-463 (znížená apoptóza).
7. Impact of Lymphocyte Apoptosis in Diabetes mellitus / K. A. Awadhesh et al. // Asian Journal of Medical Sciences. - 2011. - č. 2. - S. 1-6.
8. Zápal je trvalejší u diabetických myší 1. typu / D. T. Graves et al. // J. Dent. Res., 2005. Vol. 84. – S. 324–328.
9. Juliana C. Alves Infekcie u pacientov s diabetes mellitus: Prehľad patogenézy / C. Juliana, C. Janine, C. Alves // Indian J. Endocrinol. Metab. – marec 2012. – Supp l1. – Číslo 16. – S. 27–36.
10. Luo H. R. Konštitutívna apoptóza neutrofilov: mechanizmy a regulácia / H. R Luo, F. Loison // Am. J. Hematol. - 2008. - Zv. 83. – S. 288–295.
Úvod
Diabetes mellitus 1. typu (DM1) je polygénne, multifaktoriálne ochorenie spojené s tvorbou autoprotilátok a autoreaktívnych T-lymfocytov voči β-bunkám pankreasu.
Vedúce články v patogenéze autoimunitné lézie sú imunitná dysregulácia a programovaná bunková smrť.
Riadená apoptóza sa dnes považuje za hlavný mechanizmus udržiavania optimálnej rovnováhy buniek v ohnisku zápalu, obmedzuje expanziu aktivovaných klonov a bráni rozvoju autoimunitných reakcií. Ak dôjde k defektu pri jeho realizácii, aktivované imunitné bunky sa môžu hromadiť, čo vedie k vzniku autoimunitných ochorení.
Účel štúdie: štúdium aktivačných markerov apoptózy CD95, CD95L, Bsl2 na periférnych krvných lymfocytoch a neutrofiloch pri diabetes mellitus 1. typu u detí.
Materiál a metódy výskumu
Vyšetrených bolo 45 detí s diabetes mellitus 1. typu vo veku 3-15 rokov. Skupina I zahŕňala 20 detí vo veku 3-6 rokov (predškoláci), skupina II - 12 detí vo veku 7-15 rokov (školáci) s trvaním ochorenia menej ako 3 roky, skupina III - 13 detí vo veku 7-15 rokov (školáci) so skúsenosťami s ochorením viac ako 3 roky. Kontrolnú skupinu tvorilo 30 zdravých detí vo veku 3-6 (15) a 7-15 (15) rokov. Štúdia bola vykonaná na základe endokrinologického oddelenia Detskej mestskej klinickej nemocnice pomenovanej po. G. K. Filippsky, Stavropol.
Na vyhodnotenie programovanej bunkovej smrti sa určil počet lymfocytov a neutrofilných granulocytov exprimujúcich markery apoptózy. Lymfocyty boli izolované na Ficoll-Paque hustotnom gradiente, neutrofily boli izolované na Ficoll-Paque gradiente s dvojitou hustotou a ficoll-urografín (GE Healthcare, Švédsko). Bunková suspenzia sa trikrát premyla v médiu RPMI-1640 (Vector-Best, Rusko). V kultúrach lymfocytov a neutrofilov sa počet buniek exprimujúcich CD95, CD95L, Bsl2 odhadol prietokovou cytometriou s použitím monoklonálnych protilátok (Invitrogen, USA).
Na analýzu štatistických údajov sa použil softvérový balík "Primer of Biostat 4.0", Attestat 10.5.1. Na vyhodnotenie rozdielov medzi skupinami sa použila analýza rozptylu s opakovanými meraniami s výpočtom kritérií Newman-Keuls, Dunn.
Kvantitatívne hodnoty boli charakterizované abnormálnou distribúciou a boli prezentované ako medián a interkvantil (25. a 75. percentil) rozsah (Me (Q1-Q)). Rozdiely na str<0,05.
Výsledky a ich diskusia
Štúdia zistila pokles počtu lymfocytov exprimujúcich Fas receptory (CD95) u pacientov všetkých skupín v porovnaní so zdravými deťmi (tabuľka 1). Minimálne ukazovatele boli zaznamenané u detí vo veku 7-15 rokov so skúsenosťami s ochorením viac ako 3 roky (tabuľka 1).
stôl 1
Indikátory apoptózy lymfocytov u detí s diabetes mellitus 1. typu
|
Klinické skupiny |
||||
|
3-6 rokov |
DM1 (I) (n=20) |
17,7(15,9-19,43) * ** |
7,4(5,81- 8,94) * ** |
70,2(68,56-71,76) * ** |
|
Kontrolná skupina |
28,0(26,08-30,0) |
9,2(8,04- 10,25) |
65,9(62,82-69,05) |
|
|
7-15 rokov |
20,5(17,94-23,02) * ** |
11,6(10,12-13,14) * ** |
70,3(65,72-74,9) * ** |
|
|
13,9(10,04-17,73) * ** |
15,6(14,26-16,87) * ** |
79,5(75,47-83,59) * ** |
||
|
Kontrolná skupina |
26,5 (24,20-28,84) |
8,14 (6,49-9,78) |
60,3(56,97-63,66) |
*- p<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- p<0,05 - по сравнению с группой
Pri hodnotení úrovne expresie antiapoptotických markerov (Bsl2) bolo zistené jej zvýšenie na lymfocytoch detí všetkých skupín, výraznejšie u školákov s trvaním ochorenia viac ako 3 roky, čo tiež poukazuje na porušenie Fas-dependentného apoptóza u detí s diabetes mellitus 1. typu, čo vedie k spomaleniu procesov bunkovej smrti autoreaktívnych foriem lymfocytov.
Naše výsledky môžu byť nepriamym znakom potlačenia programovanej smrti aktivovaných lymfocytov v tkanive pankreasu, čo prispieva k predĺženiu imunitnej odpovede.
Úroveň apoptickej pripravenosti lymfoidných buniek závisí od trvania ochorenia a klesá u detí so skúsenosťou s DM1 viac ako 3 roky.
Predtým sa ukázalo, že rezistencia lymfocytov na apoptózu sa deteguje pri diabetes mellitus, čo môže vysvetliť povahu a trvanie autoimunitnej odpovede.
V kultúre lymfocytov od detí s diabetes mellitus bolo zistené zvýšenie percenta lymfocytov exprimujúcich CD95L (tab. 1) v porovnaní so skupinou zdravých detí. Najvyššie miery boli stanovené u detí vo veku 7-15 rokov so skúsenosťami s ochorením dlhším ako 3 roky (tabuľka 1).
Je známe, že pri DM1 sú pankreatické ostrovčeky infiltrované imunitnými bunkami produkujúcimi široké spektrum cytokínov, čo je sprevádzané aberantnou expresiou membránových receptorov. Pod vplyvom zvýšenej koncentrácie glukózy a cytokínov začnú β-bunky na svojom povrchu exprimovať CD95, ktorý v norme prakticky chýba.
Zvýšenie expresie CD95L na lymfoidných bunkách pravdepodobne spôsobuje výraznejší apoptotický proces v β-bunkách pankreasu a ich následné odstránenie.
V posledných rokoch sa ukázalo, že neutrofilné granulocyty sa aktívne podieľajú na tvorbe autoimunitného zápalu. Reakcia neutrofilov zameraná na lokalizáciu a elimináciu autoantigénov do značnej miery závisí od sily a trvania antigénneho účinku na imunitný systém, ako aj od počiatočnej úrovne funkčnej aktivity buniek.
Zistili sme, že priebeh diabetes mellitus u detí je sprevádzaný zvýšením percenta neutrofilov exprimujúcich markery apoptózy (CD95) a znížením podielu buniek, ktoré majú na svojom povrchu Bsl2 antiapoptotické proteíny (tabuľka 2).
tabuľka 2
Indikátory apoptózy neutrofilov u detí s diabetes mellitus 1
|
klinických skupín |
||||
|
3-6 rokov |
DM1 (I) (n=20) |
75,1(71,49-78,72) * ** |
9,5 (8,63- 10,32) * ** |
3,68 (3,46-3,90 * ** |
|
kontrolná skupina |
59,2 (56,31- 62,01) |
7,35 (6,58- 8,12) |
||
|
7-15 rokov |
DM1, skúsenosť s ochorením menej ako 3 roky (II) (n=12) |
77,6(71,15-83,99) * ** |
9,5(8,14-10,92) * ** |
3,99(2,9- 5,08) * ** |
|
DM1, skúsenosť s ochorením viac ako 3 roky (III) (n=13) |
87,9(84,24-91,63) * ** |
12,1(10,22-13,96) * ** |
2,78(2,36-3,19) * ** |
|
|
kontrolná skupina |
58,43(54,95- 1,90) |
*- p<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- p<0,05 - по сравнению с группой III (Newman-Keulsovo kritérium, Dunnovo kritérium).
S porovnávacou medziskupinovou charakteristikou sú maximálne ukazovatele CD95 (s<0,05) и минимальные Bsl2 (p<0,05) отмечены у детей 7-15 лет с длительностью заболевания более 3-х лет.
Bolo zistené zvýšenie percenta polymorfonukleárnych leukocytov s CD95L na ich povrchu. Najvyššie miery boli zaznamenané u detí školákov so skúsenosťami s ochorením viac ako 3 roky.
Výsledky štúdie apoptózy PMNL u diabetes mellitus prezentované v literatúre sú kontroverzné. Existujú dôkazy o zvýšení rýchlosti apoptózy neutrofilov periférnej krvi u DM1 a DM2.
Viaceré štúdie však zistili pokles apoptózy neutrofilných granulocytov u pacientov s diabetom 1. typu, najmä v podmienkach hyperglykémie, ktorá pravdepodobne iniciuje chronické zápalové procesy s poškodením tkaniva a tiež predisponuje k protrahovaným bakteriálnym infekciám u pacientov s 1. cukrovka.
Naše výsledky naznačujú, že pacienti s DM1 majú zvýšenú predispozíciu PMNL k apoptóze, čo môže byť prejavom ochrannej reakcie zameranej na elimináciu „nadbytku“ aktívnych neutrofilov, ktorých tvorba zvyšuje poškodenie tkaniva.
Zvýšenie apoptotického potenciálu neutrofilných granulocytov je odrazom aktívneho zapojenia PMNL do imunopatogenézy ochorenia.
Zvýšenie expresie CD95L na neutrofilných granulocytoch u pacientov s diabetes mellitus môže pravdepodobne prispieť k eliminácii nielen pankreatických buniek, ale aj ich vlastných leukocytových buniek.
Pri hodnotení apoptózy imunokompetentných buniek u detí s diabetom 1. typu sa teda zistil pokles pripravenosti na programovanú bunkovú smrť lymfocytov a nárast polymorfonukleárnych leukocytov.
Najvýraznejšie zmeny zaznamenávame vo vekovej skupine 7-15 rokov so skúsenosťou s ochorením viac ako 3 roky. U detí všetkých skupín sa zistilo zvýšenie podielu leukocytových buniek exprimujúcich CD95L na svojom povrchu.
Je známe, že PMNL sú spojením medzi vrodenou a adaptívnou imunitou a zohrávajú vedúcu úlohu v antibakteriálnej ochrane.
Zvýšenie ich apoptotickej aktivity môže spôsobiť nízku vekovú rezistenciu dieťaťa a jeho náchylnosť na infekčné ochorenia.
Zníženie počtu lymfoidných buniek citlivých na indukciu apoptózy je nepriamym znakom potlačenia programovanej bunkovej smrti a zhoršenej eliminácie aktivovaných foriem lymfocytov.
závery
1. U detí s diabetom 1. typu dochádza k poklesu pripravenosti na apoptózu lymfocytov periférnej krvi, k zvýšeniu neutrofilných granulocytov, čo je sprevádzané zmenou expresie CD95 a Bsl2 a závisí od dĺžky ochorenia. .
2. Zvýšenie expresie CD95L na lymfocytoch a neutrofilných granulocytoch v DM1 môže posilniť procesy programovanej bunkovej smrti v β-bunkách ostrovčekov pankreasu infiltrovaných imunokompetentnými bunkami.
Recenzenti:
Shchetinin E.V., doktor lekárskych vied, profesor, prorektor pre výskum a inovácie, SSMU, vedúci katedry HBO HPE „Stavropol State Medical University“ Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie, Stavropol.
Golubeva M.V., doktor lekárskych vied, profesor, vedúci Katedry detských infekčných chorôb, Štátna lekárska univerzita Stavropol, Štátna lekárska univerzita Stavropol, Stavropol.
Bibliografický odkaz
Barycheva L.Yu., Erdni-Goryaeva N.E. MARKERY APOPTÓZY IMUNOKOMPETENTNÝCH BUNIEK PRI DIABETES MELLITUS TYPU 1 U DETÍ // Moderné problémy vedy a vzdelávania. - 2013. - č. 4.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=9953 (dátum prístupu: 18.07.2019). Dávame do pozornosti časopisy vydávané vydavateľstvom "Academy of Natural History"