يجب أن يبدأ العلاج من قبل الطبيب. علاوة على ذلك ، بإذن من الطبيب ، يمكن للمريض إعطاء جرعة الصيانة لنفسه (إذا تم وصف الدواء s / c).
التهاب الكبد المزمن B: البالغون - 5 ملايين وحدة دولية يوميًا أو 10 ملايين وحدة دولية 3 مرات في الأسبوع كل يومين لمدة 4-6 أشهر (16-24 أسبوعًا).
الأطفال - ق / ج بجرعة أولية تبلغ 3 ملايين وحدة دولية / متر مربع 3 مرات في الأسبوع (كل يومين) لمدة أسبوع واحد من العلاج ، تليها زيادة في الجرعة إلى 6 ملايين وحدة دولية / متر مربع (بحد أقصى يصل إلى 6 ملايين وحدة دولية / متر مربع) 10 مليون وحدة دولية / متر مربع 3 مرات في الأسبوع (كل يومين).
مدة العلاج - 4-6 أشهر (16-24 أسبوعًا).
إذا لم يكن هناك تحسن في محتوى الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد الوبائي في الدم بعد العلاج لمدة 3-4 أشهر بالجرعة القصوى المسموح بها ، يجب إيقاف الدواء.
توصيات لتعديل الجرعة في حالة انخفاض عدد الكريات البيض أو الحبيبات أو الصفائح الدموية: مع انخفاض في عدد الكريات البيض أقل من 1.5 ألف / ميكرولتر ، الصفائح الدموية أقل من 100 ألف / ميكرولتر ، الحبيبات أقل من ألف / ميكرولتر - يتم تقليل الجرعة بنسبة 50٪ ، في حالة الانخفاض يكون عدد الكريات البيض أقل من 1200 / ميكرولتر ، والصفائح الدموية أقل من 70 ألف / ميكرولتر ، والخلايا المحببة أقل من 750 / ميكرولتر - يتم إيقاف العلاج ويتم وصفه مرة أخرى في نفس الوقت جرعة بعد تطبيع هذه المؤشرات.
التهاب الكبد المزمن C - 3 ملايين وحدة دولية كل يوم (كعلاج وحيد أو بالاشتراك مع ريبافيرين). في المرضى الذين يعانون من مسار الانتكاس للمرض ، يتم استخدامه مع ريبافيرين. مدة العلاج الموصى بها حاليًا محدودة بـ 6 أشهر.
في المرضى الذين لم يتلقوا علاجًا سابقًا بـ interferon alfa2b ، تزداد فعالية العلاج مع استخدام الجمع بين العلاجمع ريبافيرين. مدة العلاج المركب 6 أشهر على الأقل. يجب أن يتم العلاج لمدة 12 شهرًا في المرضى الذين يعانون من النمط الجيني للفيروس الأول والمرتفع العبئ او الحمل الفيروسي، حيث لا يتم اكتشاف الحمض النووي الريبي لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي في مصل الدم بحلول نهاية الأشهر الستة الأولى من العلاج. عند اتخاذ قرار تمديد العلاج المركب لمدة تصل إلى 12 شهرًا ، يجب أيضًا مراعاة عوامل الإنذار السلبية الأخرى (العمر فوق 40 عامًا ، والجنس الذكري ، ووجود التليف).
كعلاج وحيد ، يستخدم Intron A بشكل رئيسي في حالات عدم تحمل الريبافيرين أو في وجود موانع لاستخدامه. لم يتم بعد تحديد المدة المثلى للعلاج الأحادي Intron A ؛ العلاج الموصى به حاليًا لمدة 12 إلى 18 شهرًا. خلال الأشهر الثلاثة أو الأربعة الأولى من العلاج ، عادة ما يتم تحديد وجود الحمض النووي الريبي لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي ، وبعد ذلك يستمر العلاج فقط للمرضى الذين لم يتم اكتشاف الحمض النووي الريبي لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي.
التهاب الكبد المزمن D: s / c بجرعة أولية تبلغ 5 ملايين وحدة دولية / م 2 3 مرات في الأسبوع لمدة 3-4 أشهر على الأقل ، على الرغم من أنه قد يتم الإشارة إلى علاج أطول. يتم اختيار الجرعة مع مراعاة تحمل الدواء.
الورم الحليمي في الحنجرة: 3 ملايين وحدة دولية / متر مربع 3 مرات في الأسبوع (كل يومين). يبدأ العلاج بعد الاستئصال الجراحي (بالليزر) لنسيج الورم. يتم اختيار الجرعة مع مراعاة تحمل الدواء. قد يتطلب تحقيق استجابة إيجابية علاجًا لأكثر من 6 أشهر.
ابيضاض الدم مشعر الخلايا: 2 مليون وحدة دولية / متر مربع 3 مرات في الأسبوع (كل يومين). يتم اختيار الجرعة مع مراعاة تحمل الدواء.
استجاب مرضى استئصال الطحال وغير استئصال الطحال بالتساوي للعلاج وأبلغوا عن انخفاض مماثل في متطلبات نقل الدم. عادة ما يبدأ تطبيع واحد أو أكثر من معايير الدم في غضون شهر إلى شهرين بعد بدء العلاج. قد يستغرق الأمر 6 أشهر أو أكثر لتحسين جميع معلمات الدم الثلاثة (عدد الخلايا المحببة ، وعدد الصفائح الدموية ، ومستوى الهيموغلوبين). قبل بدء العلاج ، من الضروري تحديد مستوى خضاب الدم وعدد الصفائح الدموية والخلايا الحبيبية والخلايا المشعرة في الدم المحيطي وعدد الخلايا المشعرة في الدم. نخاع العظم. يجب مراقبة هذه المعلمات بشكل دوري أثناء العلاج من أجل تقييم الاستجابة لها. إذا استجاب المريض للعلاج ، فيجب أن يستمر حتى يتوقف التحسن الإضافي وتستقر القيم المختبرية لمدة 3 أشهر تقريبًا. إذا لم يستجب المريض للعلاج خلال 6 أشهر ، يجب إيقاف العلاج. لا ينبغي أن يستمر العلاج في حالة التطور السريع للمرض والأحداث الضائرة الشديدة.
في حالة انقطاع العلاج بـ Intron A ، كان استخدامه المتكرر فعالاً في أكثر من 90٪ من المرضى.
سرطان الدم النخاعي المزمن. الجرعة الموصى بها كعلاج أحادي هي 4-5 مليون وحدة دولية / متر مربع في اليوم ، ق / ج. للحفاظ على عدد الكريات البيض ، قد يكون من الضروري استخدام جرعة 0.5-10 مليون وحدة دولية / متر مربع. إذا كان العلاج يمكن أن يحقق السيطرة على عدد الكريات البيض ، ثم للحفاظ على مغفرة الدم ، يجب استخدام الدواء بالجرعة القصوى المسموح بها (4-10 مليون وحدة دولية / م 2 يوميًا). يجب التوقف عن الدواء بعد 8-12 أسبوعًا إذا لم يؤد العلاج إلى مغفرة دموية جزئية على الأقل أو انخفاض مهم سريريًا في عدد الكريات البيض.
العلاج المركب مع سيتارابين: Intron A - 5 مليون وحدة دولية / متر مربع يوميًا s / c ، وبعد أسبوعين يضاف cytarabine بجرعة 20 مجم / متر مربع يوميًا s / c ، لمدة 10 أيام متتالية شهريًا (الجرعة القصوى - ما يصل إلى 40 ملغ / يوم). يجب إيقاف Intron A بعد 8-12 أسبوعًا ما لم ينتج عن العلاج على الأقل مغفرة دموية جزئية أو انخفاض مهم سريريًا في عدد الكريات البيض.
أظهرت الدراسات احتمالية أكبر لتحقيق استجابة لعلاج Intron A في المرضى الذين يعانون من المرحلة المزمنةمرض. يجب أن يبدأ العلاج في أقرب وقت ممكن بعد التشخيص ويستمر حتى الشفاء التام من أمراض الدم أو لمدة 18 شهرًا على الأقل. في المرضى الذين يستجيبون للعلاج ، عادة ما يتم ملاحظة التحسن في معايير الدم في غضون 2-3 أشهر. في مثل هؤلاء المرضى ، يجب أن يستمر العلاج حتى مغفرة دموية كاملة ، ومعيارها هو عدد الكريات البيض في الدم من 3-4 آلاف / ميكرولتر. في جميع المرضى الذين يعانون من تأثير دموي كامل ، يجب أن يستمر العلاج من أجل تحقيق تأثير خلوي خلوي ، والذي لا يتطور في بعض الحالات إلا بعد عامين من بدء العلاج.
في المرضى الذين لديهم عدد WBC يزيد عن 50000 / ميكرولتر في وقت التشخيص ، قد يبدأ الطبيب العلاج باستخدام هيدروكسي يوريا بالجرعة القياسية ، وبعد ذلك ، عندما ينخفض عدد كرات الدم البيضاء إلى أقل من 50000 / ميكرولتر ، قم بتغييره إلى Intron A. المرضى الذين تم تشخيصهم حديثًا في المرحلة المزمنة من ابيضاض الدم النخاعي المزمن إيجابي الحموضة ، تم أيضًا إجراء علاج مشترك مع Intron A و hydroxyurea. بدأ العلاج بـ Intron A بجرعات من 6-10 مليون وحدة دولية / يوم ق / ج ، ثم تمت إضافة هيدروكسي يوريا بجرعة 1-1.5 جم مرتين في اليوم ، إذا تجاوز العدد الأولي من الكريات البيض 10 آلاف / ميكرولتر ، و استمر في استخدامه حتى بينما لم ينخفض عدد الكريات البيض بأقل من 10 آلاف / ميكرولتر. ثم تم إلغاء هيدروكسي يوريا ، واختيرت جرعة Intron A بحيث كان عدد العدلات (الطعنة والكريات البيض المجزأة) 1-5 ألف / ميكرولتر ، وكان عدد الصفائح الدموية أكثر من 75 ألف / ميكرولتر.
كثرة الصفيحات المرتبطة بسرطان الدم النخاعي المزمن: 4-5 مليون وحدة دولية / متر مربع في اليوم ، يوميًا ، ق / ج. للحفاظ على عدد الصفائح الدموية ، قد يكون من الضروري استخدام الدواء بجرعات 0.5-10 مليون وحدة دولية / متر مربع.
ليمفوما اللاهودجكين: ق / ج - 5 ملايين وحدة دولية 3 مرات في الأسبوع (كل يومين) مع العلاج الكيميائي.
ساركوما كابوزي على خلفية الإيدز: لم يتم تحديد الجرعة المثلى. هناك دليل على فعالية Intron A بجرعة 30 مليون وحدة دولية / متر مربع 3-5 مرات في الأسبوع. تم استخدام الدواء أيضًا بجرعات أصغر (10-12 مليون وحدة دولية / متر مربع / يوم) دون انخفاض واضح في الفعالية.
إذا استقر المرض أو استجاب للعلاج ، يستمر العلاج حتى يحدث تراجع للورم أو يلزم سحب الدواء (تطور عدوى انتهازية شديدة أو غير مرغوب فيه أثر جانبي). في الأبحاث السريريةمرضى الإيدز وساركوما كابوزي تلقوا Intron A بالاشتراك مع زيدوفودين وفقًا للمخطط التالي: Intron A - بجرعة 5-10 مليون وحدة دولية / متر مربع ، زيدوفودين - 100 مجم كل 4 ساعات.كانت قلة العدلات هي التأثير السام الرئيسي الحد من الجرعة. يمكن بدء العلاج باستخدام Intron A
الافراج عن الشكل والتكوين والتغليف
حقنة شفاف ، عديم اللون.
سواغ:
0.5 مل - أمبولات (5) - عبوات نفطة (1) - عبوات كرتون.
0.5 مل - أمبولات (5) - عبوات نفطة (2) - عبوات من الورق المقوى.
0.5 مل - زجاجات (1) - عبوات من الورق المقوى.
0.5 مل - زجاجات (5) - عبوات نفطة (1) - عبوات كرتون.
0.5 مل - محاقن زجاجية (1) - عبوات نفطة (1) - عبوات كرتون.
0.5 مل - محاقن زجاجية (1) - عبوات نفطة (3) - عبوات كرتون.
0.5 مل - محاقن زجاجية (3) - عبوات نفطة (1) - عبوات كرتون.
0.5 مل - محاقن زجاجية (3) - عبوات نفطة (3) - عبوات كرتون.
حقنة شفاف ، عديم اللون.
سواغ:أسيتات الصوديوم ، كلوريد الصوديوم ، ملح ثنائي إيثيلين أمين رباعي حمض ثنائي الصوديوم ، توين -80 ، ديكستران 40 ، ماء للحقن.
1 مل - أمبولات (5) - عبوات نفطة (1) - عبوات كرتون.
1 مل - أمبولات (5) - عبوات نفطة (2) - عبوات كرتون.
1 مل - زجاجات (1) - عبوات من الورق المقوى.
1 مل - قوارير (5) - عبوات نفطة (1) - عبوات كرتون.
1 مل - محاقن زجاجية (1) - عبوات نفطة (1) - عبوات كرتون.
1 مل - محاقن زجاجية (1) - عبوات نفطة (3) - عبوات كرتون.
1 مل - محاقن زجاجية (3) - عبوات نفطة (1) - عبوات كرتون.
1 مل - محاقن زجاجية (3) - عبوات نفطة (3) - عبوات كرتون.
المجموعة السريرية والدوائية
الانترفيرون. دواء مضاد للورم ومضاد للفيروسات ومعدّل للمناعةالتأثير الدوائي
الانترفيرون. Altevir ® له تأثيرات مضادة للفيروسات ، مناعية ، مضادة للتكاثر ومضادة للأورام.
يتسبب تفاعل إنترفيرون ألفا -2 ب ، الذي يتفاعل مع مستقبلات معينة على سطح الخلية ، في سلسلة معقدة من التغييرات داخل الخلية ، بما في ذلك تحريض تخليق عدد من السيتوكينات والإنزيمات المحددة ، ويعطل تخليق الحمض النووي الريبي الفيروسي والبروتينات الفيروسية في الخلية. خلية. نتيجة هذه التغييرات هي نشاط مضاد للفيروسات ومضاد للتكاثر غير محدد مرتبط بمنع تكاثر الفيروس في الخلية ، وتثبيط تكاثر الخلايا وتأثير مضاد للفيروسات. يحفز Interferon alpha-2b عملية عرض المستضد للخلايا ذات الكفاءة المناعية ، ولديه القدرة على تحفيز النشاط البلعمي للخلايا الضامة ، فضلاً عن النشاط السام للخلايا للخلايا التائية و "القتلة الطبيعية" المشاركة في المناعة المضادة للفيروسات.
يمنع تكاثر الخلايا وخاصة الخلايا السرطانية. له تأثير محبط على تخليق بعض الجينات المسرطنة ، مما يؤدي إلى تثبيط نمو الورم.
الدوائية
مص
مع s / c أو / m من interferon alfa-2b ، فإن التوافر البيولوجي له يتراوح من 80٪ إلى 100٪. بعد إدخال الإنترفيرون alpha-2b T max في البلازما 4-12 ساعة ، T 1/2 - 2-6 ساعات .16-24 ساعة بعد الإعطاء ، لا يتم الكشف عن الإنترفيرون المؤتلف في مصل الدم.
الاسْتِقْلاب
يتم التمثيل الغذائي في الكبد.
ألفا إنترفيرون قادرة على تعطيل عمليات التمثيل الغذائي التأكسدي ، مما يقلل من نشاط إنزيمات الكبد الميكروسومي لنظام السيتوكروم P450.
تربية
تفرز بشكل رئيسي عن طريق الكلى الترشيح الكبيبي.
مؤشرات لاستخدام الدواء
كجزء من العلاج المعقد عند البالغين:
- في التهاب الكبد الفيروسي ب المزمن بدون علامات تليف الكبد.
- في التهاب الكبد الفيروسي سي المزمن في غياب أعراض فشل الكبد (العلاج الأحادي أو العلاج المركب مع ريبافيرين) ؛
- مع ورم حليمي في الحنجرة.
- مع الثآليل التناسلية.
- مع ابيضاض الدم مشعر الخلايا ، اللوكيميا النخاعية المزمنة ، سرطان الغدد الليمفاوية اللاهودجكين ، الورم الميلانيني ، الورم النقوي المتعدد ، ساركوما كابوزي على خلفية الإيدز ، سرطان الكلى التدريجي.
نظام الجرعات
تطبيق s / c و / m و / في. يجب أن يبدأ العلاج من قبل الطبيب. علاوة على ذلك ، بإذن من الطبيب ، يمكن للمريض إعطاء جرعة صيانة لنفسه (في الحالات التي يتم فيها وصف الدواء s / c أو / m).
التهاب الكبد المزمن ب:يتم إعطاء Altevir ® s / c أو / m بجرعة 5-10 مليون وحدة دولية 3 مرات في الأسبوع لمدة 16-24 أسبوعًا. يتم إيقاف العلاج بعد 3-4 أشهر من الاستخدام في حالة عدم وجود ديناميكيات إيجابية (وفقًا لدراسة الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد B).
التهاب الكبد المزمن C:يتم إعطاء Altevir ® s / c أو / m بجرعة 3 ملايين وحدة دولية 3 مرات في الأسبوع لمدة 24-48 أسبوعًا. في المرضى الذين يعانون من مسار الانتكاس للمرض والمرضى الذين لم يتلقوا علاجًا سابقًا مع مضاد للفيروسات ألفا -2 ب ، تزداد فعالية العلاج مع العلاج المركب مع ريبافيرين. مدة العلاج المركب 24 أسبوعًا على الأقل. يجب إجراء علاج Altevir لمدة 48 أسبوعًا في المرضى الذين يعانون من التهاب الكبد المزمن C والنمط الجيني الأول للفيروس مع حمولة فيروسية عالية ، حيث لا يتم اكتشاف RNA لفيروس التهاب الكبد C في نهاية الأسابيع الـ 24 الأولى من العلاج. مصل الدم.
الورم الحليمي في الحنجرة:يتم حقن Altevir ® s / c بجرعة 3 ملايين وحدة دولية / م 2 3 مرات في الأسبوع. يبدأ العلاج بعد الاستئصال الجراحي (أو بالليزر) لنسيج الورم. يتم اختيار الجرعة مع مراعاة تحمل الدواء. قد يتطلب تحقيق استجابة إيجابية علاجًا لمدة 6 أشهر.
ابيضاض الدم مشعر الخلايا:الجرعة الموصى بها من Altevir للإعطاء تحت الجلد في المرضى الذين يعانون من استئصال الطحال أو بدونه هي 2 مليون وحدة دولية / م 2 3 مرات في الأسبوع. في معظم الحالات ، يحدث تطبيع واحد أو أكثر من المعلمات الدموية بعد 1-2 أشهر من العلاج ، ومن الممكن زيادة مدة العلاج حتى 6 أشهر. يجب اتباع نظام الجرعات هذا باستمرار ما لم يكن هناك تطور سريع للمرض أو أعراض عدم تحمل شديد للدواء.
سرطان الدم النخاعي المزمن:الجرعة الموصى بها من Altevir كعلاج أحادي هي 4-5 مليون وحدة دولية / م 2 في اليوم ق / م. للحفاظ على عدد الكريات البيض ، قد يكون من الضروري استخدام جرعة من 0.5-10 مليون وحدة دولية / م 2. إذا كان العلاج يمكن أن يحقق السيطرة على عدد الكريات البيض ، ثم للحفاظ على مغفرة الدم ، يجب استخدام الدواء بالجرعة القصوى المسموح بها (4-10 مليون وحدة دولية / م 2 يوميًا). يجب إيقاف الدواء بعد 8-12 أسبوعًا إذا لم يؤد العلاج إلى مغفرة جزئية للدم أو انخفاض مهم سريريًا في عدد الكريات البيض.
غير هودجكن ليمفوما ل:يستخدم Altevir ® كعلاج مساعد بالاشتراك مع أنظمة العلاج الكيميائي القياسية. يتم إعطاء الدواء بجرعة 5 ملايين وحدة دولية / م 2 3 مرات في الأسبوع لمدة 2-3 أشهر. يجب تعديل الجرعة حسب تحمل الدواء.
سرطان الجلد:يستخدم Altevir ® كعلاج مساعد عند البالغين المعرضين لخطر تكرار الإصابة بعد إزالة الورم. يتم إعطاء Altevir ® عن طريق الوريد بجرعة 15 مليون وحدة دولية / م 2 5 مرات في الأسبوع لمدة 4 أسابيع ، ثم يتم إعطاء جرعة من 10 مليون وحدة دولية / م 2 3 مرات في الأسبوع لمدة 48 أسبوعًا. يجب تعديل الجرعة حسب تحمل الدواء.
ورم نقيي متعدد: Altevir ® يوصف خلال فترة تحقيق مغفرة ثابتة بجرعة 3 مليون وحدة دولية / م 2 3 مرات في الأسبوع ق / ج.
ساركوما كابوسي على خلفية الإيدز:لم يتم تحديد الجرعة المثلى. يمكن استخدام الدواء بجرعات من 10-12 مليون وحدة دولية / م 2 / يوم ق / ج أو / م. في حالة استقرار المرض أو الاستجابة للعلاج ، يستمر العلاج حتى يتراجع الورم أو يلزم انسحاب الدواء.
سرطان الكلى:لم يتم تحديد الجرعة والنظام الأمثل. يوصى باستخدام الدواء بجرعات من 3 إلى 10 مليون وحدة دولية / م 2 3 مرات في الأسبوع.
تحضير محلول للإعطاء عن طريق الوريد
يتم جمع حجم محلول Altevira اللازم لتحضير الجرعة المطلوبة ، ويضاف إلى 100 مل من محلول كلوريد الصوديوم المعقم 0.9٪ وتدار على مدى 20 دقيقة.
أثر جانبي
ردود الفعل العامة:في كثير من الأحيان - الحمى والضعف (إنها تفاعلات تعتمد على الجرعة وقابلة للعكس ، وتختفي في غضون 72 ساعة بعد توقف العلاج أو إنهائه) ، قشعريرة ؛ أقل في كثير من الأحيان - الشعور بالضيق.
من جانب الجهاز العصبي المركزي:غالباً - صداع؛ أقل في كثير من الأحيان - الوهن والنعاس والدوخة والتهيج والأرق والاكتئاب والأفكار والمحاولات الانتحارية ؛ نادرا - العصبية والقلق.
من الجانب الجهاز العضلي الهيكلي: في كثير من الأحيان - ألم عضلي. أقل في كثير من الأحيان - ألم مفصلي.
من الجهاز الهضمي:في كثير من الأحيان - فقدان الشهية والغثيان. في كثير من الأحيان - القيء والإسهال وجفاف الفم وتغيير الذوق ؛ نادرا - آلام في البطن وعسر الهضم. ربما زيادة عكسية في إنزيمات الكبد.
من الجانب من نظام القلب والأوعية الدموية: في كثير من الأحيان - انخفاض في ضغط الدم. نادرا - عدم انتظام دقات القلب.
ردود الفعل الجلدية:في كثير من الأحيان - تساقط الشعر ، زيادة التعرق؛ نادرًا - الطفح الجلدي، حكة في الجلد.
من نظام المكونة للدم: قلة الكريات البيض القابلة للعكس ، قلة المحببات ، انخفاض مستويات الهيموغلوبين ، قلة الصفيحات.
آحرون:نادرا - فقدان الوزن ، التهاب الغدة الدرقية المناعي الذاتي.
موانع لاستخدام الدواء
- ثقيل أمراض القلب والأوعية الدمويةالتاريخ (قصور القلب المزمن غير المنضبط ، احتشاء عضلة القلب الأخير ، الاضطرابات الشديدة معدل ضربات القلب);
- الفشل الكلوي و / أو الكبدي الحاد (بما في ذلك تلك الناجمة عن وجود النقائل) ؛
- الصرع ، وكذلك الاضطرابات الشديدة في الجهاز العصبي المركزي ، وخاصة التي يتم التعبير عنها بالاكتئاب والأفكار والمحاولات الانتحارية (بما في ذلك التاريخ) ؛
- التهاب الكبد المزمن مع تليف الكبد اللا تعويضي وفي المرضى الذين يتلقون أو عولجوا مؤخرًا بمثبطات المناعة (باستثناء دورة علاج قصيرة الأمد كاملة بالكورتيكوستيرويدات) ؛
- التهاب الكبد المناعي الذاتي أو أمراض المناعة الذاتية الأخرى ؛
- العلاج بمثبطات المناعة بعد الزرع ؛
- أمراض الغدة الدرقية التي لا يمكن السيطرة عليها بالطرق العلاجية التقليدية ؛
- أمراض الرئة اللا تعويضية (بما في ذلك مرض الانسداد الرئوي المزمن) ؛
- لا تعويضي السكري;
- فرط التخثر (بما في ذلك التهاب الوريد الخثاري ، الجلطات الدموية الشريان الرئوي);
- كبت نقي حاد.
- حمل؛
- فترة الرضاعة (الرضاعة الطبيعية) ؛
— فرط الحساسيةلمكونات الدواء.
استخدام الدواء أثناء الحمل والرضاعة
الدواء هو بطلان أثناء الحمل والرضاعة (الرضاعة الطبيعية).
تطبيق لانتهاكات وظائف الكبد
تطبيق لانتهاكات وظائف الكلى
لا يستعمل الدواء في حالة القصور الكلوي و / أو الكبدي الحاد (بما في ذلك تلك الناجمة عن وجود النقائل).
تعليمات خاصة
قبل العلاج مع Altevir لالتهاب الكبد الفيروسي B و C المزمن ، يوصى بأخذ خزعة من الكبد لتقييم درجة تلف الكبد (علامات النشاط النشط) العملية الالتهابيةو / أو تليف). تزداد فعالية علاج التهاب الكبد C المزمن مع العلاج المركب مع Altavir و ribavirin. استخدام Altevira غير فعال في تطوير تليف الكبد اللا تعويضي أو الغيبوبة الكبدية.
في حالة حدوثها آثار جانبيةأثناء العلاج مع Altevir ، يجب تقليل جرعة الدواء بنسبة 50٪ أو يجب إيقاف الدواء مؤقتًا حتى تختفي. إذا استمرت الآثار الجانبية أو عاودت الظهور بعد تقليل الجرعة ، أو لوحظ تطور المرض ، فيجب وقف العلاج باستخدام Altevir.
إذا كان مستوى الصفائح الدموية أقل من 50 × 10 9 / لتر أو كان مستوى الخلايا الحبيبية أقل من 0.75 × 10 9 / لتر ، فمن المستحسن تقليل جرعة Altevir مرتين مع فحص الدم بعد أسبوع واحد. إذا استمرت هذه التغييرات ، يجب إيقاف الدواء.
إذا كان مستوى الصفائح الدموية أقل من 25 × 10 9 / لتر أو كان مستوى الخلايا الحبيبية أقل من 0.5 × 10 9 / لتر ، فمن المستحسن إلغاء عقار Altevir ® مع فحص الدم بعد أسبوع واحد.
في المرضى الذين يتلقون مستحضرات interferon alfa-2b ، يمكن الكشف عن الأجسام المضادة في مصل الدم التي تحيد نشاطها المضاد للفيروسات. في جميع الحالات تقريبًا ، يكون عيار الأجسام المضادة منخفضًا ، ولا يؤدي ظهورها إلى انخفاض في فعالية العلاج أو حدوث اضطرابات المناعة الذاتية الأخرى.
جرعة مفرطة
لا يتم توفير بيانات عن جرعة زائدة من عقار Altevir ®.
تفاعل الدواء
التفاعلات الدوائية بين التيفير والآخرين الأدويةلم يتم استكشافها بالكامل. يجب استخدام Altevir ® بحذر في وقت واحد مع المنومات والمهدئات والمسكنات المخدرة والأدوية التي لها تأثير محتمل على اكتئاب النخاع.
مع التعيين المتزامن لـ Altevir و theophylline ، يجب مراقبة تركيز الأخير في مصل الدم ، وإذا لزم الأمر ، يجب تغيير نظام الجرعات.
عند استخدام Altevir مع أدوية العلاج الكيميائي (سيتارابين ، سيكلوفوسفاميد ، دوكسوروبيسين ، تينيبوسيد) ، يزداد خطر حدوث تأثيرات سامة.
شروط الاستغناء عن الصيدليات
يُصرف الدواء بوصفة طبية.
شروط وأحكام التخزين
يجب تخزين الدواء بعيدًا عن متناول الأطفال ، وفقًا للمواصفة SP 3.3.2-1248-03 عند درجة حرارة تتراوح من 2 إلى 8 درجات مئوية ؛ لا تجمد. تاريخ انتهاء الصلاحية - 18 شهرًا.
النقل في درجات حرارة من 2 درجة مئوية إلى 8 درجات مئوية ؛ لا تجمد.
"يتعلق الاختراع بالهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية والطب والصيدلة. جديد مؤتلف متعدد النسخ DNA البلازميد pSX50 يشفر تخليق كريات الدم البيضاء البشرية interferon alpha-2b ، والتي يكون التعبير عنها تحت سيطرة محفزات اللاكتوز والتربتوفان وقاطع النسخ. نتيجة لتحول خلايا السلالة المتلقية E. coli BL21 مع DNA البلازميد المؤتلف pSX50 ، تم الحصول على سلالة E. coli SX50 - منتج للكريات البيض البشرية المؤتلفة interferon alpha-2b مع إنتاجية تصل إلى 0.9-1.0 غرام من مضاد للفيروسات ألفا -2 ب لكل 1 لتر من وسط الثقافة. تعتمد طريقة الحصول على إنترفيرون ألفا -2 ب المؤتلف على استخدام السلالة المؤتلفة المكونة من الإشريكية القولونية SX50 وتتضمن زراعتها بعمق على وسط مغذٍ مع محتوى منخفض من التربتوفان مع الإضافة المستمرة لركائز المغذيات أثناء التخليق الحيوي والتدمير الميكانيكي لـ خلايا الكائنات الحية الدقيقة عند ضغط عالٍ ، انحلال البروتين المتجمع في محلول مركّز من هيدروكلوريد الغوانيدين متبوعًا بإعادة تشبع الإنترفيرون في المحاليل الفسيولوجية في وجود عوامل تشوتروبيك وتنقيته باستخدام تنقية كروماتوغرافية ثلاثية المراحل للإنترفيرون على راتنجات مثل Chelating Sepharose تدفق سريع مع أيونات النحاس +2 ، كروماتوغرافيا التبادل الأيوني على راتنجات التبادل الأيوني مثل SM Sephsrose Fast Flow وكروماتوجرافيا الترشيح الهلامي على راتنجات من نوع Superdex 75. نعم عند تلطيخ المواد الهلامية بالفضة وأكثر من 98٪ وفقًا لـ RF HPLC وخالي من البيروجين (اختبار LAL) بكميات لا تقل عن 400-800 مجم لكل 1 لتر من وسط المزرعة. 3 ن. و 3 zp f-ly ، 6 مريض.
رسومات لبراءة الاختراع RF 2242516
يتعلق الاختراع بالأدوية المعدلة وراثيًا التي تم الحصول عليها بوسائل التكنولوجيا الحيوية ، وبشكل خاص طرق الإنتاج الصناعي لكريات الدم البيضاء البشرية المؤتلفة interferon alpha-2b. الغرض الطبي(يشار إليها فيما بعد باسم الإنترفيرون) ، وكذلك السلالات المؤتلفة التي تنتج الإشريكية القولونية (E. coli) والبلازميد DNA الذي يشفر تخليق الإنترفيرون.
الإنترفيرون عبارة عن جزيئات بروتينية يتراوح وزنها الجزيئي من 15000 إلى 21000 دالتون تنتجها الخلايا وتفرزها استجابةً لعدوى فيروسية أو مسببات الأمراض الأخرى. هناك ثلاث مجموعات رئيسية من الإنترفيرون: ألفا وبيتا وجاما. هذه المجموعات في حد ذاتها ليست متجانسة وقد تحتوي على عدة أنواع جزيئية مختلفة من الإنترفيرون. لذلك ، تم تحديد أكثر من 14 نوعًا وراثيًا من الإنترفيرون ألفا ، وهي ذات أهمية وتجد تطبيق واسعفي الطب كعوامل مضادة للفيروسات ومضادات التكاثر والمناعة.
الطرق المعروفة لإنتاج إنترفيرون الكريات البيض البشرية من كريات الدم البيضاء البشرية التي تسببها الفيروسات والمحفزات الأخرى (SU1713591 ، RU 2066188 ، RU 2080873).
العيب الرئيسي لهذه الطرق للحصول على الإنترفيرون هو احتمال التلوث المنتج النهائيفيروسات بشرية ، مثل فيروس التهاب الكبد B و C ، وفيروس نقص المناعة ، إلخ.
في الوقت الحاضر ، يتم التعرف على طريقة الحصول على الإنترفيرون عن طريق التوليف الميكروبيولوجي على أنها واعدة أكثر ، مما يجعل من الممكن الحصول على المنتج المستهدف بعائد أعلى بكثير من مادة خام غير مكلفة نسبيًا. تجعل الأساليب المستخدمة في هذه الحالة من الممكن إنشاء متغيرات من الجين الهيكلي الأمثل للتعبير البكتيري ، بالإضافة إلى العناصر التنظيمية التي تتحكم في تعبيرها.
يتم استخدام تصميمات مختلفة من سلالات Pichia pastoris و Pseudomonas putida و Escherichia coli ككائنات دقيقة أولية.
مساوئ استخدام P. pastoris كمنتج للإنترفيرون (J.N. Garcia، J. ) ، هي ظروف صعبة للغاية لتخمير هذا النوع من الخميرة ، والحاجة إلى الحفاظ الصارم على تركيز المحرِّض ، ولا سيما الميثانول ، في عملية التخليق الحيوي. عيوب استخدام سلالات Ps. بوتيدا (SU1364343 ، SU1640996 ، SU1591484 ، RU1616143 ، RU2142508) هو تعقيد عملية التخمير عند مستوى منخفض من التعبير (10 ملغ من الإنترفيرون لكل 1 لتر من وسط المزرعة). الأكثر إنتاجية هو استخدام سلالات الإشريكية القولونية (Semin. Oncol. ، 1997 ، يونيو ؛ 24 (3 ملحق 9): S9-41-S9-51).
معروف عدد كبير منسلالات الإشريكية القولونية المعبرة عن الإنترفيرون: سلالات الإشريكية القولونية ATCC 31633 و 31644 بالبلازميدات Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 أو Z-pBR 322 (Pstl) / HclN SN 35-AHL6 (SU 1764515) ، سلالة E. coli pINF-AP2 (SU 1312961) ، سلالة E. coli pINF-F-Pa (AU 1312962) ، سلالة E. coli SG 20050 مع البلازميد p280 / 21FN (Kravchenko V.V. et al. Bioorganic chemistry، 1987، v. 13 ، رقم 9 ، ص 1186-1193) ، سلالة E.Coli SG 20050 مع بلازميد pINF14 (SU 1703691) ، سلالة E.coli SG 20050 مع بلازميد pINF16 (RU 2054041) ، إلخ. السلالات هي عدم استقرارها ، وكذلك مستوى غير كاف من التعبير عن الإنترفيرون.
إلى جانب خصائص السلالات المستخدمة ، تعتمد كفاءة العملية إلى حد كبير على التقنية المستخدمة لعزل وتنقية الإنترفيرون.
طريقة معروفة لإنتاج الإنترفيرون ، والتي تشمل زراعة الخلايا Ps. putida ، تدمير الكتلة الحيوية ، معالجة البولي إيثيلين أمين ، تجزئة كبريتات الأمونيوم ، كروماتوغرافيا كارهة للماء على فينيل سيلوكروم C-80 ، تجزئة الأس الهيدروجيني لليسات ، تركيزها وترشيحها ، كروماتوجرافيا التبادل الأيوني على السليلوز DE-52 ، شطف تدرج الأس الهيدروجيني ، كروماتوجرافيا التبادل الأيوني الناتج شطف على CM cellulose -52 ، التركيز بالمرور عبر كاسيت مرشح وترشيح هلام على Sephadex G-100 (SU 1640996). عيب هذه الطريقة ، بالإضافة إلى التخمير المعقد متعدد المراحل ، هو العملية متعددة المراحل للحصول على المنتج النهائي.
هناك أيضًا طريقة معروفة لإنتاج الإنترفيرون ، والتي تتضمن زراعة سلالة E.coli SG 20050 / pIF16 في مرق LB في قوارير في شاكر حراري ، والطرد المركزي للكتلة الحيوية ، وغسلها بمحلول عازل ، والصوتنة لتدمير الخلايا. يتم طرد المحلول الناتج عن طريق الطرد المركزي ، وغسله بـ 3 أمتار من اليوريا في المخزن المؤقت ، ثم يتم إذابته في كلوريد الجوانيدين في المخزن المؤقت ، وتكسير الكبريتيك المؤكسد ، والطرد المركزي ، والتحليل الكبريتي المؤكسد ، وغسيل الكلى مقابل 8 أمتار من اليوريا ، وإعادة التشبع ، وكروماتوجرافيا مرحلتين أخيرة على السليلوز CM-52 و Sephadex G -50 (RU 2054041). من عيوب هذه الطريقة انخفاض إنتاجيتها نسبيًا للمراحل الرئيسية لعملية العزل والتنقية. على وجه الخصوص ، ينطبق هذا على المعالجة بالموجات فوق الصوتية للمنتج ، وغسيل الكلى وانحلال الكبريت التأكسدي ، مما يؤدي إلى عدم الاستقرار في إطلاق الإنترفيرون ، فضلاً عن استحالة استخدام هذه الطريقة من أجل الإنتاج الصناعيمضاد للفيروسات.
كأقرب نظير (نموذج أولي) ، يمكن الإشارة إلى طريقة للحصول على إنترفيرون كريات الدم البيضاء البشرية ، والتي تتمثل في زراعة سلالة E. coli المؤتلفة ، وتجميد الكتلة الحيوية الناتجة عند درجة حرارة لا تتجاوز -70 درجة مئوية ، والذوبان ، وتدمير خلايا الكائنات الحية الدقيقة باستخدام الليزوزيم ، وإزالة الحمض النووي والحمض النووي الريبي عن طريق إدخال محللة الدناز وتنقية الشكل المعزول غير القابل للذوبان من الإنترفيرون عن طريق الغسل بمحلول عازل مع المنظفات ، وحل راسب الإنترفيرون في محلول من هيدروكلوريد الجوانيدين ، وإعادة التشبع والتنقية بمرحلة واحدة بواسطة الأيونات - تبادل الكروماتوغرافيا. كمنتج ، يتم استخدام سلالة E. coli SS5 التي تم الحصول عليها باستخدام بلازميد pSS5 مؤتلف يحتوي على ثلاثة محفزات: P lac و P t7 و P trp وجين ألفا إنترفيرون مع بدائل نيوكليوتيد مقدمة.
يتم التحكم في تعبير الانترفيرون بواسطة سلالة E. coli SS5 المحتوية على هذا البلازميد بواسطة ثلاثة محفزات: P lac و P t7 و P trp. يبلغ مستوى التعبير عن الإنترفيرون حوالي 800 مجم لكل 1 لتر من المعلق الخلوي (RU 2165455).
عيب هذه الطريقة هو انخفاض قابلية التصنيع لاستخدام التدمير الأنزيمي للخلايا والحمض النووي والحمض النووي الريبي للكائنات الحية الدقيقة والتنقية الكروماتوجرافية أحادية المرحلة للإنترفيرون. يؤدي هذا إلى عدم استقرار عملية عزل الإنترفيرون ، ويؤدي إلى انخفاض في جودته ويحد من إمكانية استخدام المخطط أعلاه للإنتاج الصناعي للإنترفيرون. عيوب هذا البلازميد والجهد الذي يعتمد عليه هو الاستخدام في البلازميد لمحفز T7 قوي غير منظم في سلالة E. coli BL21 (DE3) ، حيث يكون جين بوليميريز T7 RNA تحت محفز lac operon والذي دائما "يتدفق". وبالتالي ، يحدث تخليق الإنترفيرون بشكل مستمر في الخلية ، مما يؤدي إلى تفكك البلازميد وتقليل قابلية خلايا السلالة للحياة ، ونتيجة لذلك ، انخفاض في إنتاج الإنترفيرون.
الهدف من هذا الاختراع هو بناء سلالة صناعية مؤتلفة من منتج الإشريكية القولونية باستخدام DNA البلازميد المؤتلف الجديد بمستوى عالٍ من التخليق الحيوي للإنترفيرون ، وتطوير تقنية صناعية فعالة للحصول على مادة الإنترفيرون للأغراض الطبية ، المقابلة في الجودة إلى "دستور الأدوية الأوروبي" لمادة مضاد للفيروسات ألفا -2 ب.
تم حل هذه المشكلة عن طريق تكوين DNA البلازميد المؤتلف pSX50 وسلالة Escherichia coli SX50 ، المودعة في مجموعة All-Russian من السلالات الصناعية لشركة Federal State Unitary Enterprise GosNII Genetics ، رقم VKPM V-8550 ،
بالإضافة إلى طريقة للحصول على إنترفيرون ألفا -2 ب المؤتلف بناءً على استخدام سلالة الإشريكية القولونية SX50 المؤتلفة وتتضمن زراعتها بعمق على وسط مغذي مع محتوى منخفض من التربتوفان مع الإضافة المستمرة لركائز المغذيات أثناء التخليق الحيوي والتدمير الميكانيكي من خلايا الكائنات الحية الدقيقة عند ضغط عالٍ ، انحلال البروتين المتجمع في محلول مركّز من هيدروكلوريد الغوانيدين متبوعًا بإعادة تأهيل الإنترفيرون في المحاليل الفسيولوجية في وجود عوامل تشوتروبيك وتنقية كروماتوغرافية ثلاثية المراحل للإنترفيرون على الراتنجات مثل Chelating Sepharose Fast Flow ، مثبتة بأيونات النحاس +2 ، كروماتوجرافيا التبادل الأيوني على راتنجات التبادل الأيوني مثل CM Sepharose Fast Flow وكروماتوجرافيا الترشيح الهلامي على راتنجات مثل Superdex 75.
وفقًا للاختراع ، يُقترح DNA pSX50 متعدد النسخ جديد للبلازميد ، يشفر تخليق كريات الدم البيضاء البشرية interferon alpha-2b ، والتي يكون التعبير عنها تحت سيطرة محفزات اللاكتوز والتريبتوفان ومُنهي النسخ. يحتوي Plasmid pSX50 على 3218 زوجًا أساسيًا (bp) ويتميز بوجود الأجزاء التالية:
يتضمن التسلسل من 1 نيوكليوتيد إلى 176 نيوكليوتيد (ن) جزء من الحمض النووي 176 زوج قاعدي يحتوي على محفز التربتوفان (P trp) ؛
تسلسل من 177 م حتى 194 م يشتمل على جزء DNA اصطناعي من 18 نقطة أساس تحتوي على تسلسل Shine Delgarno المسؤول عن بدء الترجمة ؛
تسلسل من 195 م بحلول عام 695 م يشتمل على جزء DNA 501 bp يحتوي على تسلسل جين الإنترفيرون مع بدائل النوكليوتيدات التالية: في الموضع 37 ، يتم استبدال A بـ C ؛ في الموضع 39 ، يتم استبدال G بـ T ؛ في الموضع 40 ، يتم استبدال A بـ C ؛ وفي الموضع 42 ، G يتم استبدالها بـ T ، في الموضع 67 تغيير A إلى C ، في الموضع 69 ، تغيير G إلى T ، في الموضع 70 تغيير A إلى C ، في الموضع 72 تغيير A إلى T ، في الموضع 96 تغيير G إلى A ، في الموضع تغيير 100 من A إلى C ، في الموضع 102 ، قم بتغيير A إلى T ، في الموضع 114 ، قم بتغيير A إلى C ، في الموضع 120 ، قم بتغيير C إلى G ، عند الموضع 126 ، قم بتغيير G إلى A ، عند الموضع 129 ، قم بتغيير G إلى A ، عند الموضع 330 تغيير C إلى G ، عند تغيير الموضع 339 من G إلى A ، عند تغيير الموضع 342 من G إلى A ، عند تغيير موضع 487 من A إلى C ، عند تغيير موضع 489 من A إلى T ، عند تغيير موضع 495 من G إلى A ؛
تسلسل من 696 م بحلول عام 713 م يشتمل على جزء DNA اصطناعي من 18 زوج قاعدي يحتوي على مادة ربط متعددة صناعية ؛
التسلسل من 714 م حتى عام 1138 م يتضمن جزء DNA من البلازميد pKK223-3 مع 4129 b.p. حتى عام 4553 م 425 نقطة أساس في الحجم ، تحتوي على تسلسل فاصل النسخ الصارم rrnBT 1 T 2 ؛
تسلسل من 1139 م حتى عام 1229 م يتضمن جزء DNA من البلازميد pUC19 من 2487 سنة مضت. حتى عام 2577 م حجم 91 ص. O. ، تحتوي على محفز لجين β-lactomase (جين مقاومة الأمبيسلين - Amp R) ؛
تسلسل من 1230 م حتى 2045 م يشتمل على جزء من الحمض النووي للبلازميد pUC4K مع 720 نقطة في البوصة. حتى عام 1535 م 816 نقطة أساس في الحجم ، تحتوي على المنطقة الهيكلية لجين كان ؛
تسلسل من عام 2046 م حتى عام 3218 م يتضمن جزء DNA من البلازميد pUC19 من 1625 إلى 453 برميلًا في البوصة. حجم 1173 BP ، يحتوي على التسلسل المسؤول عن تكرار البلازميد (ORI) ومروج lac (P lac).
توضح الأشكال 1-5 مخططات البناء والخريطة المادية للبلازميد pSX50.
يوضح الشكل 6 تسلسل النوكليوتيدات الكامل الذي تم إنشاؤه للبلازميد pSX50.
تم الحصول على سلالة Escherichia coli SX50 عن طريق تحويل خلايا Escherichia coli BL21 باستخدام البلازميد pSX50 باستخدام الطريقة التقليدية. تكنولوجيا الهندسة الوراثية. تتميز سلالة E.Coli SX50 بالميزات التالية.
السمات الثقافية والصرفية
الخلايا صغيرة ، مستقيمة ، سميكة على شكل قضيب ، سالبة الجرام ، غير حاملة للأبواغ. تنمو الخلايا بشكل جيد على وسائط مغذية بسيطة. عند النمو على أجار ديفكو ، تتشكل مستعمرات مستديرة ، ناعمة ، محدبة ، غائمة ، لامعة ، رمادية ، بحواف ناعمة. عندما تنمو في وسط سائل (في وسط ضئيل مع الجلوكوز أو في مرق LB) ، فإنها تشكل ضبابًا شديدًا.
السمات الفيزيائية البيولوجية
ايروب. نطاق درجة حرارة النمو هو 4-42 درجة مئوية عند درجة الحموضة المثلى 6.5-7.5.
تستخدم كمصدر للنيتروجين املاح معدنيةفي أشكال الأمونيوم والنترات ، و مركبات العضويةمثل الأحماض الأمينية ، الببتون ، التربتون ، مستخلص الخميرة ، إلخ.
تستخدم الأحماض الأمينية والجلسرين والكربوهيدرات كمصدر للكربون. مقاومة المضادات الحيوية. تظهر الخلايا مقاومة للكاناميسين (حتى 100 ميكروغرام / مل).
سلالة Escherichia coli 8X50 هي منتج مضاد للفيروسات.
طريقة وشروط وتكوين الوسيط لتخزين الانفعال
في L-arape مع إضافة كاناميسين إلى تركيز 20 ميكروغرام / مل تحت الزيت ، في مرق L يحتوي على 15٪ جلسرين ومضادات حيوية مناسبة في أمبولات عند درجة حرارة 70 درجة مئوية تحت الصفر ، في حالة مجففة بالتجميد في أمبولات عند درجة حرارة درجة حرارة زائد 4 درجات مئوية.
تم تحديد سلالة Escherichia coli SX50 بواسطة Bergi's Key (1974) باعتبارها سلالة من نوع Escherichia coli.
طريقة الإنتاج الصناعي لـ alpha-2b interferon
تتمثل إحدى ميزات الطريقة المقترحة في تطوير تقنية تسمح لك بعزل الإنترفيرون عن شكل غير قابل للذوبان يتراكم أثناء التخمير ، مما قد يبسط بشكل كبير المخطط التكنولوجي لعملية العزل ويزيد من إنتاج المنتج المستهدف.
تتكون الطريقة من زراعة سلالة Escherichia coli SX50 في وسط مغذي ، مع الإضافة المستمرة لركائز المغذيات ، ويفضل مستخلص الجلوكوز والخميرة ، أثناء التخليق الحيوي ، ويفضل مع محتوى التربتوفان المنخفض ، والتدمير الميكانيكي لخلايا الكائنات الحية الدقيقة عند ضغط عالٍ 700 -900 بار ، إذابة الإنترفيرون في محلول غوانيدين هيدروكلوريد العازلة ، إعادة تشبع الإنترفيرون في المحاليل الفسيولوجية العازلة في وجود عوامل تشوتروبيك ، تليها تنقية كروماتوجرافية ثلاثية المراحل للإنترفيرون على الراتنجات مثل Chelating Sepharose Fast Flow المثبت مع Cu +2 الأيونات ، كروماتوغرافيا التبادل الأيوني على راتنجات التبادل الأيوني مثل CM Sepharose Fast Flow وكروماتوجرافيا الترشيح الهلامي على الراتنجات مثل Superdex 75.
الشروط المثلى لتنفيذ المراحل الفردية للحصول على مضاد للفيروسات هي كما يلي:
يتم التخمير مع الإضافة المستمرة للركائز طوال العملية ، مما يؤدي إلى مستوى عالٍ من التعبير عن الإنترفيرون ؛
يتم تدمير الخلايا في جهاز تفكيك من نوع Gaulin عند ضغط 900 بار ؛
تتم إزالة المكونات الخلوية القابلة للذوبان (الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، والبروتينات ، وعديدات السكاريد الدهنية ، وما إلى ذلك) عن طريق غسل الشكل غير القابل للذوبان من الإنترفيرون بمحاليل عازلة تحتوي على المنظفات (Triton XI00 ، واليوريا ، إلخ) ؛
يتم إذابة الراسب الناتج المحتوي على الإنترفيرون في محلول منظم من 6 م جوانيدين هيدروكلوريد ؛
يتم إجراء إعادة تشبع الإنترفيرون في محلول عازل فسيولوجي يحتوي على عوامل تشوتروبيك ؛
يتم إجراء تنقية كروماتوجرافية من ثلاث خطوات للإنترفيرون على Chelating Sepharose Fast Flow المثبت مع أيونات النحاس +2 ، على راتنج التبادل الكاتيوني CM Sepharose Fast Flow وكروماتوجرافيا الترشيح الهلامي على نوع الراتنج Superdex 75 ؛
بعد كل تنقية كروماتوغرافية ، يتم إجراء ترشيح التعقيم من خلال مرشحات خالية من البيروجين بحجم مسام يبلغ 0.22 ميكرومتر.
ناتج الإنترفيرون نتيجة لتطبيق الطريقة الموصوفة هو حوالي 400-800 مجم من الإنترفيرون مع 1 لتر من وسط المزرعة. تتوافق جودة المنتج الناتج مع معايير ومتطلبات "دستور الأدوية الأوروبي" لمادة alpha-2b interferon.
الاختلافات الهامة بين الطريقة المقترحة والنموذج الأولي هي:
استخدام تصميم سلالة مع إنتاجية أعلى ، مما يجعل من الممكن الحصول على كمية أكبر من الإنترفيرون من لتر واحد من وسط الاستزراع أثناء التخليق الحيوي ؛
استخدام التدمير الميكانيكي الفعال للكتلة الحيوية الخلوية ، مما يجعل من الممكن الحصول على خلاصة أنقى للشكل غير القابل للذوبان من مضاد للفيروسات لمزيد من وقت قصير، مع خسارة أقل ؛
إن استخدام المحاليل الفسيولوجية العازلة أثناء إعادة التشبع في وجود عوامل متقلبة يجعل من الممكن زيادة محصول الشكل المعاد تنظيمه بشكل صحيح من الإنترفيرون ؛
تتيح التنقية الكروماتوغرافية ثلاثية المراحل للإنترفيرون الحصول على مادة إنترفيرون بدرجة نقاء تزيد عن 99٪ وفقًا للرحلان الكهربي في ظروف الاختزال وعدم الاختزال عندما تكون المواد الهلامية ملطخة بالفضة وأكثر من 98٪ وفقًا لـ RF HPLC وخالية عمليًا من البيروجينات (اختبار LAL).
توضح الأمثلة التالية جوهر ومزايا مجموعة الاختراعات المطالب بها.
مثال 1: بناء البلازميد المؤتلف pSX50
تتضمن طريقة تكوين pSX50 البلازميد الخطوات التالية:
بناء ناقل بلازميد pSX10 ؛
1. بناء البلازميد pSX3 (2641 نقطة أساس)
2. بناء ناقل البلازميد pSX10 (2553 نقطة أساس)
بناء البلازميد المؤتلف pSX41 (3218 نقطة أساس) ؛
بناء البلازميد المؤتلف pSX43 (3218 نقطة أساس) ؛
بناء البلازميد المؤتلف pSX45 (3218 نقطة أساس) ؛
بناء البلازميد المؤتلف pSX50 (3218 نقطة أساس).
بناء ناقل البلازميد pSX10
البلازميد المتجه pSX10 هو ناقل pUC19 حيث يتم استبدال تسلسل ترميز الجين بيتا لاكتاماز المقاوم للأمبيسيلين بتسلسل ترميز الجين kan ويحتوي على فاصل النسخ من البلازميد pKK223-3.
يتم تنفيذ بناء ناقل البلازميد pSS10 على مرحلتين:
الحصول على البلازميد pSX3 (2641 ص. O.) ، الذي يمثل البلازميد pUC19 ، حيث يتم استبدال منطقة الترميز الخاصة بجين الأمبير بمنطقة الترميز الخاصة بجين كان ؛
الحصول على ناقل بلازميد pSX10 (2553 نقطة أساس) ، وهو بلازميد pSX3 ، حيث يتم إدخال جزء DNA الذي يشفر فاصل النسخ ggBT 1 T 2 خلف موقع BamHI.
للحصول على البلازميد pSX3 ، يتم إجراء خمس جولات من تضخيم الحمض النووي بواسطة PCR (البوليميراز تفاعل تسلسلي). خلال الجولة الأولى ، باستخدام DNA البلازميد pUC19 كقالب ، يتم إجراء تضخيم لجزء DNA 1828 bp. (جزء PU1-PU2) باستخدام مواد أولية:
يتم تنفيذ تفاعلات PCR هذه والتفاعلات اللاحقة في ظل الظروف التالية: 20 ملي مولار Tis-HCl ، درجة الحموضة 8.8 ، 10 ملي مولار (NH 4) 2 SO 4 ، 10 ملي مول كلوريد ، 2 تي إم MgCl 2 ، 0.1٪ تريتون X100 ، 0.1 مجم / مل BSA ، 0.2 مم من كل dNTP ، 1.25 ش بوليميريز الحمض النووي Pfu ، 100 نانوغرام من الحمض النووي. تتكون عملية التضخيم من المراحل التالية: التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 35 دورة PCR (30 ثانية 95 درجة مئوية ، 30 ثانية 56 درجة مئوية ، دقيقتان 72 درجة مئوية) والحضانة لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. بعد التضخيم (وبعد التضخيم اللاحق) ، يتم تنقية جزء الحمض النووي كهربائيا على هلام الاغاروز 1٪. خلال الجولتين الثانية والثالثة ، باستخدام DNA البلازميد pUC4K كقالب ، يتم إجراء تضخيم لجزء DNA 555 نقطة أساس. (جزء KM1-KM2) باستخدام الاشعال:
وتضخيم جزء من الحمض النووي 258 نقطة أساس. (KMZ-KM4) مع الاشعال
في الجولة الخامسة من PCR ، يتم دمج الأجزاء (PU1-PU2) و (KM1-KM4) في الظروف التالية: التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 5 دورات PCR (30 ثانية 95 درجة مئوية ، 30 ثانية 56 درجة C ، 10 دقيقة 72 درجة مئوية) وحضانة لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. يتم تحويل الحمض النووي الذي تم الحصول عليه بعد PCR الأخير مباشرة إلى خلايا E. coli DH5 ويطلى على وسط LA يحتوي على 20 ميكروغرام / مل كانامايسين. بعد الحضانة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية ، يتم التخلص من الحيوانات المستنسخة ، وعزل DNA البلازميد ويتم إجراء تحليل التقييد. نتيجة لذلك ، يتم الحصول على بلازميد pSX3 2641 نقطة أساس.
للحصول على ناقل البلازميد pSX10 ، تم إجراء ثلاث جولات من تضخيم الحمض النووي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. خلال الجولة الأولى ، باستخدام DNA البلازميد pSX3 كقالب ، يتم إجراء تضخيم لجزء DNA 2025 نقطة أساس. (الجزء 10.1-10.2) باستخدام البادئات:
خلال الجولة الثانية ، باستخدام الحمض النووي للبلازميد pKK223-3 كقالب ، يتم إجراء تضخيم لجزء DNA 528 زوج قاعدي. (جزء KK1-KK2) باستخدام البادئات:
في الجولة الثالثة من PCR ، يتم دمج الأجزاء (10.1-10.2) و (KK1-KK2) في الظروف التالية: التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 5 دورات PCR (30 ثانية 95 درجة مئوية ، 30 ثانية 56 درجة مئوية) ، 10 دقيقة 72 درجة مئوية) وحضانة لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. يتم تحويل الحمض النووي الذي تم الحصول عليه بعد PCR الأخير مباشرة إلى خلايا E. coli DH5 ويطلى على وسط LA يحتوي على 20 ميكروغرام / مل كانامايسين. بعد الحضانة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية ، يتم التخلص من الحيوانات المستنسخة ، وعزل DNA البلازميد ويتم إجراء تحليل التقييد. والنتيجة هي بلازميد 2553 bp pSX10.
بناء البلازميد المؤتلف pSX41
البلازميد المؤتلف pSX41 عبارة عن جزء Hind III - BamHI DNA من ناقل البلازميد pSX3 (2529 نقطة أساس) ، جزء Hind III - EcoRI DNA من 168 نقطة أساس لترميز محفز تشغيل E. coli tryptophan (P trp) ، EcoRI-XbaI a 20 نقطة أساس جزء DNA اصطناعي يشفر تسلسل SD (Shine-Delgarno) ؛ وجزء 501 bp XbaI-BamHI DNA يشفر جين إنترفيرون ألفا 2 ب البشري.
للحصول على جزء Hind III - VamHI DNA من ناقل pSX3 (2529 نقطة أساس) DNA لبلازميد pSX3 يتم معالجته بأنزيمات تقييدية HindIII و BamHI متبوعة بالتنقية الكهربية في هلام الاغاروز بنسبة 1٪. تم الحصول على جزء Hind III EcoRI DNA من 168 نقطة أساس لترميز مروج أوبرون التربتوفان (P trp) بواسطة PCR باستخدام إجمالي E. coli DNA كقالب وبادئات TRP1 و PRP2 ، متبوعة بمعالجة الجزء المضخم مع تقييد Hindlll و EcoRI الانزيمات:
للحصول على EcoRI-Xbal ، جزء من الحمض النووي الاصطناعي 20 نقطة أساس لترميز تسلسل SD (Shine-Delgarno) ، يتم تصنيع قليل النوكليوتيدات التكميلية التالية:
يتم الحصول على جزء DNA 501 bp XbaI-BamIII الذي يشفر جين interferon alpha 2b البشري بواسطة PCR باستخدام الحمض النووي البشري الكلي كقالب و IFN1 و IFN2 ، متبوعًا بمعالجة الجزء المضخم باستخدام إنزيمات تقييد Xbal و BamIII:
بعد ذلك ، يتم دمج الأجزاء المنقاة كهربيًا ، وربطها مع إنزيم T4 فجاز ligase ، ويتحول الحمض النووي إلى خلايا E. coli DH5 ويطلى على وسط LA يحتوي على 20 ميكروغرام / مل كانامايسين. بعد الحضانة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية ، يتم التخلص من الحيوانات المستنسخة ، وعزل DNA البلازميد ، ويتم إجراء تحليل التقييد ، ويتم تحديد الهيكل الأساسي للحمض النووي. والنتيجة هي بلازميد pSX41 3218 نقطة أساس. بعد ذلك ، يتم إجراء الطفرات التدريجية لجين الإنترفيرون لزيادة مستوى التعبير عن المنتج المستهدف. تتكون الطفرات في جين الإنترفيرون من استبدال ثلاثة توائم نادرًا ما توجد في الإشريكية القولونية ، مع ترميز الأحماض الأمينية المقابلة ، مع وجود ثلاثة توائم بشكل متكرر في الإشريكية القولونية ، مشفرةً نفس الأحماض الأمينية. يتم إجراء طفرات الحمض النووي لجين الإنترفيرون بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل.
بناء البلازميد المؤتلف pSX43
للحصول على البلازميد المؤتلف pSX43 ، يتم إجراء جولة واحدة من تضخيم الحمض النووي بواسطة PCR ، باستخدام الحمض النووي للبلازميد pSX41 كقالب وبادئات IFN3 و IFN4:
يتم تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل في الظروف التالية: التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 20 دورة PCR (30 ثانية 95 درجة مئوية ، 30 ثانية 56 درجة مئوية ، 10 دقيقة 72 درجة مئوية) والحضانة لمدة 20 دقيقة عند 72 درجة مئوية. يتم تحويل الحمض النووي الذي تم الحصول عليه بعد PCR مباشرة إلى خلايا E. coli DH5 ويطلى على وسط LA يحتوي على 20 ميكروغرام / مل كانامايسين. بعد الحضانة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية ، يتم التخلص من الحيوانات المستنسخة ، وعزل DNA البلازميد ، ويتم إجراء تحليل التقييد ، ويتم تحديد الهيكل الأساسي للحمض النووي. نتيجة لذلك ، يتم الحصول على بلازميد 3218 نقطة أساس pSX43.
بناء البلازميد المؤتلف pSX45
للحصول على البلازميد المؤتلف pSX45 ، يتم إجراء جولة واحدة من تضخيم الحمض النووي بواسطة PCR باستخدام DNA البلازميد pSX43 كقالب وبادئات IFN5 و IFN6:
يتم تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل في الظروف التالية: التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 20 دورة PCR (30 ثانية 95 درجة مئوية ، 30 ثانية 56 درجة مئوية ، 10 دقيقة 72 درجة مئوية) والحضانة لمدة 20 دقيقة عند 72 درجة مئوية. يتم تحويل الحمض النووي الذي تم الحصول عليه بعد PCR مباشرة إلى خلايا E. coli DH5 ويطلى على وسط LA يحتوي على 20 ميكروغرام / مل كانامايسين. بعد الحضانة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية ، يتم التخلص من الحيوانات المستنسخة ، وعزل DNA البلازميد ، ويتم إجراء تحليل التقييد ، ويتم تحديد الهيكل الأساسي للحمض النووي. والنتيجة هي بلازميد pSX45 3218 نقطة أساس.
بناء البلازميد المؤتلف pSX50.
للحصول على البلازميد المؤتلف pSX50 ، يتم إجراء جولة واحدة من تضخيم الحمض النووي بواسطة PCR باستخدام DNA البلازميد pSX45 كقالب وبادئات IFN7 و IFN8:
يتم تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل في الظروف التالية: التسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 20 دورة PCR (30 ثانية 95 درجة مئوية ، 30 ثانية 56 درجة مئوية ، 10 دقيقة 72 درجة مئوية) والحضانة لمدة 20 دقيقة عند 72 درجة مئوية. يتم تحويل الحمض النووي الذي تم الحصول عليه بعد PCR مباشرة إلى خلايا E. coli DH5 ويطلى على وسط LA يحتوي على 20 ميكروغرام / مل كانامايسين. بعد الحضانة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية ، يتم التخلص من الحيوانات المستنسخة ، وعزل DNA البلازميد ، ويتم إجراء تحليل التقييد ، ويتم تحديد الهيكل الأساسي للحمض النووي. والنتيجة هي بلازميد pSX50 3218 نقطة أساس.
مثال 2. الحصول على سلالة من الإشريكية القولونية SX50 - منتج للإنترفيرون
يتم الحصول على سلالة E. coli SX50 المنتجة للإنترفيرون عن طريق تحويل خلايا سلالة E. coli BL21 مع بلازميد pSX50 المؤتلف. تزرع السلالة المنتجة للإنترفيرون في مخمر سعة 30 لترًا إلى كثافة بصرية تتراوح من 25.0 إلى 30.0 درجة مئوية. في وسط M9 يحتوي على 1٪ هيدروليسات حمض الكازين (ديفكو) ، 1٪ جلوكوز ، 40 ميكروغرام / مل كانامايسين ، عند درجة حرارة 38-39 درجة مئوية. أثناء عملية التخمير ، يتم إجراء إضافة مستمرة لركيزة المغذيات باستخدام جهاز التحكم في الجاذبية.
مثال 3 طريقة لعزل الإنترفيرون من سلالة الإشريكية القولونية SX50
تم الحصول على الإنترفيرون على 4 مراحل:
المرحلة 1. زراعة سلالة الإشريكية القولونية SX50.
المرحلة الثانية. عزل وتنقية الشكل غير القابل للذوبان من مضاد للفيروسات.
المرحلة 3. انحلال وإعادة تكوين الإنترفيرون.
المرحلة الرابعة. التنقية الكروماتوجرافية للإنترفيرون.
المرحلة 1. زراعة سلالة الإشريكية القولونية SX50
يتم إدخال اللقاح المزروع لسلالة الإشريكية القولونية SX50 بحجم 3 لترات من وسط LB الغني لمدة 12 ساعة عند 26 درجة مئوية في مخمر يحتوي على 27 لترًا من وسط معقم يحتوي على M9 ، 1 ٪ هيدروليسات حمض الكازين ، 1 ٪ جلوكوز ، 1 مم MgCl 2 ، 0.1 ملي كلوريد الكالسيوم 2 ، 40 مجم / مل كاناميسين. تتم الزراعة في مخمر عند درجة حرارة 38-39 درجة مئوية ، مع الحفاظ على درجة حموضة 7 ± 0.15 عن طريق المعايرة التلقائية باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم بنسبة 40٪. يتم الحفاظ على تركيز الأكسجين المذاب في النطاق (50 ± 10)٪ من التشبع عن طريق تغيير سرعة المحرك من 100 إلى 800 دورة في الدقيقة وإمداد الهواء من 1 إلى 15 لتر / دقيقة. يتم قياس تركيز الركائز ، خاصة الجلوكوز وخلاصة الخميرة ، أثناء التخمير ويتم الحفاظ على تركيزها عن طريق تغيير معدل تغذية المحاليل المركزة من خلال المضخات التمعجية باستخدام جهاز التحكم في الجاذبية.
تتم مراقبة تراكم الإنترفيرون في شكل غير قابل للذوبان باستخدام الفحص المجهري الطوري ، والرحلان الكهربي في هلام بولي أكريلاميد بنسبة 15٪ (SDS-PAAG) وكروماتوجرافيا الطور العكسي عالي الأداء (RF HPLC). يتوقف التخمير عند الوصول إلى أقصى كثافة بصرية (~ 25-30 وحدة دولية) وإيقاف تخليق الإنترفيرون. في نهاية التخمير ، يتم فصل سائل المزرعة عن طريق الطرد المركزي في دوار التدفق بسرعة دوران من 5000-10000 دورة في الدقيقة. يتم تعبئة الكتلة الحيوية في أكياس بلاستيكية ومجمدة عند درجة حرارة 70 مئوية تحت الصفر.
المرحلة الثانية. عزل وتنقية الشكل غير القابل للذوبان من مضاد للفيروسات
300-400 جم من الكتلة الحيوية المجمدة للإشريكية القولونية SX50 معلقة في المخزن المؤقت سعة 3000 مل (20 ملي مولار من حمض الهيدروكلوريك ، درجة الحموضة 8.0 ، 10 ملي مولار EDTA ، 0.1٪ تريتون X100). يتم تمرير المعلق من خلال مجانس تدفق من نوع Gaulin ، ويتم الحفاظ عليه عند 900 بار ويتم طرده بالطرد المركزي في دوار التدفق عند 15000 دورة في الدقيقة. يتم غسل الراسب الذي تم الحصول عليه على التوالي في ظل ظروف مماثلة مع المخازن المؤقتة 2 (20 مم Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 ، و 1 مم EDTA ، و 3 M يوريا) والمخزن المؤقت 3 (20 مم Tris-HCl pH 8.0 ، 1 مم EDTA) وأخيراً الإنترفيرون يتم تعليق الراسب في 200 مل من المخزن المؤقت 3. وقت عزل وتنقية الشكل غير القابل للذوبان من مضاد للفيروسات لا يزيد عن 5 ساعات.
المرحلة 3. انحلال وإعادة تكوين الإنترفيرون
يضاف هيدروكلوريد الغوانيدين الجاف إلى تعليق الشكل غير القابل للذوبان من الإنترفيرون الذي تم الحصول عليه في المرحلة السابقة لتركيز 6 م ، يضاف ديثيوثريتول إلى تركيز 50 ملي مولار ، تريس- حمض الهيدروكلوريك 8.0 إلى تركيز 50 ملي مولار ، كلوريد الصوديوم إلى تركيز 150 ملي مولار و Triton X100 بتركيز 0.1٪ ، محتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين ، يتم فصل المواد غير المذابة عن طريق الترشيح المعقم من خلال أغشية ذات أقطار مسامية تبلغ 0.22 ميكرون.
يتم إجراء إعادة التشبع بالإنترفيرون عن طريق تخفيف المحلول الناتج ببطء 100-200 مرة باستخدام المخزن المؤقت 4 (20 مللي مولار من Tris-HCl pH 8.0 ، 100 مللي مولار كلوريد الصوديوم ، 0.1 مللي مولار EDTA). بعد ذلك ، يتم تحضين خليط إعادة التكوين مع التحريك المستمر لمدة 12-15 ساعة عند درجة حرارة 4-8 درجة مئوية. بعد ذلك ، تضاف كبريتات المغنيسيوم إلى تركيز 1 مم وتتم إزالة المادة المجمعة عن طريق تعقيم الترشيح من خلال مرشح غشائي بقطر مسامي يبلغ 0.22 ميكرون.
المرحلة الرابعة. التنقية الكروماتوجرافية للإنترفيرون
يتم إجراء التنقية الكروماتوجرافية للإنترفيرون على ثلاث مراحل.
1. يتم أولاً تنقية الإنترفيرون الناتج عن طريق كروماتوجرافيا التقارب على راتينج Sepharose Fast Flow resin (Amersham Biosciences) المثبت بأيونات النحاس +2. للقيام بذلك ، يتم تطبيق محلول الإنترفيرون على عمود به Cu +2 Chelating Sepharose Fast Flow ويتم التصفية من interferon بمخزن مؤقت 0.1 M من حامض الستريك pH 2.2.
2. في المرحلة الثانية من التنقية الكروماتوغرافية ، يتم تطبيق محلول الإنترفيرون على راتنج التبادل الكاتيوني سريع التدفق من سيفاروز CM (Amersham Biosciences) ويتم التصفية الإنترفيرون بتدرج المحاليل (0.0-0.5 M NaCl) في 50 ملي مولار Na (CH 3 COO) عازلة ، درجة الحموضة 5.5.
3. يتم تنقية الشكل الأحادي للإنترفيرون من بقايا الأشكال البوليمرية للإنترفيرون في المرحلة الثالثة من تنقية الإنترفيرون بالترشيح الهلامي على راتنج من نوع Superdex 75 (Amersham Biosciences). يتم إجراء الفصل الكروماتوجرافي في محلول مؤقت سعة 50 ملي مولار Na (CH 3 COO) ، ودرجة الحموضة 5.0 ، تحتوي على 0.15 M NaCl.
الطريقة الموصوفة لعزل وتنقية الإنترفيرون تجعل من الممكن الحصول على 4-8 جرام من الإنترفيرون عالي النقاء في دورة واحدة من العزل لمدة 7-10 أيام من الكتلة الحيوية التي تم الحصول عليها من 10 لترات من وسط المزرعة. تتوافق جودة الانترفيرون الناتج تمامًا مع متطلبات "دستور الأدوية الأوروبي" لمادة مضاد للفيروسات ألفا -2 ب ، وهي:
تركيز الإنترفيرون لا يقل عن 2 × 10 8 IU / ml ؛
لا يقل النشاط المحدد للإنترفيرون عن 2.0 × 10 8 IU / mg ؛
النقاوة الكهربي للدواء لا تقل عن 99 ٪ في ظل ظروف الاختزال وعدم الاختزال عندما تكون المواد الهلامية ملطخة بالفضة ؛
تقع النقطة المتساوية الكهربية للإنترفيرون المعزول في منطقة الأس الهيدروجيني 5.8-6.3 ؛
لا تختلف خريطة الببتيد الخاصة بالإنترفيرون المعزول اختلافًا جوهريًا عن خريطة الببتيد الخاصة بالمعيار الأوروبي للإنترفيرون ألفا 2b CRS ؛
على النحو التالي من الأمثلة المذكورة أعلاه ، فإن مجموعة الاختراعات المطالب بها تجعل من الممكن الحصول على مضاد للفيروسات alpha-2b مع إنتاجية عالية باستخدام تقنية بسيطة وموثوقة نسبيًا.
مطالبة
1. DNA البلازميد المؤتلف pSX50 الذي يشفر تخليق الانترفيرون البشري المؤتلف alpha-2b ، ويتميز بأنه يحتوي على حجم 3218 زوجًا قاعديًا (bp) ويتكون من الأجزاء التالية: التسلسل من 1 إلى 176 نيوكليوتيدات (n) يتضمن a جزء 176 زوجًا أساسًا من الحمض النووي يحتوي على محفز التربتوفان (P trp) ، تسلسل من 177 إلى 194 زوجًا أساسًا. يشتمل على جزء DNA اصطناعي من 18 نقطة أساس ، يحتوي على تسلسل Shine Delgarno المسؤول عن بدء الترجمة ، التسلسل من 195 إلى 695 زوجًا أساسًا. يتضمن جزءًا من الحمض النووي 501 زوجًا أساسًا يحتوي على جين الإنترفيرون ألفا -2 ب مع بدائل النيوكليوتيدات: 37 (A> C) ، 39 (G> T) ، 40 (A> C) ، 42 (G> T) ، 67 (A> C) ) ، 69 (G> T) ، 70 (A> C) ، 72 (A> T) ، 96 (G> A) ، 100 (A> C) ، 102 (A> T) ، 114 (A> C) ، 120 (C> G) ، 126 (G> A) ، 129 (G> A) ، 330 (C> G) ، 339 (G> A) ، 342 (G> A) ، 487 (A> C) ، 489 (A> T) ، 495 (G> A) ، التسلسل 696 إلى 713 bp. يشتمل على جزء DNA اصطناعي من 18 نقطة أساس تحتوي على بوليلينر صناعي ، تسلسل من 714 إلى 1138 نقطة أساس. يتضمن جزء DNA من البلازميد pKK223-3 من 4129 إلى 4553 بي بي. حجم 425 نقطة أساس ، يحتوي على تسلسل فاصل النسخ الصارم rrnBT 1 T 2 ، التسلسل من 1139 إلى 1229 نقطة أساس. يشتمل على جزء DNA من بلازميد pUC19 من 2487 إلى 2577 برميلًا في البوصة. 91 نقطة أساس في الحجم ، تحتوي على محفز الجين β-lactomase (جين مقاومة الأمبيسلين -Amp R) ، تسلسل من 1230 إلى 2045 نقطة أساس. يشتمل على جزء من الحمض النووي للبلازميد pUC4K مع 720 نقطة في البوصة. حتى عام 1535 م حجم 816 نقطة أساس ، يحتوي على المنطقة الهيكلية لجين كان ، تسلسل من 2046 نقطة أساس. حتى عام 3218 م يتضمن جزء DNA من البلازميد pUC19 من 1625 إلى 453 برميلًا في البوصة. حجم 1173 BP ، يحتوي على التسلسل المسؤول عن تكرار البلازميد (ORI) ومروج lac (P lac).
2. السلالة البكتيرية Eschcerichia coli SX50 المحولة بالبلازميد المؤتلف وفقًا للمطالبة 1 هي منتج للكريات البيض البشرية المؤتلفة interferon alpha-2b.
3. طريقة لإنتاج الإنترفيرون البشري ألفا -2 ب ، والتي تتضمن زراعة سلالة Escherichia coli SX5 وفقًا للمطالبة 2 في وسط مغذي مع إضافة ثابتة لركائز المغذيات أثناء التخليق الحيوي ، والتدمير الميكانيكي لخلايا الكائنات الحية الدقيقة عند ضغط 700-900 بار ، إذابة الإنترفيرون في محلول منظم من غوانيدين هيدروكلوريد ، إعادة تشبع الإنترفيرون في المحاليل الفسيولوجية العازلة في وجود عوامل تشوتروبيك ، تنقية كروماتوجرافية ثلاثية المراحل للإنترفيرون على الراتنجات مثل Chelating Sepharose Fast Flow المثبت مع أيونات Cu +2 ، كروماتوجرافيا التبادل الأيوني على راتنجات التبادل الأيوني مثل CM Sepharose Fast Flow وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم على راتنجات مثل Superdex 75.
4. الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 3 ، والتي يتم فيها إجراء الزراعة على وسط غذائي يحتوي على محتوى منخفض من التربتوفان مع الإضافة المستمرة لركائز المغذيات ، ويفضل مستخلص الجلوكوز والخميرة.
5. الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 3 ، والتي يتم فيها ، قبل إذابة الإنترفيرون ، تنقيته عن طريق إزالة المكونات الخلوية القابلة للذوبان ، بما في ذلك الحمض النووي ، والحمض النووي الريبي ، والبروتينات ، وعديدات السكاريد الدهنية ، والغسيل بمحاليل عازلة تحتوي على منظفات مثل Triton XI 00 ، اليوريا.
6. الطريقة وفقًا لعنصر الحماية 3 ، والتي يتم فيها تنفيذ ترشيح التعقيم بعد كل تنقية كروماتوجرافية من خلال مرشحات بحجم مسام يبلغ 0.22 ميكرومتر.
يقدم هذا القسم تعليمات لاستخدام الإنترفيرون ألفا 2 ب وألفا 2 أالجيل الأول ، والذي يُطلق عليه أيضًا اسم خطي أو بسيط أو قصير العمر. الميزة الوحيدة لهذه الاستعدادات هي السعر المنخفض نسبيًا.
في عام 1943 ، اكتشف و. وج. هيل ما يسمى بظاهرة التداخل. كان المفهوم الأولي للإنترفيرون على النحو التالي: عامل يمنع تكاثر الفيروسات. في عام 1957 ، ذكر العالم الإنجليزي أليك إيزاك والباحث السويسري جين ليندنمان هذا العامل ووصفه بوضوح وأطلق عليه اسم الإنترفيرون.
الإنترفيرون (IFN) هو جزيء بروتين ينتج في جسم الإنسان. يتم ترميز "وصفة" تركيبه (جين الإنترفيرون) في الجهاز الوراثي البشري. الإنترفيرون هو أحد السيتوكينات ، الذي يشير إلى الجزيئات التي تلعب دور مهمفي عمل جهاز المناعة.
على مدى نصف القرن الماضي منذ اكتشاف IFN ، تمت دراسة العشرات من خصائص هذا البروتين. من وجهة نظر طبية ، أهمها وظائف مضادة للفيروسات والأورام.
ينتج جسم الإنسان حوالي 20 نوعًا - عائلة كاملة - من الإنترفيرون. IFN ينقسم إلى نوعين: الأول والثاني.
النوع الأول IFN - alpha و beta و omega و theta - يتم إنتاجه وإفرازه بواسطة معظم خلايا الجسم استجابةً لعمل الفيروسات وبعض العوامل الأخرى. يشتمل النوع الثاني من الإنترفيرون على جاما الإنترفيرون ، الذي تنتجه خلايا الجهاز المناعي استجابةً لعمل العوامل الأجنبية.
في البداية ، تم الحصول على مستحضرات مضاد للفيروسات فقط من خلايا دم المتبرع ؛ تم تسميتهم هكذا: الإنترفيرون الكريات البيض. في عام 1980 ، بدأ عصر الإنترفيرون المؤتلف أو المعدل وراثيًا. أصبح إنتاج الأدوية المؤتلفة أرخص بكثير من الحصول على عقاقير مماثلة من دم الإنسان المتبرع به أو من مواد خام بيولوجية أخرى ؛ لا يستخدم إنتاجها الدم المتبرع به ، والذي يمكن أن يكون مصدرًا للعدوى. لا تحتوي العقاقير المؤتلفة على شوائب أجنبية وبالتالي لها آثار جانبية أقل. إمكاناتهم العلاجية أعلى من تلك الموجودة في المستحضرات الطبيعية المماثلة.
لعلاج الأمراض الفيروسية ، ولا سيما التهاب الكبد C ، يستخدم الإنترفيرون ألفا (IFN-α) في الغالب. يميز بين interferons alpha 2b و alpha 2a و pegylated "البسيط" ("قصير العمر") (peginterferon alfa-2a و peginterferon alfa-2b). لا يتم استخدام الإنترفيرون "البسيط" عمليًا في الاتحاد الأوروبي والولايات المتحدة الأمريكية ، ولكن في بلدنا ، نظرًا لرخصتها النسبية ، يتم استخدامها كثيرًا. في علاج التهاب الكبد C ، يتم استخدام كلا الشكلين من IFN-α "القصير": interferon alfa-2a و interferon alfa-2b (اللذان يختلفان في حمض أميني واحد). عادة ما يتم إجراء الحقن مع الإنترفيرون البسيط كل يوم (مع بيغينتيرفيرون - مرة واحدة في الأسبوع). فعالية العلاج مع IFNs قصيرة العمر عندما تدار كل يوم أقل من مع peginterferons. يوصي بعض الخبراء بحقن يومية من الإنترفيرون "البسيط" لأن فعالية الترجمة السمعية البصرية أعلى إلى حد ما.
نطاق IFN "القصير" واسع جدًا. يتم إنتاجها من قبل جهات تصنيع مختلفة تحت أسماء مختلفة: Roferon-A و Intron A و Laferon و Reaferon-EC و Realdiron و Eberon و Interal و Altevir و Alfarona وغيرها.
الأكثر دراسة (على التوالي ، باهظة الثمن) هي Roferon-A و Intron-A. فعالية العلاج مع هذه IFN بالاشتراك مع الريبافيرين ، اعتمادًا على النمط الجيني للفيروس وعوامل أخرى ، تتراوح من 30 ٪ إلى 60 ٪. ترد قائمة بالعلامات التجارية الرئيسية لمصنعي الإنترفيرون البسيط ووصفها في الجدول.
يجب تخزين جميع الإنترفيرون في الثلاجة (+2 إلى +8 درجة مئوية). يجب عدم تسخينها أو تجميدها. لا تهز أو تعرض الدواء لأشعة الشمس المباشرة. من الضروري نقل الأدوية في حاويات خاصة.
تم الحصول على Interferon alfa-2b من استنساخ Escherichia coli عن طريق تهجين البلازميدات البكتيرية مع جين الكريات البيض البشرية ، والذي يشفر تخليق الإنترفيرون. يتفاعل الدواء على سطح الخلية مع مستقبلات محددة ، ويبدأ سلسلة معقدة من التغييرات داخل الخلية ، والتي تشمل تحريض تكوين بعض الإنزيمات والسيتوكينات المحددة ، وتعطل تكوين الحمض النووي الريبي والبروتينات داخل خلايا الفيروس. نتيجة لهذه التغييرات ، يظهر نشاط مضاد للتكاثر وغير محدد مضاد للفيروسات ، والذي يرتبط بتباطؤ في تكاثر الخلايا ، ومنع تكاثر الفيروس داخل الخلية ، والتأثير المناعي للإنترفيرون.
يحفز Interferon alpha-2b النشاط البلعمي للبلاعم ، وعملية تقديم المستضد إلى الخلايا ذات الكفاءة المناعية ، وكذلك النشاط السام للخلايا للخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا التائية التي تشارك في الاستجابة المضادة للفيروسات. يمنع الدواء تكاثر الخلايا ، وخاصة الخلايا السرطانية. له تأثير مثبط على تكوين بعض الجينات المسرطنة التي تؤدي إلى تثبيط نمو الورم. عند تناوله تحت الجلد أو عضليًا ، يكون التوافر البيولوجي للدواء 80-100 ٪. يتم الوصول إلى أقصى تركيز في الدم بعد 4-12 ساعة ، ونصف العمر هو 2-6 ساعات. تفرز بشكل رئيسي عن طريق الترشيح الكبيبي عن طريق الكلى. بعد 16-24 ساعة من تناول الدواء ، لا يتم تحديد الدواء في بلازما الدم. يتم استقلابه في الكبد.
دواعي الإستعمال
عن طريق الوريد أو العضل أو تحت الجلد:كجزء من العلاج المعقد عند البالغين: التهاب الكبد الفيروسي المزمن بدون علامات فشل الكبد ؛ التهاب الكبد الفيروسي ب المزمن بدون علامات تليف الكبد. الثآليل التناسلية ، ورم حليمي في الحنجرة. سرطان الدم النخاعي المزمن؛ ابيضاض الدم مشعر الخلايا. غير هودجكن ليمفوما ل؛ ورم نقيي متعدد؛ سرطان الكلى التدريجي سرطان الجلد؛ ساركوما كابوزي المرتبطة بالإيدز.
محلي:الآفات الفيروسية للأغشية المخاطية والجلد توطين مختلف؛ علاج السارس والانفلونزا. الوقاية والعلاج المعقد لتضيق التهاب الحنجرة والقصبات الهوائية المتكرر ؛ العلاج المعقد لتفاقم العدوى المزمنة المتكررة والحادة من الهربس للأغشية المخاطية والجلد ، بما في ذلك أشكال الجهاز البولي التناسلي ؛ العلاج المعقد لالتهاب عنق الرحم الهربسي.
التحاميل كجزء من العلاج المعقد:الالتهاب الرئوي (الفيروسي ، الجرثومي ، الكلاميديا) ؛ السارس ، بما في ذلك الأنفلونزا ، بما في ذلك تلك التي تعقدها عدوى بكتيرية ؛ علم الأمراض المعدية والتهابات الأطفال حديثي الولادة ، بما في ذلك الأطفال الخدج: تعفن الدم والتهاب السحايا (الفيروسي والبكتيري) ، عدوى داخل الرحم(القوباء ، الكلاميديا ، عدوى الفيروس المضخم للخلايا ، داء المبيضات ، بما في ذلك الحشوية ، عدوى الفيروس المعوي، الميكوبلازما) ؛ علم الأمراض المعدية والتهابات الجهاز البولي التناسلي (عدوى الفيروس المضخم للخلايا ، الكلاميديا ، ureaplasmosis ، داء غاردنريلس ، داء المشعرات ، عدوى فيروس الورم الحليمي ، داء المبيضات المهبلي المتكرر ، التهاب المهبل الجرثومي ، داء المفطورة) ؛ التهاب الكبد الفيروسي المزمن B ، C ، D ، بما في ذلك بالاشتراك مع استخدام امتصاص الدم وفصل البلازما في الحالات المزمنة التهاب الكبد الفيروسينشاط واضح ، معقد بسبب تليف الكبد ؛ عدوى عقبولية متكررة أو أولية للأغشية المخاطية والجلد ، خفيفة إلى معتدلة الدورة ، شكل موضعي ، بما في ذلك الشكل البولي التناسلي.
طريقة تطبيق مضاد للفيروسات ألفا 2 ب والجرعة
يُعطى مضاد للفيروسات ألفا -2 ب عن طريق الحقن العضلي ، الوريدي ، تحت الجلد. تستخدم في شكل شموع. يطبق موضعياً على شكل جل ، مرهم ، قطرات ، رذاذ. يتم تحديد طريقة الإدارة والجرعة ونظام العلاج اعتمادًا على المؤشرات ، بشكل فردي.
في المرضى الذين يعانون من أمراض الجهاز القلبي الوعائي ، قد يحدث عدم انتظام ضربات القلب عند استخدام interferon alfa-2b. إذا لم ينقص عدم انتظام ضربات القلب أو يزيد ، فيجب تقليل الجرعة مرتين أو التوقف عن العلاج. عند استخدام interferon alfa-2b ، من الضروري مراقبة الحالة العقلية والعصبية. مع تثبيط قوي لتكوين الدم في نخاع العظم ، من الضروري إجراء دراسة منتظمة لتكوين الدم المحيطي. يحفز إنترفيرون ألفا 2 ب الجهاز المناعيلذلك ، يجب استخدامه بحذر عند المرضى المعرضين لأمراض المناعة الذاتية ، بسبب زيادة مخاطر تفاعلات المناعة الذاتية. في المرضى الذين يتلقون مستحضرات interferon alfa-2b ، يمكن الكشف عن الأجسام المضادة في بلازما الدم التي تحيد النشاط المضاد للفيروسات interferon alfa-2b. دائمًا ما يكون عيار الأجسام المضادة منخفضًا ، ولا يؤدي ظهورها إلى انخفاض فعالية العلاج أو تطور اضطرابات المناعة الذاتية الأخرى.
موانع للاستخدام
فرط الحساسية ، تاريخ من أمراض خطيرة في الجهاز القلبي الوعائي (احتشاء عضلة القلب مؤخرًا ، قصور القلب المزمن غير المنضبط ، عدم انتظام ضربات القلب الملحوظ) ، الكبد و / أو فشل كلويوالصرع و / وغيرها من الاضطرابات الشديدة في الجهاز المركزي الجهاز العصبي، تتجلى بشكل خاص من خلال الأفكار والمحاولات الانتحارية ، والاكتئاب (بما في ذلك التاريخ) ، والتهاب الكبد المناعي الذاتي وأمراض المناعة الذاتية الأخرى ، وكذلك استخدام الأدوية المثبطة للمناعة بعد الزرع ، والتهاب الكبد المزمن مع تليف الكبد اللا تعويضي وفي المرضى أثناء أو بعد العلاج السابق مع مثبطات المناعة (باستثناء الحالات بعد الانتهاء من العلاج قصير الأمد بالستيرويدات القشرية السكرية) ، وأمراض الغدة الدرقية التي لا يمكن السيطرة عليها بالطرق الطبية التقليدية ، وداء السكري المعرض للحماض الكيتوني ، وأمراض الرئة اللا تعويضية (بما في ذلك المزمن مرض الانسدادالرئتين) ، فرط التخثر (بما في ذلك الانسداد الرئوي ، التهاب الوريد الخثاري) ، كبت نقي حاد ، فترة الرضاعة الطبيعية ، الحمل.
قيود التطبيق
انتهاكات تكوين الدم في نخاع العظام ، وظائف الكلى ، الكبد.
استخدم أثناء الحمل والرضاعة
الاستخدام الجهازي للإنترفيرون ألفا 2 ب هو بطلان أثناء الحمل والرضاعة. الاستخدام الموضعي ممكن فقط وفقًا للإشارات وفقط بعد استشارة الطبيب.
الآثار الجانبية للإنترفيرون ألفا 2 ب
باعراض تشبه اعراض الانفلونزا:قشعريرة ، حمى ، ألم في المفاصل ، عظام ، عيون ، صداع ، ألم عضلي ، دوار ، تعرق متزايد.
الجهاز الهضمي:فقدان الشهية ، الغثيان ، الإسهال ، القيء ، الإمساك ، جفاف الفم ، اضطراب الذوق ، ألم خفيف في البطن ، فقدان الوزن ، تغيرات في الحالة الوظيفية للكبد.
الجهاز العصبي:دوخة ، اضطراب النوم ، تدهور عقلي ، ضعف الذاكرة ، عصبية ، قلق ، عدوانية ، اكتئاب ، نشوة ، تنمل ، رعشة ، اعتلال عصبي ، نعاس ، ميول انتحارية ؛
نظام القلب والأوعية الدموية:عدم انتظام دقات القلب ، ارتفاع ضغط الدم الشرياني أو انخفاض ضغط الدم ، عدم انتظام ضربات القلب ، أمراض القلب التاجية ، اضطرابات الجهاز القلبي الوعائي ، احتشاء عضلة القلب.
الجهاز التنفسي:السعال وآلام في الصدر وضيق طفيف في التنفس وذمة رئوية والالتهاب الرئوي.
نظام المكونة للدم:قلة الكريات البيض ، قلة الكريات البيض ، قلة الصفيحات.
ردود فعل الجلد:الثعلبة والطفح الجلدي والحكة. أخرى: تصلب العضلات ، ردود الفعل التحسسية، تكوين الأجسام المضادة للإنترفيرون المؤتلف أو الطبيعي.
للاستخدام المحلي:ردود الفعل التحسسية.
تفاعل Interferon alpha-2b مع مواد أخرى
يقلل Interferon alfa-2b من تصفية الثيوفيلين عن طريق تثبيط استقلابه ، لذلك من الضروري التحكم في مستوى الثيوفيلين في بلازما الدم وتغيير نظام الجرعات ، إذا لزم الأمر. استخدم interferon alfa-2b بحذر بالتزامن مع المسكنات المخدرة والمهدئات والمنومات والأدوية التي يمكن أن يكون لها تأثير كبت النخاع. عند استخدام interferon alfa-2b مع عوامل العلاج الكيميائي المضادة للأورام (سيكلوفوسفاميد ، سيتارابين ، تينيبوسيد ، دوكسوروبيسين) ، يزداد خطر حدوث تأثيرات سامة.
جرعة مفرطة
لايوجد بيانات.
الأسماء التجارية للأدوية التي تحتوي على المادة الفعالة interferon alfa-2b
الأدوية المركبة:
إنترفيرون ألفا 2 ب + تورين + بنزوكاين: جينفيرون® ؛
إنترفيرون ألفا 2 ب + تورين: Genferon® Light ؛
إنترفيرون ألفا -2 ب + هيالورونات الصوديوم: جيافرون ؛
إنترفيرون ألفا 2 ب + لوراتادين: Allergoferon® ؛
إنترفيرون ألفا -2 ب + ميترونيدازول + فلوكونازول: فاجيفرون® ؛
بيتاميثازون + إنترفيرون ألفا -2 ب: Allergoferon® beta ؛
إنترفيرون ألفا -2 ب + أسيكلوفير + ليدوكائين: جيربفيرون® ؛