يبدأ إجراء تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (تشخيصات تفاعل البوليميراز المتسلسل) بجمع المواد لفحصها من قبل طبيب أمراض النساء أو طبيب المسالك البولية أو طبيب الأمراض الجلدية والتناسلية. يتم ضمان جودة وموثوقية النتائج التي تم الحصول عليها لاحقًا من خلال أعلى المؤهلات والخبرة الواسعة لأطباء مركز Euromedprestige الطبي ، الذين يراعون جميع القواعد اللازمة لإجراء تحليل PCR: العقم الكامل ، واستخدام المواد التي يمكن التخلص منها حصريًا.

توضع المادة التي تم جمعها من الفرشاة في وعاء به محلول ملحي. بعد أخذ العينات ، يجب تسليم العينات إلى مختبر تفاعل البوليميراز المتسلسل في أسرع وقت ممكن.

يتم تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في المختبر على ثلاث مراحل:

1. عزل الحمض النووي
2. تضخيم شظايا الحمض النووي
3. الكشف عن منتجات تضخيم الحمض النووي

استخلاص الحمض النووي هو المرحلة الأولية لتشخيص تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وجوهرها كما يلي: يأخذ الطبيب المادة للبحث من المريض ويخضعها إلى معالجة خاصة. أثناء المعالجة ، يحدث الانقسام الحلزون المزدوجالحمض النووي في خيوط فردية. يضاف إلى مادة المريض سائل خاص يذيب المواد العضوية التي تتداخل مع "نقاء" التفاعل. هذا يزيل الدهون والأحماض الأمينية والببتيدات والكربوهيدرات والبروتينات والسكريات. والنتيجة هي DNA أو RNA.

مبدأ طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل هو "بناء" عدوى جديدة للحمض النووي أو الرنا. لا يمكن القيام بذلك دون إزالة المواد الخلوية.

يعتمد مقدار الوقت المستغرق في استخلاص الحمض النووي على العامل المسبب للعدوى ونوع المادة المستخدمة في اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل. على سبيل المثال ، يستغرق تحضير الدم من 1.5 إلى 2 ساعة للخطوة التالية.

0 صفيف (=> تحليلات) صفيف (=> 2) صفيف (=>. html) 2

تضخيم الحمض النووي

لتنفيذ المرحلة التالية من تشخيص الحمض النووي - تضخيم الحمض النووي - يستخدم الأطباء ما يسمى بمصفوفات الحمض النووي - جزيئات الحمض النووي للعدوى ، والتي سيتم إجراء "استنساخ" الحمض النووي عليها لاحقًا. لقد سبق أن ذكرنا أن وجود الحمض النووي الكامل للعدوى ليس ضروريًا ؛ في هذه المرحلة ، تكون قطعة صغيرة من جزيء الحمض النووي كافية ، وهو ما ينفرد به هذا الميكروب (العدوى).

في قلب تضخيم الحمض النووي ، وبالتالي ، في صميم المبدأ الكامل لتفاعل PCR هو العملية الطبيعية لإكمال الحمض النووي لجميع الكائنات الحية - تكرار الحمض النووي ، والذي يتم تنفيذه عن طريق مضاعفة سلسلة DNA واحدة.

بدءًا بجزء واحد من الحمض النووي ، يقوم طبيب المختبر بنسخه وزيادة عدد النسخ في تفاعل متسلسل: بعد الدورة الأولى لديك بالفعل شظيتان ، بعد الدورة الثانية - 4 ، بعد الثالثة - 8 ، بعد الرابعة - 16 ، ثم 32 ، 64 ، 128 ، 256 ... مع كل دورة ، يتضاعف عدد النسخ ، وبعد عشرين دورة ، يذهب العدد إلى الملايين ، وبعد ثلاثين ، إلى المليارات. تستغرق الدورة بضع دقائق ويتم تقليلها إلى تغيير معين في نظام درجة الحرارة في مفاعل كيميائي صغير جدًا. هنا ، في محلول بكميات كافية ، توجد جميع المكونات الضرورية للتوليف ، أولاً وقبل كل شيء ، تم تنفيذ النيوكليوتيدات A و G و T و C ، وكذلك تم إجراء عمليات كيميائية تحضيرية دقيقة بحيث يتم عمل نسخة دقيقة على الفور من كل قطعة DNA منتهية ، ثم من هذه النسخة - مرة أخرى نسخة ، هذا هو التفاعل المتسلسل المتفرّع.

من خلال ربط البادئات بسلسلة الحمض النووي - "قطع" مصطنعة من الحمض النووي (أزواج النوكليوتيدات) مشابهة للحمض النووي للميكروبات (العدوى) - اثنان قصيران ، يتألفان من سلسلتين من أقسام الحمض النووي ، تتشكل الحلزونات ، وهي ضرورية للتوليف من الحمض النووي في المستقبل.

يحدث تخليق سلسلة جديدة من خلال استكمال كل من خيطي الدنا. تحدث عملية التضخيم بمساعدة موقع معين - بوليميراز الحمض النووي ، الذي أعطى الاسم طريقة المختبر. يعمل البوليميراز كمحفز للتفاعل ويراقب الارتباط المتسلسل لقواعد النوكليوتيدات بحبل DNA الجديد المتنامي.

وبالتالي ، فإن تضخيم الحمض النووي هو زيادة متعددة في عدد نسخ الحمض النووي المحددة ، أي المتأصلة فقط في كائن حي معين. ليست هناك حاجة لإكمال سلسلة الحمض النووي بأكملها لمعرفة العامل المسبب للعدوى. هناك حاجة فقط إلى المنطقة التي تتميز بها هذه البكتيريا كفرد.

5360 فرك. تكلفة برنامج شامل مع أخصائي أمراض الجهاز الهضمي

25٪ خصم عند استقبال طبيب القلب

- 25%أساسي
زيارة الطبيب
معالج نهاية الأسبوع

5160 فرك. بدلا من 5420 روبل. فحص التهابات المسالك البولية عند الرجال

أمراض الحساسية 5120 فرك. بدلا من 5590 روبل.

تحدث جميع خطوات التضخيم المتكررة في درجات حرارة مختلفة. لتحليل PCR ، يتم استخدام معدات قابلة للبرمجة بشكل خاص - PCR - ترموستات أو مكبر للصوت ، والذي يغير درجات الحرارة تلقائيًا. يتم إجراء التضخيم وفقًا لبرنامج محدد مسبقًا يتوافق مع نوع العدوى التي يتم اكتشافها. اعتمادًا على البرنامج ونوع الإصابة التي يتم اكتشافها ، تستغرق عملية PCR الآلية من 2 إلى 3 ساعات.

يتم لعب دور مهم في تشخيص PCR من خلال تأهيل مساعد المختبر الذي يجري التحليل ، ويعتمد الإعداد الصحيح لجهاز PCR وتفسير النتائج عليه. يتمتع أطباء مركز يوروميد برستيج الطبي بخبرة واسعة في إجراء تشخيصات الحمض النووي ، مما يضمن موثوقية نتائج الدراسة ويضمن نجاحًا إيجابيًا في العلاج. أمراض معدية. لاجتياز اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل وإجراء التشخيص والعلاج الكامل للأمراض المعدية في مركزنا الطبي "Euromedprestige".

أثناء الكشف عن منتجات التضخيم ، يتم فصل الخليط الناتج من منتجات التضخيم. تتم إضافة حلول خاصة إلى الخليط ، والتي تمنح شظايا الحمض النووي القدرة على التألق - تعكس خطوطًا برتقالية حمراء مضيئة. يشير التوهج الناتج إلى وجود الحمض النووي للفيروسات أو الميكروبات أو البكتيريا في المادة المأخوذة من المريض لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو طريقة عالية الدقة في مجال تشخيص الأمراض الوراثية والالتهابات والأمراض الفيروسية في أي مرحلة (حادة أو مزمنة) ، وكذلك مرحلة مبكرة- إلى المظاهر الواضحة للمرض عن طريق تحديد مسببات الأمراض ، بناءً على الحمض النووي ، RNA ، وهي مادة وراثية ، في العينات التي يتم الحصول عليها من المريض. واليوم سنتحدث عن الجوهر والمراحل التشخيصية ومبادئ طرق تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، فضلاً عن تكلفتها.

ما هو تفاعل البلمرة المتسلسل

أساس التحليل هو التضخيم (المضاعفة) - إنشاء العديد من النسخ من قسم قصير من الحمض النووي (الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين) ، والذي يمثل المركب الجيني البشري. تتطلب الدراسة كمية قليلة جدًا من المواد الفسيولوجية (البلغم ، البراز ، الكشط الظهاري ، عصير البروستات ، الدم ، السائل المنوي ، السائل الأمنيوسي ، المخاط ، أنسجة المشيمة ، البول ، اللعاب ، السائل الجنبي ، السائل النخاعي). في هذه الحالة ، على سبيل المثال ، يمكن حتى اكتشاف ميكروب واحد ضار في الجهاز البولي التناسلي للمريض.

تم تطوير تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (تفاعل البوليميراز المتسلسل) بواسطة العالم الأمريكي ك.موليس ، الحائز على جائزة نوبل عام 1993.

تستخدم بنشاط:

• في التشخيص المبكر للعدوى الوراثية ؛
• في الفحص الطبي الشرعي في وجود كمية صغيرة للغاية من الحمض النووي للبحث ؛
• في الطب البيطري والمستحضرات الصيدلانية وعلم الأحياء وعلم الوراثة الجزيئي.
• لتحديد هوية الشخص عن طريق الحمض النووي ، وتأكيد الأبوة ؛
• في علم الحفريات والأنثروبولوجيا والبيئة (عند تتبع جودة المنتجات والعوامل البيئية).

سيخبرك هذا الفيديو عن تفاعل البلمرة المتسلسل:

لمن تم تعيينه

يعد تفاعل البلمرة المتسلسل في تشخيص الأمراض المعدية أحد أكثر الطرق موثوقية ودقة عالية وموثوقية. على سبيل المثال ، تقترب موثوقية تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل للكلاميديا ​​والعديد من مسببات الأمراض الأخرى بنسبة 100٪ (مطلق). في أغلب الأحيان ، يتم وصف إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل للمرضى الذين ، عند التشخيص ، يجدون صعوبة في تحديد مسببات الأمراض المحددة.

يستخدم اختبار PCR المخبري:

• للكشف عن مسببات الأمراض التي تسبب عدوى الأعضاء البولية والتناسلية ، والتي يصعب تحديدها باستخدام المحاصيل أو الطرق المناعية ؛
• لإعادة تشخيص فيروس نقص المناعة البشرية في المرحلة الأولية في حالة وجود نتيجة إيجابية ولكن مشكوك فيها للتحليل الأولي (على سبيل المثال ، عند الأطفال حديثي الولادة من الآباء المصابين بالإيدز) ؛
• لانشاء مرض الأورامفي مرحلة مبكرة (دراسة طفرات الجينات الورمية) والتصحيح الفردي لنظام العلاج في مريض معين ؛
• لغرض الكشف المبكر والعلاج المحتمل للأمراض الوراثية.

لذلك ، يتم اختبار الآباء في المستقبل لمعرفة ما إذا كانوا حاملين لعلم الأمراض الوراثي ؛ في الأطفال ، يحدد تفاعل البوليميراز المتسلسل احتمال التعرض لمرض وراثي.

• للكشف عن تشوهات الجنين المدى المبكرالحمل (يتم فحص الخلايا الفردية للجنين النامي بحثًا عن الطفرات المحتملة) ؛
• في المرضى قبل زرع الأعضاء - من أجل "تصنيف الأنسجة" (تحديد توافق الأنسجة) ؛
• للكشف عن الكائنات المسببة للأمراض الخطيرة في الدم المتبرع به ؛
• عند الأطفال حديثي الولادة - لاكتشاف العدوى الكامنة ؛
• لتقييم نتائج العلاج بمضادات الفيروسات والميكروبات.

لماذا تمر بهذا الإجراء؟

نظرًا لأن تفاعل البوليميراز المتسلسل هو طريقة تشخيصية عالية الفعالية وتعطي نتيجة تقارب 100٪ ، يتم استخدام الإجراء:

• لتأكيد أو استبعاد التشخيص النهائي ؛
• التقييم السريع لفعالية العلاج.

في كثير من الحالات ، يكون تفاعل البوليميراز المتسلسل هو الوحيد اختبار ممكنللكشف عن مرض متطور إذا كانت طرق التشخيص البكتريولوجية والمناعية والفيروسية الأخرى غير مجدية.

• يتم الكشف عن الفيروسات بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرة بعد الإصابة وقبل ظهور علامات المرض. يسمح الاكتشاف المبكر للفيروس بالعلاج الفوري.
• ما يسمى " العبئ او الحمل الفيروسي»(أو - عدد الفيروسات في الجسم) يتم تحديده أيضًا من خلال تحليل الحمض النووي بطريقة كمية.
• مسببات الأمراض المحددة (مثل عصية حديبة كوخ) صعبة وتستغرق وقتًا طويلاً لاستزراعها. يتيح لك تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل التعرف بسرعة على الحد الأدنى لعدد مسببات الأمراض (الحية والميتة) في العينات الملائمة للبحث.

يتم استخدام تحليل الحمض النووي المُمْرض بالتفصيل:

• لتحديد حساسيته لأنواع معينة من المضادات الحيوية ، مما يسمح لك ببدء العلاج على الفور ؛
• للسيطرة على انتشار الأوبئة بين الحيوانات البرية والداجنة ؛
• لتحديد ومراقبة الأنواع الميكروبية المعدية الجديدة والأنواع الفرعية المسببة للأمراض التي غذت الأوبئة السابقة.

أنواع التشخيص

الطريقة القياسية

يتم إجراء تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل على أساس تضخيم متعدد (مضاعفة) لجزء معين من DNA و RNA باستخدام إنزيمات أولية خاصة. نتيجة لسلسلة النسخ ، يتم الحصول على كمية من المواد الكافية للبحث.

أثناء الإجراء ، يتم نسخ الجزء المطلوب فقط (المطابق للشروط المحددة المحددة) حتى لو كان موجودًا بالفعل في العينة.

يوضح هذا الفيديو التفصيلي مع الرسوم البيانية المفيدة كيفية عمل تفاعل البوليميراز المتسلسل:

أساليب أخرى

• الوقت الحقيقي PCR. في هذا النوع من الدراسة ، تبدأ عملية تحديد جزء معين من الحمض النووي بعد كل دورة ، وليس بعد اكتمال السلسلة الكاملة المكونة من 30-40 دورة. يسمح لك هذا النوع من الدراسة بالحصول على معلومات حول كمية العامل الممرض (فيروس أو ميكروب) في الجسم ، أي لإجراء تحليل كمي.
• RT-PCR (وضع النسخ العكسي). يستخدم هذا الاختبار للعثور على الحمض النووي الريبي أحادي الجديلة للكشف عن الفيروسات التي تكون قاعدتها الجينية هي الحمض النووي الريبي (على سبيل المثال ، فيروس التهاب الكبد C ، فيروس نقص المناعة). في مثل هذه الدراسة ، يتم استخدام إنزيم خاص - إنزيم النسخ العكسي وبادء معين ، ويتم بناء الحمض النووي أحادي السلسلة على أساس الحمض النووي الريبي. ثم يتم استعادة خيط DNA ثانٍ من هذا الشريط ويتم تنفيذ الإجراء القياسي.

مؤشرات لعقد

يستخدم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في عيادة الأمراض المعدية ، وطب حديثي الولادة ، والتوليد ، وطب الأطفال ، والمسالك البولية ، وأمراض النساء ، وطب الأمراض التناسلية ، وطب الأعصاب ، وأمراض الكلى ، وطب العيون.

مؤشرات لغرض التحليل:

• توضيح خطر الإصابة بتشوهات وراثية لدى الطفل مع احتمال الإصابة بأمراض وراثية ؛
• تشخيص كلا الوالدين عند التخطيط للحمل أو حالة خطيرة للأم أثناء الحمل المستمر ؛
• صعوبات في الحمل ، وتحديد أسباب العقم ؛
• يشتبه في العدوى المنقولة جنسيا المرحلة الحادةومع ظهور أعراض تحولهم إلى مزمن ؛
• اكتشاف الأسباب العمليات الالتهابيةأصل غامض
• الاتصالات الجنسية العرضية والمستمرة غير المحمية ؛
• تحديد حساسية الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض لمضادات حيوية معينة ؛
• المرضى الذين يشتبه في إصابتهم بالعدوى الكامنة للكشف عن مسببات الأمراض قبل ظهور الأعراض العلنية (التشخيص قبل السريري) ؛
• المرضى لتأكيد الشفاء بعد المرض (التشخيص بأثر رجعي) ؛

يتم استخدام التشخيص أيضًا إذا كان من الضروري تحديد مسببات الأمراض التالية بدقة:

• فيروسات التهاب الكبد (A B C G) ، نقص المناعة البشرية ، الفيروس المضخم للخلايا ؛
• ضمة الكوليرا
• فيروس الهربس البسيط ، أنواع الحلئي الشكل ؛
• رجعية - غدية - وفيروسات الأنف ؛
• فيروسات الحصبة الألمانية ، إبشتاين بار ، الحماق (الفيروس النطاقي) ؛
• البارفو والفيروسات البيكورناوية.
• بكتيريا هيليكوباكتر بيلوري ؛
• الليجيونيلا ، الأنواع المسببة للأمراض من الإشريكية القولونية ؛
• المكورات العنقودية الذهبية؛
• العوامل الممرضة؛
• المطثية والدفتيريا والمستدمية النزلية ؛

كما أنها تستخدم لتحديد العدوى:

• عدد كريات الدم البيضاء المعدية.
• داء الليستريات ، التهاب الدماغ الذي ينقله القراد.
• داء المبيضات الناجم عن فطريات المبيضات.
• الالتهابات الجنسية - داء المشعرات ، ureaplasmosis ، اللولبية الشاحبة ، داء البستنة ، السيلان ، داء المفطورة ، الكلاميديا.
• مرض الدرن.

موانع لعقد

نظرًا لأن الإجراء لا يتم إجراؤه مع المريض ، دون أي تأثير على الجسم ، ولكن باستخدام المواد البيولوجية التي يتم أخذها للبحث ، فلا توجد موانع لاستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بسبب عدم وجود خطر محتمل.

ومع ذلك ، لا يتم أخذ عينات المواد الحيوية من قناة عنق الرحم بعد إجراء التنظير المهبلي. لا يُسمح بتسليم اللطاخات والكشط للتحليل إلا بعد 4 إلى 6 أيام من نهاية الحيض والتوقف التام عن الإفرازات.

هل الطريقة آمنة

لا أحد التأثير السلبيعلى مريض في دراسة معزولة عن مادته الحيوية في المختبر أمر مستحيل.

التحضير للإجراء (تسليم المواد البيولوجية للتحليل)

كعينة لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، حيث يتم الكشف عن الحمض النووي لمسببات الأمراض الغريبة ، يتم استخدام أي سائل بيولوجي أو نسيج أو إفرازات للجسم. يتم أخذ عينات من مادة الاختبار على شكل سحب دم من الوريد ، وكشط من الحنجرة ، وتجويف الأنف ، ومجرى البول ، التجويف الجنبي، عنق الرحم.

قبل إجراء التشخيص ، يشرح الطبيب للمريض المواد التي سيتم أخذها:

1. عند فحص الالتهابات الجنسية ، يتم أخذ إفرازات من الأعضاء التناسلية والبول ومسحة من مجرى البول.
2. عند تحليلها لـ الالتهابات العقبولية، الفيروس المضخم للخلايا ، عدد كريات الدم البيضاء - يأخذون البول لتحليله ، مسحة من الحلق ، لالتهاب الكبد ، داء المقوسات - دم من الوريد.
3. لغرض التشخيص أنواع مختلفةيؤخذ السائل النخاعي.
4. في أمراض الرئة ، عينات للتحليل هي البلغم والسائل الجنبي.
5. عند إجراء دراسة للعدوى المحتملة داخل الرحم أثناء الحمل ، يتم استخدام السائل الأمنيوسي وخلايا المشيمة للتحليل.

تعتمد موثوقية ودقة التحليل على عقم الظروف عند أخذ المادة. نظرًا لأن اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل حساس للغاية ، فإن أي تلوث لمادة الاختبار يمكن أن يشوه النتيجة.

لا يمثل الإعداد الكفء لتوصيل المواد الحيوية أي صعوبات للمرضى. هناك بعض التوصيات:

• عند تحليل الالتهابات الجنسية:
  • استبعاد جهات الاتصال الحميمة قبل 72 ساعة من تسليم المواد ؛
  • التوقف عن استخدام أي منتجات مهبلية لمدة 3 أيام ؛
  • منذ مساء اليوم السابق ، لا تقم بإجراء النظافة في المنطقة قيد الدراسة ؛
  • استبعاد التبول لمدة 3-4 ساعات عند أخذ عينة من مجرى البول ؛
• التوقف عن تناول المضادات الحيوية قبل شهر من اختبار العدوى ؛
• التبرع بالدم في الصباح قبل الأكل والشرب ؛
• يتم جمع الجزء الأول من البول في الصباح في وعاء معقم بعد مرحاض حميم شامل.

اقرأ المزيد حول كيفية إجراء التشخيص باستخدام طريقة تفاعل البلمرة المتسلسل.

كيف هو الإجراء

عند إجراء دراسة PCR مرارًا وتكرارًا في المفاعل (مكبر للصوت أو جهاز تدوير حراري) ، يتم تكرار دورات معينة:

1. الخطوة الأولى هي تمسخ. يتم وضع اللعاب ، والدم ، والخزعة ، وعينات أمراض النساء ، والبلغم ، حيث يشتبه في وجود الحمض النووي (أو الحمض النووي الريبي) للعامل الممرض ، في مكبر للصوت ، حيث يتم تسخين المادة وينقسم الحمض النووي إلى سلسلتين منفصلتين.
2. الخطوة الثانية هي التلدين أو التبريد الطفيف للمادة.وإضافة مواد أولية إليه يمكنها التعرف على الأقسام المرغوبة في جزيء الحمض النووي وربطها بها.
3. الخطوة الثالثة هي الاستطالة- يحدث بعد إضافة 2 من البادئات لكل من خيوط الحمض النووي. أثناء هذه العملية ، يكتمل جزء الحمض النووي للعامل الممرض ، وتتشكل نسخته.

تتكرر هذه الدورات مثل "تفاعل متسلسل" ، يؤدي في كل مرة إلى مضاعفة نسخ جزء معين من الحمض النووي (على سبيل المثال ، جزء يتم فيه برمجة فيروس معين). في غضون ساعات قليلة ، يتم تكوين العديد من نسخ جزء الحمض النووي ، ويتم الكشف عن وجودها في العينة. بعد ذلك يتم تحليل النتائج ومقارنتها بقاعدة بيانات الأنواع المختلفة من مسببات الأمراض من أجل تحديد نوع العدوى.

اقرأ عن تفسير النتائج والاستنتاج بناءً على تفاعل PCR أدناه.

فك رموز النتائج

يتم إصدار النتيجة النهائية للدراسة بعد يوم أو يومين من تسليم المواد البيولوجية. في كثير من الأحيان - بالفعل في اليوم الأول بعد التحليل.

التحليل النوعي

• سلبيالنتيجة تعني أنه لم يتم العثور على أي أثر للعوامل المعدية في المادة المقدمة للبحث.
• إيجابيتعني النتيجة اكتشاف الفيروسات أو البكتيريا المسببة للأمراض في عينة بيولوجية بدرجة عالية جدًا من الدقة وقت التقديم.

إذا كانت النتيجة إيجابية ، ولكن لا توجد علامات على تنشيط العدوى ، فإن هذه الحالة من الجسم تسمى "النقل الصحي" بدون أعراض. غالبًا ما يتم ملاحظته عند أخذ مادة حيوية من مكان معين (قناة عنق الرحم ، مجرى البول ، تجويف الفم) في الأمراض الفيروسية. العلاج في هذه الحالة غير مطلوب ، لكن الإشراف الطبي المستمر ضروري ، حيث توجد إمكانية:

• انتشار الفيروس من حاملي الفيروس وإصابة الأشخاص الأصحاء ؛
• تفعيل العملية وانتقال المرض إلى شكل مزمن.

ومع ذلك ، إذا كان فحص الدم إيجابيًا ، فهذا يشير إلى أن العدوى قد أثرت على الجسم ، ولم تعد هذه حالة حاملة ، ولكنها مرض يتطلب علاجًا محددًا فوريًا.

تحليل كمي

يتم تحديد النتيجة الكمية من قبل المتخصص على وجه التحديد لنوع معين من العدوى. على أساسها ، من الممكن تقييم درجة التطور ، مرحلة المرض ، مما يجعل من الممكن وصف العلاج الصحيح على الفور.

متوسط ​​السعر

يتم تحديد أسعار إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل من خلال: نوع الدراسة ، وتعقيد تحديد العامل الممرض ، وصعوبة جمع المواد البيولوجية ، ونوع التحليل (النوعي أو الكمي) ، ومستوى السعر في المختبر.

من ناحية أخرى ، في دراسة PCR ، يمكن اكتشاف العديد من مسببات الأمراض في وقت واحد عند أخذ نوع واحد من المواد للتحليل. هذا يوفر على الاختبارات المعملية الأخرى.

تقريبًا ، تكلفة تحليل PCR بالروبل:

• المكورات البنية ، غاردنريلا ، المشعرات المهبلية - من 180
• المتدثرة الحثرية - من 190
• فيروس الورم الحليمي - من 380 إلى 500
• التكاثر الحيوي للجهاز البولي التناسلي عند النساء (التقييم الكمي والنوعي للميكروفلورا) - من 800.

لمزيد من المعلومات المفيدة بخصوص دراسة PCR ، انظر الفيديو أدناه:

مبدأ الطريقة (الأساس البيولوجي الجزيئي)

من بين مجموعة واسعة من طرق التهجين لتحليل الحمض النووي ، يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو الأكثر استخدامًا في التشخيص المختبري السريري.

مبدأ الطريقة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)(تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)) تم تطويره بواسطة Cary Mullis (Cetus ، الولايات المتحدة الأمريكية) في عام 1983. ويستخدم حاليًا على نطاق واسع في البحث العلمي والتشخيص في الرعاية الصحية العملية وخدمة الإشراف على الصحة والوبائيات الحكومية (التنميط الجيني وتشخيص الأمراض المعدية).

تعتمد طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل على عملية طبيعية - إكمال تكميلي لقالب الحمض النووي ، يتم تنفيذه بمساعدة إنزيم بوليميريز الحمض النووي. يسمى هذا التفاعل تكرار الحمض النووي.

يتضمن تكرار الحمض النووي الطبيعي عدة خطوات:

1) تمسخ الحمض النووي(فك اللولب المزدوج ، تباعد خيوط الحمض النووي) ؛

2) تشكيل شرائح DNA قصيرة مزدوجة الشريطة(البذور المطلوبة لبدء تخليق الحمض النووي) ؛

3) تخليق خيط DNA جديد(استكمال تكميلي لكلا الخيوط)

يمكن استخدام هذه العملية للحصول على نسخ أجزاء قصيرة من DNA خاصة بكائنات دقيقة محددة ،أولئك. لإجراء بحث مستهدف لمثل هذه المناطق المحددة ، وهو هدف التشخيص الجيني للتعرف على مسببات الأمراض المعدية.

اكتشاف بوليميراز الدنا القابل للحرارة (بوليميراز طاق) من البكتيريا المحبة للحرارة Thermis aquaticus، التي يكون الحد الأقصى لها في منطقة 70-72 درجة مئوية ، جعل من الممكن جعل عملية تكرار الحمض النووي دورية واستخدامها في العمل في المختبر. إنشاء منظمات الحرارة القابلة للبرمجة (مكبرات الصوت) ، والتي ، وفقًا لبرنامج معين ، تنفذ تغييرات دورية في درجات الحرارة ، أوجدت المتطلبات الأساسية لإدخال طريقة PCR على نطاق واسع في ممارسة التشخيص السريري المخبري. مع التكرار المتكرر لدورات التخليق ، تحدث زيادة أسية في عدد نسخ جزء معين من الحمض النووي ، مما يجعل من الممكن الحصول على عدد كافٍ من نسخ الحمض النووي من كمية صغيرة من المادة التي تم تحليلها ، والتي قد تحتوي على خلايا مفردة من الكائنات الحية الدقيقة ، للتعرف عليهم بالرحلان الكهربي.

لا يبدأ الإنجاز التكميلي للسلسلة في أي نقطة في تسلسل الحمض النووي ، ولكن فقط في كتل بداية معينة - مقاطع قصيرة مزدوجة الشريطة. من خلال ربط هذه الكتل بمناطق معينة من الحمض النووي ، من الممكن توجيه عملية تخليق خيط جديد فقط في هذه المنطقة ، وليس على طول طول خيط الحمض النووي بالكامل. لإنشاء كتل البداية في مناطق معينة من الحمض النووي ، يتم استخدام اثنين من بادئات قليلة النوكليوتيد (20 زوجًا من النيوكليوتيدات) ، تسمى الاشعال.تعتبر البادئات مكملة لتسلسل الحمض النووي على الحدود اليمنى واليسرى لجزء معين ويتم توجيهها بطريقة تجعل إكمال خيط DNA الجديد يحدث بينهما فقط.

وبالتالي ، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل هو زيادة متعددة في عدد النسخ (التضخيم) لمنطقة DNA معينة يتم تحفيزها بواسطة إنزيم بوليميريز الحمض النووي.

المكونات التالية مطلوبة للتضخيم:

خليط من ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTPs)(خليط من أربعة dNTPs ، وهي مادة لتركيب خيوط DNA تكميلية جديدة)

انزيم طاق بوليميراز(بوليميراز DNA قابل للحرارة يحفز إطالة سلاسل التمهيدي عن طريق إضافة قواعد نيوكليوتيد متسلسلة إلى سلسلة متنامية من الحمض النووي المركب).

محلول منظم(وسط تفاعل يحتوي على أيونات Mg2 + اللازمة للحفاظ على نشاط الإنزيم)
لتحديد مناطق معينة من جينوم الفيروسات المحتوية على RNA ، يتم الحصول على نسخة DNA أولاً من قالب RNA باستخدام تفاعل النسخ العكسي (RT) المحفز بواسطة إنزيم النسخ العكسي (النسخ العكسي).

للحصول على عدد كافٍ من نسخ جزء DNA المميز المطلوب ، يشتمل التضخيم على عدة دورات (20-40).

تتضمن كل دورة تضخيم 3 مراحل تجري في ظروف درجات حرارة مختلفة الخطوة 1: تمسخ الحمض النووي(فك الحلزون المزدوج). يتدفق عند 93-95 درجة مئوية لمدة 30-40 ثانية. المرحلة الثانية: إرفاق البادئات (التلدين).يحدث التعلق التمهيدي مكملًا للتسلسلات المقابلة على خيوط DNA المعاكسة عند حدود موقع معين. كل زوج من البادئات له درجة حرارة التلدين الخاصة به ، والتي تتراوح قيمها بين 50-65 درجة مئوية. وقت التلدين -20-60 ثانية. المرحلة 3: بناء سلاسل الحمض النووي.يحدث الإكمال التكميلي لسلاسل الحمض النووي من نهاية 5'-end إلى 3'-end من السلسلة في اتجاهات متعاكسة ، بدءًا من مواقع ارتباط التمهيدي. المواد المستخدمة في تصنيع سلاسل الحمض النووي الجديدة عبارة عن ثلاثي فوسفات ديوكسي ريبونوكليوتيد (dNTPs) مضافًا إلى المحلول. يتم تحفيز عملية التوليف بواسطة إنزيم بوليميراز DNA القابل للحرارة (Taq polymerase) وتحدث عند درجة حرارة 70-72 درجة مئوية. وقت التوليف - 20-40 ثانية.

تعمل خيوط الحمض النووي الجديدة التي تشكلت في دورة التضخيم الأولى كقوالب لدورة التضخيم الثانية ، والتي يتم فيها تشكيل جزء الحمض النووي المحدد المطلوب (أمبليكون). (انظر الشكل 2). في دورات التضخيم اللاحقة ، تعمل الأمبليكون كقالب لتركيب سلاسل جديدة. وبالتالي ، يحدث تراكم الأمبليكون في المحلول وفقًا للصيغة 2n ، حيث n هو عدد دورات التضخيم. لذلك ، حتى لو كان جزيء DNA مزدوج الشريطة موجودًا في البداية في المحلول الأولي ، يتراكم حوالي 108 جزيء أمبليكون في المحلول بعد 30-40 دورة. هذه الكمية كافية للكشف البصري الموثوق عن هذه القطعة بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام. تتم عملية التضخيم في منظم حرارة خاص قابل للبرمجة (مكبر للصوت) ، والذي ، وفقًا لبرنامج معين ، يغير درجات الحرارة تلقائيًا وفقًا لعدد دورات التضخيم.

مراحل PCR - التحليل

تعتمد طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كأداة تشخيص معملية للأمراض المعدية ، على الكشف عن جزء صغير من الحمض النووي للعامل الممرض (عدة مئات من الأزواج القاعدية) ، المخصصة فقط لهذا الكائن الدقيق ، باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل لتراكم الجزء المطلوب.
تتضمن تقنية التحليل باستخدام طريقة PCR ثلاث مراحل:

1. عزل DNA (RNA) من عينة سريرية

2. تضخيم شظايا DNA معينة
3. الكشف عن منتجات التضخيم

عزل DNA (RNA)
في هذه المرحلة من التحليل ، تخضع العينة الإكلينيكية لمعالجة خاصة ، مما يؤدي إلى تحلل المادة الخلوية ، وإزالة جزيئات البروتين والسكريات ، وتحضير محلول DNA أو RNA خالٍ من
مثبطات وجاهزة لمزيد من التضخيم.
يتم تحديد اختيار تقنية استخراج DNA (RNA) بشكل أساسي من خلال طبيعة المواد السريرية المعالجة.

تضخيم شظايا DNA محددة
في هذه المرحلة ، تتراكم شظايا DNA قصيرة محددة بالكمية اللازمة لاكتشافها الإضافي. تستخدم معظم طرق تحديد أجزاء معينة من الجينوم ما يسمى ب. " النسخة الكلاسيكيةموجه PCR. لزيادة خصوصية وحساسية التحليل ، تستخدم بعض الطرق طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل "المتداخلة" ، والتي تستخدم زوجين من البادئات ("خارجي" - للمرحلة الأولى ، و "داخلي" - للمرحلة الثانية).

الكشف عن منتجات التضخيم
في معظم التقنيات ، في هذه المرحلة ، يتم فصل خليط منتجات التضخيم التي تم الحصول عليها في المرحلة الثانية عن طريق الرحلان الكهربائي الأفقي لهلام الاغاروز. قبل الفصل الكهربي ، يضاف محلول بروميد إيثيديوم إلى خليط التضخيم ، والذي يشكل تقاطعات بينية قوية مع شظايا DNA مزدوجة الشريطة. هذه المركبات تحت تأثير الأشعة فوق البنفسجية قادرة على التألق ، والتي يتم تسجيلها على شكل شرائط برتقالية حمراء مضيئة بعد الفصل الكهربي لخليط التضخيم في هلام الاغاروز.

كبديل لطريقة الكشف الكهربي ، والتي لها بعض العيوب: يمكن اقتراح الذاتية في قراءة النتائج ، والقيود على تحديد الحمض النووي للعديد من الكائنات الحية الدقيقة في تفاعل واحد. مخططات الكشف عن التهجين.في هذه المخططات ، يتم تهجين جزء الحمض النووي الناتج عن التضخيم (يشكل معقدات ثنائية الخيط - "هجينة") باستخدام مسبار قليل النوكليوتيد المحدد. يمكن إجراء تسجيل مثل هذه المجمعات بطريقة القياس اللوني أو الفلوري. قامت SPC "Litekh" بإنشاء مجموعات الكشف على أساس التهجين مع تسجيل النتائج الفلورية

مزايا طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل كطريقة لتشخيص الأمراض المعدية:

- تعريف مباشروجود مسببات الأمراض

كثير الطرق التقليديةتكشف التشخيصات ، مثل المقايسة المناعية للإنزيم ، عن البروتينات الواسمة التي هي نتاج النشاط الحيوي للعوامل المعدية ، والتي لا تعطي سوى دليل غير مباشر على وجود عدوى. إن تحديد منطقة DNA معينة للعامل الممرض بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل يعطي مؤشراً مباشراً على وجود العامل المعدي.

- خصوصية عالية
تعود الخصوصية العالية لطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى حقيقة أنه تم الكشف عن خاصية فريدة لجزء الحمض النووي لهذا العامل الممرض فقط في مادة الاختبار. يتم تحديد الخصوصية من خلال تسلسل النوكليوتيدات في البادئات ، والذي يستبعد
إمكانية الحصول على نتائج خاطئة ، على عكس طريقة المقايسة المناعية الإنزيمية ، حيث لا تكون الأخطاء غير شائعة بسبب المستضدات المتفاعلة.

- حساسية عالية
تسمح لك طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل باكتشاف خلايا مفردة من البكتيريا أو الفيروسات. يكشف تشخيص PCR عن وجود مسببات الأمراض للأمراض المعدية في الحالات التي تكون فيها الطرق الأخرى (المناعية والبكتريولوجية ،
المجهري) مستحيل. تبلغ حساسية تحليل PCR 10-1000 خلية لكل عينة (حساسية الاختبارات المناعية والميكروسكوبية هي 103-105 خلية).

- عالمية إجراء تحديد مسببات الأمراض المختلفة
المادة المستخدمة في دراسة تفاعل البوليميراز المتسلسل هي الحمض النووي للعامل الممرض. تعتمد الطريقة على اكتشاف جزء من DNA أو RNA خاص بكائن حي معين. تشابه التركيب الكيميائيلجميع الأحماض النووية يسمح باستخدام طرق موحدة للبحث المعملي. هذا يجعل من الممكن تشخيص العديد من مسببات الأمراض من خلال اختبار حيوي واحد. يمكن استخدام الإفرازات البيولوجية المختلفة (المخاط والبول والبلغم) وكشط الخلايا الظهارية والدم والمصل كمواد اختبار.

- سرعة عالية في الحصول على نتيجة التحليل
لا يتطلب تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل عزل وزراعة ثقافة العوامل الممرضة ، الأمر الذي يستغرق الكثير من الوقت. تتيح الطريقة الموحدة لمعالجة المواد الحيوية والكشف عن نواتج التفاعل وأتمتة عملية التضخيم إمكانية التنفيذ تحليل كاملفي 4-4.5 ساعات.

وتجدر الإشارة إلى أن طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يمكنها اكتشاف مسببات الأمراض ليس فقط في المواد السريرية التي تم الحصول عليها من المريض ، ولكن أيضًا في المواد التي تم الحصول عليها من الكائنات البيئية (الماء ، التربة ، إلخ).

تطبيق طريقة PCR في الرعاية الصحية العملية

إن استخدام طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل لتشخيص الأمراض المعدية ذات الطبيعة البكتيرية والفيروسية له أهمية كبيرة في حل العديد من مشاكل علم الأحياء الدقيقة وعلم الأوبئة. يساهم استخدام هذه الطريقة أيضًا في تطوير البحث الأساسي في مجال الأمراض المعدية المزمنة والقليلة الدراسة.

الاستخدام الأكثر فاعلية ومبررًا اقتصاديًا للطريقة في:

ممارسة المسالك البولية النسائية- للكشف عن الكلاميديا ​​، ureaplasmosis ، السيلان ، الهربس ، داء البستنة ، عدوى الميكوبلازما ؛

في أمراض الرئة- ل تشخيص متباينالفيروسية و الالتهاب الرئوي الجرثومي، مرض الدرن؛

في أمراض الجهاز الهضمي- للكشف عن هيليكوباكتيريوسيس.

في عيادة الأمراض المعدية- كطريقة صريحة لتشخيص داء السلمونيلات والدفتيريا. التهاب الكبد الفيروسي B و C و G ؛

في أمراض الدم- للكشف عن عدوى الفيروس المضخم للخلايا ، فيروسات الأورام.

الوكالة الاتحادية للتعليم

مؤسسة تعليمية حكومية

أعلى فائق التعليم المهني

"أكاديمية كاريليان الحكومية التربوية"

الدورات الدراسية حول الموضوع:

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) وتطبيقاته

أنجزته: الطالبة كورياجينا فاليريا أليكساندروفنا

فحصه: كاربيكوفا ناتاليا ميخائيلوفنا

بتروزافودسك 2013

مقدمة

الفصل 1 مراجعة الأدب

1.5.4 تأثير الهضبة

1.5.6 التضخيم

خاتمة

مقدمة

تميزت السنوات العشرين الماضية بالإدخال الواسع النطاق للطرق الوراثية الجزيئية في العلوم البيولوجية والطبية والزراعية.

بحلول أوائل السبعينيات ، بدا أن البيولوجيا الجزيئية قد وصلت إلى درجة معينة من الكمال. خلال هذه الفترة ، كانت الكائنات الحية الدقيقة هي الهدف الرئيسي للبحث الوراثي الجزيئي. قدم الانتقال إلى حقيقيات النوى للباحثين مشاكل جديدة تمامًا لا يمكن حلها باستخدام طرق التحليل الجيني التي كانت موجودة في ذلك الوقت. أصبح الاختراق في تطوير علم الوراثة الجزيئي ممكنًا بسبب ظهور أداة تجريبية جديدة - نوكليازات تقييدية. في السنوات اللاحقة ، بدأ عدد طرق تحليل الحمض النووي المباشرة القائمة على مناهج مختلفة نوعيًا في الزيادة بسرعة.

التقنيات الحديثةفي كثير من الحالات ، جعلوا من الممكن البدء في دراسة التنظيم الهيكلي والوظيفي الدقيق للجينومات النووية وخارجها لكائنات مختلفة على مستوى أعمق. كان لهذا أهمية خاصة لتطوير طرق جديدة للتشخيص والعلاج. امراض عديدة. لم يكن أقل أهمية هو إمكانية استخدام إنجازات علم الوراثة الجزيئي في علم الأحياء والتربية لتحديد وتحليل التباين الجيني للمجموعات والأصناف والسلالات ، وتحديد واعتماد الأفراد ذوي القيمة الاقتصادية ، وإنشاء كائنات معدلة وراثيًا ، وحل المشكلات الأخرى.

كل أسلوب له مزاياه وعيوبه. لا توجد طريقة عالمية يمكن أن تحل جميع المشاكل التي تنشأ. لذلك فإن اختيار طريقة معينة للبحث الجاري يعد من أهم مراحل أي عمل علمي.

الفصل 1 مراجعة الأدب

1.1 تاريخ اكتشاف تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

في عام 1983 م. نشر موليس وزملاؤه طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وحصلوا على براءة اختراعها ، والتي كان من المقرر أن يكون لها تأثير عميق على جميع مجالات البحث وتطبيق الأحماض النووية. تبين أن أهمية هذه الطريقة في علم الأحياء الجزيئي وعلم الوراثة كبيرة جدًا وواضحة لدرجة أنه بعد سبع سنوات حصل المؤلف على جائزة نوبل في الكيمياء.

في بداية استخدام الطريقة ، بعد كل دورة تبريد وتسخين ، كان من الضروري إضافة بوليميريز DNA إلى خليط التفاعل ، حيث تم تعطيله أثناء درجة حرارة عاليةضروري لفصل خيوط حلزون الحمض النووي. كان إجراء التفاعل غير فعال نسبيًا ، ويتطلب الكثير من الوقت والإنزيم. في عام 1986 ، تم تحسين طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل ملحوظ. تم اقتراح استخدام بوليميرات الحمض النووي من البكتيريا المحبة للحرارة. أثبتت هذه الإنزيمات أنها قابلة للحرارة وقادرة على تحمل العديد من دورات التفاعل. جعل استخدامها من الممكن تبسيط وأتمتة PCR. تم عزل واحدة من أولى بلمرات الحمض النووي المقاومة للحرارة من البكتيريا ثيرموس أكواتيكوسواسمه طق- بوليميراز.

إن إمكانية تضخيم أي مقطع DNA معروف تسلسله النوكليوتيد ، والحصول عليه بعد PCR في شكل متجانس وكمية تحضيرية ، يجعل PCR طريقة بديلة للاستنساخ الجزيئي لشظايا DNA القصيرة. ليست هناك حاجة لتطبيق الأساليب المنهجية المعقدة التي يتم استخدامها في الهندسة الوراثيةمع الاستنساخ التقليدي. لقد أدى تطوير طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) إلى توسيع الإمكانات المنهجية لعلم الوراثة الجزيئية ، وعلى وجه الخصوص ، الهندسة الوراثية ، لدرجة أنها غيرت بشكل جذري وعززت الإمكانات العلمية للعديد من مجالاتها.

1.2 أنواع مختلفة من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

· متداخلة PCR- تستخدم لتقليل عدد المنتجات الثانوية للتفاعل. استخدم زوجين من البادئات وقم بإجراء تفاعلين متتاليين. يقوم الزوج الثاني من البادئات بتضخيم منطقة الحمض النووي داخل ناتج التفاعل الأول.

· PCR المقلوب- يُستخدم عند معرفة مساحة صغيرة فقط ضمن التسلسل المطلوب. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص عندما يكون من الضروري تحديد التسلسلات المجاورة بعد إدخال الحمض النووي في الجينوم. لتنفيذ PCR المقلوب ، يتم إجراء سلسلة من قطع الحمض النووي باستخدام إنزيمات تقييدية<#"justify">تفاعل البلمرة المتسلسل التمهيدي

· PCR الخاص بالمجموعة- PCR للأقارب<#"center">1.3 تفاعل البلمرة المتسلسل

اكتشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، الذي تم اكتشافه في منتصف الثمانينيات ، زيادة عدد نسخ العينة الأصلية بملايين المرات في غضون ساعات قليلة. خلال كل دورة من التفاعل ، يتم تكوين نسختين من الجزيء الأصلي. يمكن أن تعمل كل نسخة من نسخ الحمض النووي المركبة كقالب لتركيب نسخ DNA جديدة في الدورة التالية. وبالتالي ، يؤدي التكرار المتكرر للدورات إلى زيادة عدد النسخ في المتوالية الهندسية. ويترتب على الحسابات أنه حتى لو كان هناك 30 دورة ، فإن عدد نسخ الجزيء الأصلي سيكون أكثر من مليار. حتى لو أخذنا في الاعتبار أنه لا يتم تكرار جميع الأمبليونات خلال كل دورة ، فإن العدد الإجمالي للنسخ ، على الرغم من ذلك ، هو رقم كبير جدًا.

تتكون كل دورة من تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) من الخطوات التالية:

· التمسخ - تؤدي الزيادة في درجة الحرارة إلى انفكاك جزيء DNA مزدوج الشريطة وانقسامه إلى جزئين أحاديي الجديلة ؛

· التلدين - يسمح خفض درجة الحرارة للطلاء التمهيدي بالالتصاق بالمناطق التكميلية لجزيء الحمض النووي ؛

· الاستطالة - يكمل إنزيم بوليميراز الحمض النووي الخيط التكميلي.

لتضخيم الجزء المحدد ، يتم استخدام اثنين من بادئات قليلة النوكليوتيد (بذور) تحيط بمنطقة معينة من الحمض النووي. التمهيدي الموجهة 3 - ينتهي تجاه بعضهما البعض وفي اتجاه التسلسل الذي يحتاج إلى تضخيم. ينفذ بوليميراز الدنا تخليق (إتمام) سلاسل DNA التكميلية المتبادلة ، بدءًا من البادئات. أثناء تخليق الحمض النووي ، يتم إدخال البادئات فعليًا في سلسلة جزيئات الحمض النووي المركبة حديثًا. يمكن أن يعمل كل خيط من جزيء الحمض النووي باستخدام أحد البادئات كقالب لتركيب خيط DNA مكمل باستخدام التمهيدي الآخر.

1.4 إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنابيب اختبار خاصة رقيقة الجدران من مادة البولي بروبيلين ، متوافقة في الحجم مع جهاز التدوير الحراري المستخدم (مكبر الصوت) - وهو جهاز يتحكم في درجة الحرارة وخصائص الوقت لمراحل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) .

1.5 مبدأ طريقة تفاعل البلمرة المتسلسل

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو طريقة تضخيم الحمض النووي في المختبر والتي يمكنها عزل ومضاعفة تسلسل DNA معين بلايين المرات في غضون ساعات قليلة. إن القدرة على الحصول على عدد كبير من النسخ من منطقة محددة بدقة من الجينوم يبسط إلى حد كبير دراسة عينة الحمض النووي الموجودة.

لإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل ، يجب استيفاء عدد من الشروط:

1.5.1 وجود عدد من المكونات في خليط التفاعل

المكونات الرئيسية لخليط التفاعل (PCR) هي: Tris-HCl ، KCl ، MgCl 2، خليط من ثلاثي فوسفات النوكليوتيدات (ATP ، GTP ، CTP ، TTP) ، مواد أولية (oligonucleotides) ، تحضير DNA المحلل ، بوليميراز DNA القابل للحرارة. يشارك كل مكون من مكونات خليط التفاعل بشكل مباشر في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) ، ويؤثر تركيز الكواشف بشكل مباشر على مسار التضخيم.

· Tris-HCl - يحدد الرقم الهيدروجيني لخليط التفاعل ، ويخلق سعة عازلة. يعتمد نشاط بوليميريز الحمض النووي على الرقم الهيدروجيني للوسط ، وبالتالي فإن قيمة الرقم الهيدروجيني تؤثر بشكل مباشر على مسار تفاعل البلمرة المتسلسل. عادة ما تكون قيمة الأس الهيدروجيني في حدود 8 - 9.5. قيمة عاليةيؤخذ الرقم الهيدروجيني من حقيقة أنه مع ارتفاع درجة الحرارة ، ينخفض ​​الرقم الهيدروجيني لعزل Tril-HCl.

· KCl - يؤثر تركيز كلوريد البوتاسيوم حتى 50 مم على مسار عمليات التمسخ والصلب ، حيث يثبط التركيز فوق 50 مم بوليميريز الحمض النووي.

· MgCl 2- لأن بوليميراز DNA هو Mg 2+- الانزيم المعتمد فان تركيز ايونات المغنيسيوم يؤثر على نشاط الانزيم (Mg 2+تشكل مجمعات مع NTP - هذه المجمعات هي الركيزة للبوليميراز). يؤدي التركيز العالي إلى زيادة التضخيم غير المحدد ، ويؤدي التركيز المنخفض إلى تثبيط التفاعل ، ويكون المستوى الأمثل (للبوليميرات المختلفة) في حدود 0.5 - 5 ملي مولار. بالإضافة إلى ذلك ، يؤثر تركيز أملاح المغنيسيوم على مسار عمليات التمسخ والتلدين - زيادة في تركيز المغنيسيوم. 2+يسبب زيادة في درجة حرارة انصهار الحمض النووي (أي درجة الحرارة التي يتم عندها تقسيم 50٪ من خيوط الحمض النووي مزدوجة الشريطة إلى خيوط أحادية الجديلة).

· NTP - نوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات هي مونومرات مباشرة للأحماض النووية. لمنع إنهاء السلسلة ، يوصى بنسبة متساوية لجميع النوكليوتيدات الأربعة. يزيد التركيز المنخفض لهذه المكونات في خليط التفاعل من احتمال حدوث أخطاء في بناء خيط DNA التكميلي.

· البادئات - الأفضل هو استخدام البادئات مع اختلاف درجة انصهار لا يزيد عن 2-4 ا C. في بعض الأحيان متى تخزين طويل المدىعند درجة الحرارة 4 ا ج ، أو بعد عدد كبير من تجميد الذوبان تتشكل الاشعال الهياكل الثانوية- ديمرز ، مما يقلل من كفاءة PCR. يتم تقليل القضاء على هذه المشكلة إلى الحضانة في حمام مائي (T = 95 ا ج) لمدة 3 دقائق ثم تبريد سريع لاحق إلى 0 درجة مئوية مع.

· مستحضرات الحمض النووي - تؤثر كمية ونوعية تحضير الحمض النووي (المصفوفة) بشكل مباشر على مسار ومعلمات تفاعل البلمرة المتسلسل. تثبط عينة الحمض النووي الزائدة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). الشوائب مواد مختلفة، الموجودة في تحضير الحمض النووي ، يمكن أيضًا أن تقلل من كفاءة تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR): أسيتات الصوديوم ، كلوريد الصوديوم ، الأيزوبروبانول ، الإيثانول ، الهيبارين ، الفينول ، اليوريا ، الهيموجلوبين ، إلخ.

· بوليميريز الحمض النووي - عند استخدام كمية صغيرة من بوليميريز الحمض النووي ، لوحظ انخفاض في التوليف المنتج النهائييتناسب طرديا مع حجم الشظايا. تؤدي زيادة البوليميراز بمقدار 2-4 مرات إلى ظهور أطياف منتشرة ، وبنسبة 4-16 مرة ، أطياف منخفضة الوزن الجزيئي غير محددة. مدى التركيزات المستخدمة هو 0.5 - 1.5 وحدة من النشاط من حيث 25 ميكرولتر من خليط PCR.

بالإضافة إلى المكونات الرئيسية لخليط PCR ، يتم استخدام عدد من المواد الإضافية التي تعمل على تحسين المؤشرات النوعية والكمية لـ PCR: أسيتاميد (5 ٪) - زيادة في قابلية ذوبان المكونات الرئيسية ؛ البيتين (ملح الصوديوم) - تثبيت بوليميراز الحمض النووي ، وخفض نقطة انصهار الحمض النووي ، ومعادلة نقطة الانصهار ؛ الزلال البقري (10-100 ميكروغرام / مل) - استقرار بوليميريز الحمض النووي ؛ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (1-10٪) - زيادة قابلية ذوبان المكونات الرئيسية ؛ فورماميد (2-10٪) - زيادة في خصوصية التلدين ؛ الجلسرين (15-20 ٪) - زيادة في الاستقرار الحراري للإنزيم ، وانخفاض درجة حرارة تمسخ عينة الحمض النووي ؛ كبريتات الأمونيوم - خفض درجة حرارة التمسخ والصلب.

1.5.2 الدورة ودرجة الحرارة

الشكل العامبرامج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هي كما يلي:

منصة. التمسخ الأولي لفترات طويلة من دورة إعداد الحمض النووي

منصة. التمسخ السريع لتحضير الحمض النووي. التلدين التمهيدي. استطالة 30-45 دورة.

منصة. استطالة طويلة. تبريد خليط التفاعل دورة واحدة.

كل عنصر من عناصر المرحلة - التمسخ ، التلدين ، الاستطالة - له خصائص فردية لدرجة الحرارة والوقت. يتم تحديد معلمات درجة الحرارة ووقت التدفق لكل عنصر بشكل تجريبي ، وفقًا للمؤشرات النوعية والكمية لمنتجات التضخيم.

تمسخ. خلال هذا العنصر من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ينقسم جزيء DNA مزدوج الشريطة إلى جزئين أحاديي السلسلة. معلمات درجة الحرارة للتمسخ في حدود 90-95 ا C ، ولكن في حالة عينة الحمض النووي التي تحتوي على نسبة عالية من الجوانين والسيتوزين ، يجب زيادة درجة الحرارة إلى 98 ا يجب أن تكون درجة حرارة التمسخ كافية للتلف تمامًا - تشق خيوط الحمض النووي وتجنب "التبريد المفاجئ" أو التلدين السريع ، ومع ذلك ، فإن بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة يكون أقل استقرارًا في درجات الحرارة المرتفعة. وبالتالي ، فإن اختيار معلمات درجة حرارة التمسخ المثلى لنسبة التمهيدي / العينة (إعداد الحمض النووي) هو حالة مهمةأثناء التضخيم. إذا كانت درجة حرارة التمسخ في الخطوة الأولى أعلى من 95 ا C ، يوصى بإضافة بوليميراز DNA إلى خليط التفاعل بعد التمسخ الأولي. يجب أن تكون مدة هذا العنصر من المرحلة أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) كافية لتمسخ الحمض النووي بالكامل ، ولكن في نفس الوقت لا تؤثر بشكل كبير على نشاط بوليميريز الحمض النووي عند درجة حرارة معينة.

التلدين. درجة حرارة التلدين (T. أ ) أحد أهم عوامل تفاعل البلمرة المتسلسل. يتم تحديد درجة حرارة التلدين لكل أساس على حدة. يعتمد ذلك على طول وتكوين النيوكليوتيدات في التمهيدي. عادة ما يكون أقل بمقدار 2-4 ا من قيمة نقطة الانصهار (T م ) التمهيدي. إذا كانت درجة حرارة التلدين للنظام أقل من المستوى الأمثل ، فإن عدد الأجزاء المضخمة غير المحددة يزداد ، وعلى العكس من ذلك ، تقلل درجة الحرارة الأعلى من عدد المنتجات المضخمة. في هذه الحالة ، يمكن أن ينخفض ​​تركيز الأمبليكونات المحددة بشكل حاد ، حتى تثبيط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تؤدي زيادة وقت التلدين أيضًا إلى زيادة عدد الأمبليكونات غير المحددة.

استطالة. عادةً ما يكون لكل نوع من بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة درجة حرارة فردية مثالية للنشاط. معدل تخليق خيط DNA مكمل بواسطة إنزيم هو أيضًا قيمة خاصة بكل بوليميراز (في المتوسط ​​، يكون 30-60 نيوكليوتيدًا في الثانية ، أو 1-2 ألف قاعدة في الدقيقة) ، لذلك يتم تحديد وقت الاستطالة اعتمادًا على على نوع DNA polymerase وطول المنطقة المضخمة.

1.5.3 المبادئ الأساسية لاختيار التمهيدي

عند إنشاء نظام اختبار PCR ، تتمثل إحدى المهام الرئيسية في الاختيار الصحيح للبادئات التي يجب أن تستوفي عددًا من المعايير:

يجب أن تكون البرايمرات محددة. يتم إيلاء اهتمام خاص لـ 3 - نهايات البادئات ، حيث يبدأ طاق بوليميراز منها في إكمال سلسلة الحمض النووي التكميلية. إذا كانت خصوصيتها غير كافية ، فمن المحتمل أن تحدث عمليات غير مرغوب فيها في أنبوب الاختبار مع خليط التفاعل ، أي تخليق الحمض النووي غير المحدد (شظايا قصيرة أو طويلة). يمكن رؤيته في الرحلان الكهربائي على شكل نطاقات إضافية ثقيلة أو خفيفة. هذا يجعل من الصعب تقييم نتائج التفاعل ، لأنه من السهل الخلط بين منتج تضخيم معين والحمض النووي الأجنبي المركب. يتم استهلاك جزء من البادئات و dNTPs لتخليق الحمض النووي غير المحدد ، مما يؤدي إلى فقدان كبير للحساسية.

لا ينبغي أن تشكل مواد التمهيدي ثنائيات وحلقات ، أي لا ينبغي تشكيل خيوط مزدوجة مستقرة عن طريق صلب الاشعال لأنفسهم أو لبعضهم البعض.

1.5.4 تأثير الهضبة

وتجدر الإشارة إلى أن عملية تراكم منتجات تضخيم محددة بشكل كبير تستغرق وقتًا محدودًا فقط ، ومن ثم تنخفض كفاءتها بشكل كبير. ويرجع ذلك إلى ما يسمى بتأثير "الهضبة".

تأثير المدى هضبة تستخدم لوصف عملية تراكم نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل في دورات التضخيم الأخيرة.

اعتمادًا على الظروف وعدد دورات تفاعل التضخيم ، في وقت تحقيق التأثير هضبة استخدام الركائز (dNTPs والبادئات) ، واستقرار المواد المتفاعلة (dNTPs والإنزيم) ، وكمية المثبطات ، بما في ذلك البيروفوسفات ومزدوجات الحمض النووي ، والتنافس على المواد المتفاعلة مع المنتجات غير المحددة أو الثنائيات الأولية ، وتركيز منتج معين ، والتمسخ غير الكامل بتركيزات عالية من منتجات التضخيم.

كلما انخفض التركيز الأولي للحمض النووي المستهدف ، زادت مخاطر التفاعل هضبة ". يمكن أن تحدث هذه النقطة قبل أن يكون عدد نواتج التضخيم المحددة كافيًا لتحليلها ، ولا يمكن تجنب ذلك إلا من خلال أنظمة الاختبار المُحسَّنة جيدًا.

1.5.5 تحضير عينة من المواد البيولوجية

يتم استخدام تقنيات مختلفة لاستخراج الحمض النووي ، اعتمادًا على المهام. يكمن جوهرها في استخراج (استخراج) الحمض النووي من منتج بيولوجي وإزالة أو تحييد الشوائب الأجنبية للحصول على تحضير DNA بنقاء مناسب لـ PCR.

تعتبر طريقة الحصول على تحضير DNA النقي ، التي وصفها Marmur ، قياسية وأصبحت بالفعل كلاسيكية. ويشمل التحلل البروتيني الأنزيمي يليه نزع البروتين وإعادة ترسيب الحمض النووي بالكحول. تتيح هذه الطريقة الحصول على تحضير DNA نقي. ومع ذلك ، فهو شاق للغاية وينطوي على العمل مع مواد عدوانية ونفاذة مثل الفينول والكلوروفورم.

إحدى الطرق الشائعة حاليًا هي طريقة استخراج الحمض النووي التي اقترحها Boom et al. تعتمد هذه الطريقة على استخدام عامل تشوتروبي قوي ، غوانيدين ثيوسيانات (GuSCN) ، لتحلل الخلايا ، وامتصاص الحمض النووي اللاحق على الناقل (خرز زجاجي ، تراب دياتومي ، حليب زجاجي ، إلخ). بعد الغسيل ، يبقى الحمض النووي في العينة الممتصة على الناقل ، ويمكن إزالته بسهولة باستخدام محلول شطف. الطريقة مريحة ومتقدمة تقنيًا ومناسبة لتحضير العينة للتضخيم. ومع ذلك ، فإن فقد الحمض النووي ممكن بسبب الامتصاص الذي لا رجعة فيه على الناقل ، وكذلك أثناء عمليات الغسل العديدة. هذا مهم بشكل خاص عند العمل بكميات صغيرة من الحمض النووي في العينة. علاوة على ذلك ، حتى الكميات الضئيلة من GuSCN يمكن أن تمنع تفاعل البوليميراز المتسلسل. لذلك ، عند استخدام هذه الطريقة ، يكون الاختيار الصحيح للمادة الماصة والمراعاة الدقيقة للفروق التكنولوجية أمرًا مهمًا للغاية.

تعتمد مجموعة أخرى من طرق تحضير العينات على استخدام المبادلات الأيونية من نوع Chilex ، والتي ، على عكس الزجاج ، لا تمتص الحمض النووي ، ولكن بالعكس ، الشوائب التي تتداخل مع التفاعل. كقاعدة عامة ، تتضمن هذه التقنية مرحلتين: غليان العينة وامتصاص الشوائب في المبادل الأيوني. الطريقة جذابة للغاية بسبب بساطتها في التنفيذ. في معظم الحالات ، يكون مناسبًا للعمل مع المواد السريرية. لسوء الحظ ، توجد أحيانًا عينات بها شوائب لا يمكن إزالتها باستخدام المبادلات الأيونية. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن تدمير بعض الكائنات الحية الدقيقة عن طريق الغليان البسيط. في هذه الحالات ، من الضروري إدخال مراحل إضافية لمعالجة العينات.

وبالتالي ، يجب التعامل مع اختيار طريقة تحضير العينة بفهم أغراض التحليلات المقصودة.

1.5.6 التضخيم

لإجراء تفاعل التضخيم ، من الضروري تحضير خليط التفاعل وإضافة عينة الحمض النووي التي تم تحليلها إليه. في هذه الحالة ، من المهم مراعاة بعض ميزات التلدين التمهيدي. والحقيقة هي أنه ، كقاعدة عامة ، في العينة البيولوجية التي تم تحليلها ، توجد جزيئات DNA مختلفة ، والتي تحتوي البادئات المستخدمة في التفاعل على تماثل جزئي ، وفي بعض الحالات مهم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تصلب البرايمر مع بعضها البعض لتشكيل ثنائيات التمهيدي. كلاهما يؤدي إلى استهلاك كبير من المواد الأولية لتركيب منتجات تفاعل جانبية (غير محددة) ، ونتيجة لذلك ، يقلل بشكل كبير من حساسية النظام. هذا يجعل من الصعب أو المستحيل قراءة نتائج التفاعل أثناء الرحلان الكهربي.

1.6 تكوين خليط تفاعل PCR القياسي

x عازلة PCR (100 ملي محلول Tris-HCl ، الرقم الهيدروجيني 9.0 ، 500 ملي محلول بوكل ، 25 ملي مولار محلول MgCl2 ) ……. 2.5 ميكرولتر

المياه (ملي كيو) ................................................................................................................... 18.8 لتر

خليط من النوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات (dNTPs)

ملي حل لكل ……………………………………………. ……… .0.5 ميكرولتر

التمهيدي 1 (10 ملي محلول) ………………………………………….… .1 ميكرولتر

التمهيدي 2 (10 ملي محلول) …………………………………………….… .1 ميكرولتر

بوليميراز الحمض النووي (5 وحدات / ميكرولتر) ................................................................... 0.2 ميكرولتر

عينة الحمض النووي (20 نانوغرام / ميكرولتر) …………………………………………… .. 1 ميكرولتر

1.7 تقييم نتائج التفاعل

من أجل تقييم نتائج PCR بشكل صحيح ، من المهم أن نفهم أن هذه الطريقة ليست كمية. من الناحية النظرية ، يمكن الكشف عن منتجات التضخيم لجزيئات الحمض النووي الفردية المستهدفة عن طريق الرحلان الكهربائي بالفعل بعد 30-35 دورة. ومع ذلك ، في الممارسة العملية ، يتم ذلك فقط في الحالات التي يحدث فيها رد الفعل في ظل ظروف قريبة من المثالية ، والتي لا تحدث غالبًا في الحياة. درجة نقاء تحضير الحمض النووي لها تأثير كبير بشكل خاص على كفاءة التضخيم ؛ وجود مثبطات معينة في خليط التفاعل والتي يصعب التخلص منها في بعض الحالات. في بعض الأحيان ، بسبب وجودها ، لا يمكن تضخيم حتى عشرات الآلاف من جزيئات الحمض النووي المستهدفة. وبالتالي ، لا توجد غالبًا علاقة مباشرة بين المقدار الأولي من الحمض النووي المستهدف والكمية النهائية لمنتجات التضخيم.

الفصل 2: ​​تطبيقات تفاعل البلمرة المتسلسل

يستخدم PCR في العديد من المجالات للتحليل والتجارب العلمية.

علم الإجرام

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمقارنة ما يسمى "بصمات الأصابع الجينية". نحتاج إلى عينة من مادة وراثية من مسرح الجريمة - دم ، لعاب ، سائل منوي ، شعر ، إلخ. تتم مقارنتها مع المادة الوراثية للمشتبه به. كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي تكفي نظريًا - نسخة واحدة. يتم تقطيع الحمض النووي إلى أجزاء ، ثم تضخيمه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم فصل الأجزاء بواسطة الرحلان الكهربائي للحمض النووي. تسمى الصورة الناتجة لموقع نطاقات الحمض النووي بالبصمة الجينية.

إثبات الأبوة

نتائج الرحلان الكهربائي لشظايا الحمض النووي التي تم تضخيمها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). أب. طفل. الأم. ورث الطفل بعض سمات البصمة الجينية لكلا الوالدين ، مما أعطى بصمة جديدة وفريدة من نوعها.

على الرغم من أن "البصمات الجينية" فريدة من نوعها ، إلا أنه لا يزال من الممكن إنشاء روابط عائلية من خلال عمل العديد من هذه البصمات. يمكن تطبيق نفس الطريقة ، مع تعديلات طفيفة ، لتأسيس علاقات تطورية بين الكائنات الحية.

التشخيصات الطبية

يجعل PCR من الممكن تسريع وتسهيل تشخيص وراثي و أمراض فيروسية. يتم تضخيم الجين المعني عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات المناسبة ثم تسلسله لتحديد الطفرات. اصابات فيروسيةيمكن الكشف عنها مباشرة بعد الإصابة ، قبل أسابيع أو شهور من ظهور أعراض المرض.

طب شخصي

في بعض الأحيان تكون الأدوية سامة أو مسببة للحساسية لبعض المرضى. تعود أسباب ذلك جزئيًا إلى الفروق الفردية في القابلية للتأثر بالأدوية ومشتقاتها واستقلابها. يتم تحديد هذه الاختلافات على المستوى الجيني. على سبيل المثال ، في مريض واحد ، قد يكون السيتوكروم أكثر نشاطًا ، في مريض آخر - أقل. من أجل تحديد نوع السيتوكروم هذا المريض، يُقترح إجراء تحليل PCR قبل استخدام الدواء. يسمى هذا التحليل التنميط الجيني الأولي.

استنساخ الجينات

الاستنساخ الجيني هو عملية عزل الجينات ، ونتيجة للتلاعب بالهندسة الوراثية ، الحصول على كمية كبيرة من منتج جين معين. يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الجين ، والذي يتم إدخاله بعد ذلك في ناقل ، قطعة من الحمض النووي تحمل الجين الغريب إلى نفس الكائن الحي أو كائن حي آخر يسهل نموه. كنواقل ، على سبيل المثال ، يتم استخدام البلازميدات أو الحمض النووي الفيروسي. عادةً ما يستخدم إدخال الجينات في كائن غريب للحصول على منتج من هذا الجين - RNA أو بروتين في أغلب الأحيان. بهذه الطريقة ، يتم الحصول على العديد من البروتينات بكميات صناعية لاستخدامها في زراعةوالطب وما إلى ذلك.

تسلسل الحمض النووي

في طريقة التسلسل باستخدام الفلورسنت المسمى أو النظير المشع dideoxynucleotides PCR هو جزء لا يتجزأ ، لأنه أثناء البلمرة يتم إدخال مشتقات النيوكليوتيدات الموصوفة بعلامة الفلورسنت أو المشعة في سلسلة DNA. هذا يوقف التفاعل ، مما يسمح بتحديد مواضع نيوكليوتيدات معينة بعد فصل الخيوط المركبة في الهلام.

الطفرات

حاليًا ، أصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الطريقة الرئيسية للطفرات. أتاح استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تبسيط وتسريع إجراء الطفرات ، فضلاً عن جعله أكثر موثوقية وقابلية للتكاثر.

أتاحت طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل تحليل وجود متواليات فيروس الورم الحليمي البشري في أقسام خزعات من أورام عنق الرحم البشرية المضمنة في البارافين قبل 40 عامًا من هذه الدراسة. علاوة على ذلك ، بمساعدة PCR ، كان من الممكن تضخيم واستنساخ أجزاء من الحمض النووي للميتوكوندريا من البقايا الأحفورية للدماغ البشري البالغ من العمر 7 آلاف عام!

في lysates من الحيوانات المنوية البشرية الفردية ، تم إثبات إمكانية التحليل المتزامن لموقعين موجودين على كروموسومات غير متجانسة مختلفة. يوفر هذا النهج فرصة فريدة للتحليل الجيني الدقيق ودراسة إعادة التركيب الكروموسومي ، وتعدد أشكال الحمض النووي ، وما إلى ذلك. وجدت طريقة تحليل الحيوانات المنوية الفردية على الفور تطبيقًا عمليًا في الطب الشرعي، نظرًا لأن تصنيف HLA للخلايا الفردية يجعل من الممكن تحديد الأبوة أو التعرف على مجرم (مجمع HLA هو مجموعة من الجينات لمركب التوافق النسيجي الرئيسي للإنسان ؛ موقع مجمع HLA هو الأكثر تعددًا من جميع الأنواع المعروفة في الفقاريات العليا: داخل الأنواع ، في كل موضع ، يوجد عدد كبير بشكل غير عادي من الأليلات المختلفة - أشكال بديلة من نفس الجين).

باستخدام PCR ، من الممكن تحديد مدى صحة تكامل الهياكل الوراثية الأجنبية في منطقة محددة مسبقًا من جينوم الخلايا المدروسة. يتم تلدين الحمض النووي الخلوي الكلي باستخدام اثنين من بادئات قليلة النوكليوتيد ، أحدهما مكمل لموقع DNA المضيف بالقرب من نقطة الإدخال ، والآخر لتسلسل الجزء المتكامل في خيط DNA المضاد للتوازي. يؤدي تفاعل البوليميراز المتسلسل في حالة بنية DNA الكروموسومية غير المتغيرة في موقع الإدخال المقترح إلى تكوين شظايا DNA أحادية الجديلة ذات حجم غير محدد ، وفي حالة الإدخال المخطط ، شظايا DNA مزدوجة الجديلة من عنصر معروف الحجم ، الذي تحدده المسافة بين مواقع التلدين للاثنين من البادئات. علاوة على ذلك ، فإن درجة تضخيم المنطقة التي تم تحليلها من الجينوم في الحالة الأولى ستعتمد خطيًا على عدد الدورات ، وفي الحالة الثانية - أسيًا. إن التراكم الأسي خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل لجزء مضخم من حجم محدد مسبقًا يجعل من الممكن ملاحظته بصريًا بعد التجزئة الكهربي لتحضير الحمض النووي والتوصل إلى استنتاج لا لبس فيه حول إدخال تسلسل غريب في منطقة معينة من الحمض النووي الصبغي.

خاتمة

طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل هي الأكثر استخدامًا حاليًا كوسيلة لتشخيص الأمراض المعدية المختلفة. يسمح لك تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بتحديد مسببات العدوى ، حتى لو كانت العينة المأخوذة للتحليل تحتوي فقط على عدد قليل من جزيئات الحمض النووي للعامل الممرض. يستخدم PCR على نطاق واسع في التشخيص المبكرعدوى فيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الفيروسي ، إلخ. حتى الآن ، لا يوجد عامل معدي تقريبًا لا يمكن اكتشافه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل.

قائمة الأدب المستخدم

1.Padutov V.E. ، Baranov O.Yu. ، Voropaev E.V. طرق التحليل الجيني الجزيئي. - مينسك: يونيبول ، 2007. - 176 ص.

2.PCR "في الوقت الفعلي" / Rebrikov D.V.، Samatov G.A.، Trofimov D.Yu. وإلخ.؛ إد. ب. ن. د. ريبريكوف. مقدمة لوس انجليس أوسترمان وأكاد. RAS و RAAS E.D. سفيردلوف. الطبعة الثانية ، مراجعة. وإضافية - م: بينوم. مختبر المعرفة 2009. - 223 ص.

.باتروشيف ل. أنظمة وراثية اصطناعية. - م: نووكا 2005. - 2 طن

.B. Glick ، ​​J. Pasternak Molecular Biotechnology. المبادئ والتطبيق 589 صفحة 2002

5.Shchelkunov S.N. الهندسة الوراثية. - نوفوسيبيرسك: Sib. جامعة. دار النشر ، 2004. - 496 ص.

حرره أ. فوربييفا "تفاعل البلمرة المتسلسل وتطبيقاته في التشخيص في طب الجلد" ؛ وكالة الأنباء الطبية - 72 صفحة

المتشعب: // ru. wikipedia.org

http: // الباحث. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. هتم

12.http: // prizvanie. سو / - مجلة طبية

دروس خصوصية

بحاجة الى مساعدة في تعلم موضوع؟

سيقوم خبراؤنا بتقديم المشورة أو تقديم خدمات التدريس حول الموضوعات التي تهمك.
قم بتقديم طلبمع الإشارة إلى الموضوع الآن لمعرفة إمكانية الحصول على استشارة.

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)

جوهر طريقة PCR. بوليميريز الحمض النووي

تفاعل البلمرة المتسلسل هو طريقة تجريبية للبيولوجيا الجزيئية تسمح بتحقيق زيادة ملحوظة في التركيزات المنخفضة لشظايا حمض نووي معين في المواد البيولوجية. تسمى هذه العملية لزيادة عدد نسخ الحمض النووي تضخيم. يتم نسخ الحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة إنزيم خاص - بوليميراز.إن إنزيم DNA polymerase (الشكل 3) هو إنزيم يشارك في تكرار (تضخيم الحمض النووي في الكائنات الحية) للحمض النووي. تحفز إنزيمات هذه الفئة بلمرة ديوكسي ريبونوكليوتيدات على طول سلسلة نيوكليوتيدات الحمض النووي ، والتي "يقرأها" الإنزيم ويستخدمها كقالب. يتم تحديد نوع النيوكليوتيدات الجديدة من خلال مبدأ التكامل مع القالب الذي تتم القراءة منه.

يضيف بوليميراز الدنا نيوكليوتيدات حرة إلى الطرف 3 "من السلسلة المجمعة. وهذا يؤدي إلى استطالة السلسلة في اتجاه 5" -3. لا يمكن لأي من بوليمرات الحمض النووي المعروفة إنشاء سلسلة "من نقطة الصفر": قادرة فقط على إضافة النيوكليوتيدات إلى مجموعة الهيدروكسيل 3 الموجودة بالفعل. لهذا السبب ، يحتاج DNA polymerase التمهيدي- تسلسل قصير من النيوكليوتيدات (عادة 20-25) ، مكمل للأقسام النهائية من الجين قيد الدراسة - والتي يمكن أن تضيف إليها أول نيوكليوتيدات. تتكون البادئات دائمًا من قواعد DNA و RNA ، حيث تكون أول قاعدتين دائمًا قواعد RNA. يتم تصنيع مواد التمهيدي بواسطة إنزيم آخر - بريماز. إنزيم آخر هو هيليكس- ضروري لفك الحلزون المزدوج للحمض النووي بتكوين هيكل أحادي السلسلة ، مما يضمن تكرار كلا الخيطين وفقًا للنموذج شبه المحافظ لتكرار الحمض النووي.

تمتلك بعض بوليميرات الدنا أيضًا القدرة على تصحيح الأخطاء في خيط الدنا المُجمَّع حديثًا. إذا تم الكشف عن زوج غير صحيح من النيوكليوتيدات ، فإن بوليميراز الحمض النووي يتراجع خطوة واحدة ، ويزيل النيوكليوتيدات الخاطئة من السلسلة ، ثم يُدخل النوكليوتيد الصحيح في مكانه ، وبعد ذلك يستمر النسخ المتماثل كالمعتاد.

إجراء PCR

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو طريقة تضخيم الحمض النووي التي يمكنها عزل ومضاعفة تسلسل DNA معين بلايين المرات في غضون ساعات قليلة. إن القدرة على الحصول على عدد كبير من النسخ من منطقة محددة بدقة من الجينوم يبسط إلى حد كبير دراسة عينة الحمض النووي الموجودة.

لحدوث تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يجب استيفاء عدد من الشروط. بالنسبة لـ PCR ، في أبسط الحالات ، تكون المكونات التالية مطلوبة:

قالب DNA يحتوي على قسم DNA المراد تضخيمه.

اثنان من البادئات مكملان لنهايات الجزء المطلوب. (زوج من قليل النوكليوتيدات المُصنَّع صناعياً ، يتراوح حجمه عادةً من 15 إلى 30 نقطة أساس ، وهو مطابق للمناطق المقابلة من الحمض النووي المستهدف. ويلعبان دورًا رئيسيًا في تكوين نواتج تفاعل التضخيم. تضمن البادئات المختارة بشكل صحيح خصوصية الاختبار وحساسيته نظام.)

بوليميراز الحمض النووي بالحرارة. يجب أن يظل البوليميراز المستخدم في تفاعل البوليميراز المتسلسل نشطًا عند درجة حرارة عالية منذ وقت طويللذلك ، يتم استخدام الإنزيمات المعزولة من الحرارة - Thermus aquaticus (Taq polymerase) وغيرها.

ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dATP ، dGTP ، dCTP ، dTTP).

Mg 2+ أيونات ضرورية لكي يعمل البوليميراز.

توفير حل عازلة الشروط اللازمةردود الفعل - درجة الحموضة ، القوة الأيونية للمحلول. يحتوي على أملاح ، مصل الألبومين.

لتجنب تبخر خليط التفاعل ، يضاف زيت عالي الغليان ، مثل الفازلين ، إلى أنبوب الاختبار. إذا تم استخدام جهاز بغطاء ساخن ، فهذا غير مطلوب.

يمكن أن تؤدي إضافة بيروفوسفاتيز إلى زيادة محصول تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل. يحفز هذا الإنزيم التحلل المائي للبيروفوسفات ، وهو منتج ثانوي لإضافة النوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات إلى حبلا الحمض النووي المتنامي ، إلى الأورثوفوسفات. يمكن أن يثبط بيروفوسفات تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل.

لمضاعفة عدد نسخ الحمض النووي الأصلي ، يلزم إجراء تفاعل دوري. كقاعدة عامة ، تتكون كل دورة من دورات PCR المتكررة بالتسلسل من ثلاث مراحل:

1. تمسخ أو "ذوبان" الحمض النووي.يتم تسخين قالب DNA مزدوج الشريطة إلى 94-96 درجة مئوية (أو 98 درجة مئوية إذا تم استخدام بوليميريز خاص بالحرارة) لمدة 0.5 - 2 دقيقة للسماح بفصل خيوط الحمض النووي. هذه الخطوة تسمى تمسخ لأن الروابط الهيدروجينية بين شريطين من الحمض النووي مكسورة. في بعض الأحيان ، قبل الدورة الأولى (قبل إضافة البوليميراز) ، يتم تسخين خليط التفاعل مسبقًا لمدة 2-5 دقائق لإفساد القالب والبادئات تمامًا. هذا النهج يسمى بداية ساخنة، فإنه يسمح بتقليل كمية منتجات التفاعل غير المحددة.

2. التلدين - ربط المواد الأولية بقالب الحمض النووي. بمجرد فصل الخيوط ، يتم خفض درجة الحرارة ببطء للسماح للطلاء التمهيدي بالارتباط بالقالب المفرد الذي تقطعت بهم السبل. تعتمد درجة حرارة التلدين على تركيبة التمهيدي وعادة ما يتم اختيارها عند 50-65 درجة مئوية. وقت المرحلة - 20-60 ثانية. اختيار غير صحيحتؤدي درجة حرارة التلدين إما إلى ضعف ارتباط البادئات بالقالب (عند درجة حرارة مرتفعة) ، أو إلى الارتباط في المكان الخطأ وظهور منتجات غير محددة (عند درجة حرارة منخفضة).

3. توليف (استطالة السلسلة).يقوم بوليميراز الدنا بتكرار خيط القالب باستخدام التمهيدي كـ "بذرة". يبدأ البوليميراز تخليق الشريط الثاني من الطرف 3 بوصات من التمهيدي ، والذي يرتبط بالقالب ويتحرك على طول القالب. تعتمد درجة حرارة الاستطالة على البوليميراز. تكون بوليميراز Taq و Pfu الأكثر نشاطًا عند 72 درجة مئوية.طول الجزء المطلوب تضخيمه عادةً ، يؤخذ وقت الاستطالة ليكون دقيقة واحدة لكل ألف زوج أساسي بعد الانتهاء من جميع الدورات ، غالبًا ما يتم تنفيذ خطوة إضافية استطالة نهائيةلإكمال جميع الأجزاء التي تقطعت بهم السبل. تستمر هذه المرحلة من 7 إلى 10 دقائق.

بعد ذلك ، تتكرر مراحل التمسخ والصلب والاستطالة عدة مرات (30 مرة أو أكثر). في كل دورة ، يتضاعف عدد النسخ المركبة من جزء الحمض النووي.

يتم إجراء جميع التفاعلات في أنابيب اختبار مغمورة في منظم حرارة. يتم تغيير نظام درجة الحرارة وصيانته تلقائيًا.

لفهم بالضبط كيف يحدث تضخيم جزء معين من الحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، من الضروري أن نفهم بوضوح موضع جميع البادئات وتسلسلاتها التكميلية في السلاسل القابلة للتضخيم في كل جولة. في الجولة الأولى ، تكون كل سلسلة من السلاسل المصنعة حديثًا أطول بكثير من المسافة من مجموعة الهيدروكسيل 3 بوصات من مادتها الأولية إلى النوكليوتيدات الطرفية للتسلسل التكميلي للجزء التمهيدي الثاني. وتسمى هذه السلاسل "القوالب الطويلة" ، عليهم أن يتم التوليف الإضافي.

في الجولة الثانية ، يتم تغيير طبيعة الحمض النووي مزدوج الشريطة ، والذي يتكون من خيوط متشابهة ومُصنَّعة حديثًا (قالب طويل) ، ثم يتم تلدينها باستخدام مواد أولية. أثناء التركيب في هذه الجولة ، يتم تصنيع "القوالب الطويلة" مرة أخرى ، بالإضافة إلى عدد من الخيوط مع مادة أولية في أحد طرفيها وبتسلسل مكمل للطبقة الثانية في الطرف الآخر ("القوالب القصيرة"). خلال الجولة الثالثة ، يتم تغيير طبيعة جميع التكوينات غير المتجانسة المتشكلة في وقت سابق وتصلبها باستخدام مواد أولية ، ثم يتم تكرارها. في الجولات اللاحقة ، هناك المزيد والمزيد من "المصفوفات القصيرة" ، وبحلول الجولة الثلاثين ، يكون عددها بالفعل 10 ست مرات أكبر من عدد السلاسل الأولية أو "المصفوفات الطويلة".

كمية منتج التفاعل المحدد (مقيدة بالبادئات) تزداد نظريًا بالتناسب مع 2 ن ، حيث n هو عدد دورات التفاعل. في الحقيقة كفاءة كل دورة يمكن أن تكون أقل من 100٪ ، لذلك في الواقع:

حيث P هي كمية المنتج ، E هي متوسط ​​كفاءة الدورة.

ينمو عدد نسخ الحمض النووي "الطويلة" أيضًا ، ولكن بشكل خطي ، لذلك تهيمن قطعة معينة في نواتج التفاعل. إن نمو المنتج المطلوب مقيد بشكل كبير بكمية الكواشف ووجود المثبطات وتشكيل المنتجات الثانوية.

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل طريقة شديدة الحساسية ، لذلك ، إذا كان هناك حتى كمية ضئيلة من الحمض النووي في عينة الاختبار التي انتقلت عن طريق الخطأ من خليط تفاعل إلى آخر ، فيمكن الحصول على نتائج إيجابية خاطئة. هذا يجعل من الضروري التحكم بعناية في جميع الحلول والأواني المستخدمة في PCR.

المبادئ الأساسية لاختيار التمهيدي.

عند إنشاء نظام اختبار PCR ، تتمثل إحدى المهام الرئيسية في الاختيار الصحيح للبادئات التي يجب أن تستوفي عددًا من المعايير:

1. يجب أن تكون البرايمرات محددة. يتم إيلاء اهتمام خاص للنهايات الثلاثة للبادئات ، حيث يبدأ منها Taq polymerase لإكمال سلسلة DNA التكميلية. إذا كانت خصوصيتها غير كافية ، فمن المرجح أن تحدث العمليات غير المرغوب فيها في أنبوب الاختبار مع خليط التفاعل وهي تخليق الحمض النووي غير النوعي (شظايا قصيرة أو طويلة) ، ويكون مرئيًا على الرحلان الكهربائي في شكل نطاقات إضافية ثقيلة أو خفيفة ، مما يجعل من الصعب تقييم نتائج التفاعل ، لأنه من السهل الخلط بين عنصر معين. منتج تضخيم مع DNA غريب مركب. يتم استهلاك بعض البادئات و dNTPs لتخليق الحمض النووي غير المحدد ، مما يؤدي إلى فقدان كبير للإحساس.

2. لا ينبغي أن تشكل مواد التمهيدي ثنائيات وحلقات ، أي لا ينبغي تشكيل خيوط مزدوجة مستقرة عن طريق صلب الاشعال لأنفسهم أو لبعضهم البعض.