PCR analizinin yürütülmesi (PCR teşhisi), bir jinekolog, ürolog veya dermatovenerolog tarafından muayene için materyalin toplanmasıyla başlar. Daha sonra elde edilen sonuçların kalitesi ve güvenilirliği, PCR analizi yapmak için gerekli tüm kuralları gözlemleyen Euromedprestige tıp merkezi doktorlarının en yüksek nitelikleri ve engin deneyimleri ile sağlanır: tam sterilite, yalnızca tek kullanımlık malzemelerin kullanımı.

Fırçadan toplanan malzeme salin içeren bir kaba konur. Örneklemeden sonra örnekler en kısa sürede PCR laboratuvarına ulaştırılmalıdır.

Laboratuvarda PCR analizi üç aşamada gerçekleşir:

1. DNA izolasyonu
2. DNA fragmanlarının amplifikasyonu
3. DNA amplifikasyon ürünlerinin tespiti

DNA ekstraksiyonu, PCR teşhisinin ilk aşamasıdır ve özü şu şekildedir: doktor araştırma için materyali hastadan alır ve özel işleme tabi tutar. İşleme sırasında, bölme meydana gelir çift ​​sarmal DNA bireysel zincirlere ayrılır. Hastanın materyaline, reaksiyonun "saflığına" müdahale eden organik maddeleri çözen özel bir sıvı eklenir. Bu lipitleri, amino asitleri, peptitleri, karbonhidratları, proteinleri ve polisakkaritleri uzaklaştırır. Sonuç DNA veya RNA'dır.

PCR yönteminin ilkesi, yeni DNA veya RNA enfeksiyonları "inşa etmektir". Bu, hücresel materyal çıkarılmadan yapılamaz.

DNA ekstraksiyonu için harcanan süre, enfeksiyona neden olan ajana ve PCR testi için kullanılan materyalin türüne bağlıdır. Örneğin, bir sonraki adım için kanın hazırlanması 1,5-2 saat sürer.

0Array ( => Analizler) Dizi ( => 2) Dizi ( =>.html) 2

DNA amplifikasyonu

DNA teşhisinin bir sonraki aşamasını - DNA amplifikasyonunu - gerçekleştirmek için doktorlar, daha sonra üzerinde DNA "klonlamasının" gerçekleşeceği sözde DNA matrislerini - enfeksiyonların DNA moleküllerini kullanırlar. Enfeksiyonun DNA'sının tamamının varlığının gerekli olmadığı daha önce belirtilmişti, bu aşama için bu mikroba (enfeksiyona) özgü DNA molekülünün küçük bir parçası yeterlidir.

DNA amplifikasyonunun kalbinde ve buna bağlı olarak, PCR reaksiyonunun tüm prensibinin kalbinde, tüm canlılar için doğal DNA tamamlama süreci vardır - tek bir DNA zincirinin ikiye katlanmasıyla gerçekleştirilen DNA replikasyonu.

Tek bir DNA parçasıyla başlayarak, laboratuvar doktoru onu kopyalar ve bir zincirleme reaksiyondaki kopya sayısını artırır: ilk döngüden sonra zaten 2 parçanız var, ikinci döngüden sonra - 4, üçüncüden sonra - 8, dördüncüden sonra - 16, sonra 32 , 64, 128, 256... Her döngüde nüsha sayısı ikiye katlanıyor ve yirmi döngüden sonra sayı milyonlara, otuzdan sonra milyarlara çıkıyor. Döngü birkaç dakika sürer ve çok küçük bir kimyasal reaktörde sıcaklık rejiminde belirli bir değişikliğe indirgenir. Burada yeterli miktarlarda bir çözelti içinde sentezin gerekli tüm bileşenleri vardır, her şeyden önce A, G, T ve C nükleotitleri ve ayrıca ince hazırlık kimyasal işlemleri gerçekleştirildi, böylece hemen tam bir kopyası yapıldı. her bitmiş DNA segmenti, sonra bu kopyadan - yine bir kopya, bu dallı zincir reaksiyonudur.

Primerleri DNA zincirine bağlayarak - mikropların DNA'sına (enfeksiyon) benzer şekilde yapay olarak sentezlenmiş DNA "parçaları" (nükleotit çiftleri) - iki DNA bölümü zincirinden oluşan iki kısa, sentez için gerekli olan sarmallar oluşur gelecekteki DNA'nın

Yeni bir zincirin sentezi, DNA'nın iki sarmalının her birinin tamamlanmasıyla gerçekleşir. Amplifikasyon işlemi, belirli bir sitenin - adını veren DNA polimerazın yardımıyla gerçekleşir. laboratuvar yöntemi. Polimeraz, reaksiyon için bir katalizör görevi görür ve nükleotit bazlarının büyüyen yeni DNA ipliğine sıralı bağlanmasını izler.

Bu nedenle, DNA amplifikasyonu, spesifik olan, yani yalnızca belirli bir organizmada bulunan DNA kopyalarının sayısındaki çoklu bir artıştır. Enfeksiyona neden olan etkeni görmek için tüm DNA zincirini tamamlamaya gerek yoktur. Sadece bir birey olarak bu bakterinin karakteristiği olan alana ihtiyaç vardır.

5360 ovmak. Bir gastroenterolog ile kapsamlı bir programın maliyeti

25 İNDİRİM KARDİYOLOJİ KARŞISINDA

- 25%öncelik
Doktor ziyareti
hafta sonu terapisti

5 160 ovmak. 5.420 ruble yerine. Erkeklerin ürolojik enfeksiyonlar açısından muayenesi

ALERJOLOJİ 5 120 ovmak 5.590 ruble yerine.

Amplifikasyonun çok sayıda yinelenen adımlarının tümü, farklı sıcaklıklarda meydana gelir. PCR analizi için, özel olarak programlanabilir ekipman kullanılır - PCR - sıcaklıkları otomatik olarak değiştiren bir termostat veya amplifikatör. Amplifikasyon, tespit edilen enfeksiyon tipine karşılık gelen önceden belirlenmiş bir programa göre gerçekleştirilir. Programa ve tespit edilen enfeksiyonun türüne bağlı olarak, otomatik PCR işlemi 2 ila 3 saat sürer.

PCR teşhisinde önemli bir rol, analizi yapan laboratuvar asistanının yeterliliği, PCR ekipmanının doğru ayarlanması ve sonuçların yorumlanması buna bağlı olarak oynanır. Euromedprestige Tıp Merkezi doktorları, araştırma sonuçlarının güvenilirliğini sağlayan ve tedavide olumlu başarıyı garanti eden DNA teşhisi yapma konusunda geniş deneyime sahiptir. bulaşıcı hastalıklar. "Euromedprestige" tıp merkezimizde PCR testlerini geçmek ve bulaşıcı hastalıkların tam teşhis ve tedavisini gerçekleştirmek.

Amplifikasyon ürünlerinin saptanması sırasında elde edilen amplifikasyon ürünleri karışımı ayrılır. Karışıma, DNA fragmanlarına flüoresan - turuncu-kırmızı parlak şeritleri yansıtma yeteneği kazandıran özel solüsyonlar eklenir. Ortaya çıkan ışıma, hastadan PCR analizi için alınan materyalde virüs, mikrop veya bakteri DNA'sının varlığını gösterir.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), kalıtsal patolojilerin, enfeksiyonların, viral hastalıkların herhangi bir aşamada (akut veya kronik) yanı sıra teşhis edilmesi alanında yüksek hassasiyetli bir yöntemdir. erken aşama- Hastadan alınan örneklerde genetik materyal olan DNA, RNA'ya dayalı olarak patojenleri tanımlayarak hastalığın bariz belirtilerine kadar. Ve bugün polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemlerinin özü, teşhis aşamaları ve ilkeleri ile maliyetinden bahsedeceğiz.

polimeraz zincir reaksiyonu nedir

Analizin temeli amplifikasyondur (ikiye katlama) - insan genetik kompleksini temsil eden kısa bir DNA bölümünden (deoksiribonükleik asit) birçok kopyanın oluşturulması. Çalışma çok az miktarda fizyolojik madde gerektirir (balgam, dışkı, epitel kazıntıları, prostat suyu, kan, meni, amniyotik sıvı, mukus, plasenta dokusu, idrar, tükürük, plevra sıvısı, beyin omurilik sıvısı). Bu durumda örneğin bir hastanın ürogenital sisteminde tek bir zararlı mikrop dahi tespit edilebilmektedir.

PCR tekniği (polimeraz zincir reaksiyonu), 1993 yılında Nobel Ödülü alan Amerikalı bilim adamı K. Mullis tarafından geliştirilmiştir.

Aktif olarak kullanılan:

• enfeksiyonların erken teşhisinde, genetik;
• adli tıp muayenesinde araştırma için son derece az miktarda DNA varlığında;
• veterinerlik tıbbında, farmasötiklerde, biyolojide, moleküler genetikte;
• bir kişinin DNA ile tanımlanması için, babalığın teyidi;
• paleontolojide, antropolojide, ekolojide (ürünlerin kalitesini, çevresel faktörleri takip ederken).

Bu video size bir polimeraz zincir reaksiyonunun ne olduğunu anlatacak:

kime atanır

Polimeraz zincir reaksiyonu bulaşıcı hastalıkların tanısında doğruluğu ve güvenilirliği yüksek en güvenilir yöntemlerden biridir. Örneğin, klamidya ve diğer birçok patojen için PCR analizinin güvenilirliği %100'e (mutlak) yaklaşır. Çoğu zaman, polimeraz zincir reaksiyonu prosedürü, teşhis sırasında belirli bir patojeni tanımlamakta güçlük çeken hastalara reçete edilir.

Laboratuvar PCR testi kullanılır:

• mahsuller veya immünolojik yöntemler kullanılarak tanımlanması zor olan, idrar ve genital organların enfeksiyonuna neden olan patojenleri tespit etmek;
• ilk analizin pozitif, ancak şüpheli bir sonucu olması durumunda (örneğin, AIDS bulaşmış ebeveynlerden gelen yenidoğanlarda) ilk aşamada HIV'in yeniden teşhisi için;
• kurmak onkolojik hastalık erken bir aşamada (onkogen mutasyonlarının incelenmesi) ve belirli bir hastada tedavi rejiminin bireysel olarak düzeltilmesi;
• kalıtsal patolojilerin erken tespiti ve potansiyel tedavisi amacıyla.

Bu nedenle, gelecekteki ebeveynler, genetik bir patolojinin taşıyıcıları olup olmadıklarını öğrenmek için test edilir, çocuklarda PCR, kalıtsal bir hastalığa maruz kalma olasılığını belirler.

• fetal anormallikleri tespit etmek erken dönem gebelik (büyüyen bir embriyonun bireysel hücreleri olası mutasyonlar için incelenir);
• organ nakli öncesi hastalarda - "doku tiplemesi" için (doku uyumluluğunun belirlenmesi);
• bağışlanan kandaki tehlikeli patojenik organizmaları tespit etmek;
• yeni doğan bebeklerde - gizli enfeksiyonları tespit etmek için;
• antiviral ve antimikrobiyal tedavi sonuçlarını değerlendirmek.

Neden bu prosedürden geçiyorsunuz?

PCR, neredeyse% 100 sonuç veren oldukça etkili bir teşhis yöntemi olduğundan, prosedür kullanılır:

• nihai teşhisi doğrulamak veya hariç tutmak için;
• tedavinin etkinliğinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesi.

Çoğu durumda, PCR tek olası test diğer bakteriyolojik, immünolojik ve virolojik teşhis yöntemleri işe yaramazsa, gelişen bir hastalığı tespit etmek için.

• Virüsler, enfeksiyondan hemen sonra ve hastalık belirtileri ortaya çıkmadan önce PCR ile tespit edilir. Virüsün erken tespiti, hızlı tedaviye izin verir.
• Lafta " viral yük» (veya - vücuttaki virüslerin sayısı) kantitatif bir yöntemle DNA analizi ile de belirlenir.
• Spesifik patojenler (Koch tüberkül basili gibi) zordur ve kültürlenmesi çok uzun sürer. PCR analizi, araştırmaya uygun örneklerdeki minimum patojen sayısını (canlı ve ölü) hızlı bir şekilde belirlemenizi sağlar.

Ayrıntılı patojen DNA analizi kullanılır:

• tedaviye hemen başlamanıza izin veren belirli antibiyotik türlerine duyarlılığını belirlemek;
• evcil, vahşi hayvanlar arasında salgın hastalıkların yayılmasını kontrol etmek;
• önceki salgınları körükleyen yeni bulaşıcı mikrobiyal türleri ve patojen alt türlerini belirlemek ve izlemek.

Teşhis türleri

standart yöntem

Polimeraz zincir reaksiyonunun analizi, özel primer enzimler kullanılarak belirli bir DNA ve RNA fragmanının çoklu amplifikasyonu (ikiye katlanması) temelinde gerçekleştirilir. Kopyalama zinciri sonucunda araştırmaya yetecek miktarda materyal elde edilir.

Prosedür sırasında, numunede fiilen mevcut olsa bile sadece istenen parça kopyalanır (belirtilen özel koşullara karşılık gelir).

Yararlı diyagramlar içeren bu ayrıntılı video, PCR'nin nasıl çalıştığını anlatıyor:

Öbür metodlar

• Gerçek zamanlı PCR. Bu tür bir çalışmada, belirli bir DNA fragmanını tanımlama süreci, 30-40 döngülük tüm zincir tamamlandıktan sonra değil, her döngüden sonra başlar. Bu tür bir çalışma, vücuttaki bir patojenin (virüs veya mikrop) miktarı hakkında bilgi edinmenizi, yani kantitatif bir analiz yapmanızı sağlar.
• RT-PCR (ters transkripsiyon modu). Bu tahlil, genetik tabanı RNA olan virüsleri (örneğin, hepatit C virüsü, immün yetmezlik virüsü) tespit etmek için tek sarmallı RNA'yı bulmak için kullanılır. Böyle bir çalışmada özel bir enzim kullanılır - ters transkriptaz ve belirli bir primer ve RNA temelinde tek sarmallı DNA oluşturulur. Daha sonra bu iplikten ikinci bir DNA ipliği geri yüklenir ve standart prosedür gerçekleştirilir.

Tutma endikasyonları

PCR prosedürü bulaşıcı hastalıklar, neonatoloji, doğum, pediatri, üroloji, jinekoloji, zührevi zührevi, nöroloji, nefroloji, oftalmoloji kliniğinde kullanılmaktadır.

Analizin amacına yönelik endikasyonlar:

• kalıtsal patoloji olasılığı olan bir çocukta genetik anormallikler geliştirme riskinin açıklığa kavuşturulması;
• hamilelik planlarken her iki ebeveyne de teşhis koymak veya devam eden bir hamilelik sırasında annenin ciddi bir durumunu teşhis etmek;
• gebe kalma ile ilgili zorluklar, kısırlığın nedenlerinin belirlenmesi;
• şüpheli cinsel yolla bulaşan enfeksiyonlar akut dönem ve kronik hale geçiş semptomları ile;
• nedenlerin keşfi inflamatuar süreçler belirsiz köken;
• korunmasız gündelik ve sürekli cinsel temaslar;
• patojenik bir mikroorganizmanın spesifik antibiyotiklere duyarlılığının belirlenmesi;
• aşikar semptomların gelişmesinden önce patojenleri saptamak için gizli enfeksiyon şüphesi olan hastalar (preklinik tanı);
• hastalıktan sonra iyileşmeyi doğrulamak için hastalar (geriye dönük tanı);

Teşhis, aşağıdaki patojenleri doğru bir şekilde tanımlamanın gerekli olması durumunda da kullanılır:

• hepatit virüsleri (A B C G), insan immün yetmezliği, sitomegalovirüs;
• vibrio kolera;
• herpes simpleks virüsü, herpetiform türler;
• retro - adeno - ve rinovirüsler;
• kızamıkçık virüsleri, Epstein-Barr, suçiçeği (Zoster - virüs);
• parvo ve picornavirüsler;
• bakteri Helicobacter pylori;
• lejyonella, Escherichia coli'nin patojen türleri;
• stafilokok aureus;
• patojen;
• Clostridia, difteri ve Haemophilus influenzae;

Ayrıca enfeksiyonları belirlemek için kullanılır:

• Enfeksiyöz mononükleoz;
• borreliosis, listeriyoz, kene kaynaklı ensefalit;
• Candida mantarlarının neden olduğu kandidiyazis;
• cinsel enfeksiyonlar - trichomoniasis, ureaplasmosis, soluk treponema, gardnerelloz, gonore, mikoplazmoz, klamidya;
• tüberküloz.

Tutmak için kontrendikasyonlar

İşlem hasta ile, vücut üzerinde herhangi bir etki olmaksızın değil, araştırma için alınan biyolojik materyal ile yapıldığından, potansiyel bir tehlike olmaması nedeniyle PCR için herhangi bir kontrendikasyon yoktur.

Ancak kolposkopi işleminden sonra rahim ağzı kanalından biyomateryal örneklemesi yapılmaz. Smearların, analiz için kazımaların teslimine, adetin bitiminden ve taburculuğun tamamen kesilmesinden sadece 4 ila 6 gün sonra izin verilir.

yöntem güvenli mi

Yok Negatif etki Bir hasta üzerinde laboratuvarda onun biyomateryalinin izole bir şekilde incelenmesi imkansızdır.

Prosedür için hazırlık (analiz için biyolojik maddelerin teslimi)

Yabancı bir patojenin DNA'sının tespit edildiği PCR analizi için numune olarak, herhangi bir biyolojik sıvı, doku, vücut salgısı kullanılır. Test maddesinin örneklenmesi, bir damardan kan alınması, gırtlak, burun boşluğu, idrar yolundan kazıma şeklinde gerçekleştirilir. plevral boşluk, serviks, rahim ağzı.

Teşhis prosedüründen önce, doktor hastaya hangi malzemenin alınacağını açıklar:

1. Cinsel enfeksiyon açısından muayene yapılırken genital organlardan salgılar, idrar ve üretradan smear alınır.
2. için analiz edildiğinde herpetik enfeksiyonlar, sitomegalovirüs, mononükleoz - analiz için idrar, boğazdan sürüntü, hepatit için, toksoplazmoz - damardan kan alırlar.
3. Teşhis amacıyla Çeşitli türler beyin omurilik sıvısı alınır.
4. Pulmonolojide analiz için örnekler balgam ve plevral sıvıdır.
5. Gebelik sırasında olası intrauterin enfeksiyonlarla ilgili bir çalışma yapılırken, analiz için amniyotik sıvı ve plasenta hücreleri kullanılır.

Analizin güvenilirliği ve doğruluğu, materyal alınırken koşulların steril olmasına bağlıdır. PCR testi oldukça hassas olduğundan, test maddesinin herhangi bir şekilde kirlenmesi sonucu bozabilir.

Biyomateryal teslimi için yetkin hazırlık, hastalar için herhangi bir zorluk oluşturmaz. Belirli öneriler var:

• cinsel enfeksiyonlar için analiz yaparken:
  • malzemenin tesliminden 72 saat önce yakın temasları hariç tutun;
  • 3 gün boyunca herhangi bir vajinal ürünü kullanmayı bırakın;
  • önceki günün akşamından bu yana, incelenen alanın hijyenini gerçekleştirmeyin;
  • üretradan numune alırken 3-4 saat idrara çıkmayı hariç tutun;
• enfeksiyon testi yapmadan bir ay önce antibiyotik almayı bırakın;
• sabahları yemeden ve içmeden önce kan bağışı yapın;
• sabah idrarının ilk kısmının toplanması, kapsamlı bir samimi tuvaletten sonra steril bir kapta gerçekleştirilir.

Teşhisin polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi kullanılarak nasıl yapıldığı hakkında daha fazla bilgi edinin.

prosedür nasıl

Reaktörde (amplifikatör veya termal döngüleyici) bir PCR çalışmasını tekrar tekrar gerçekleştirirken, belirli döngüler tekrarlanır:

1. İlk adım denatürasyon. Patojenin DNA'sının (veya RNA'sının) varlığından şüphelenilen tükürük, kan, biyopsi, jinekolojik örnekler, balgam, malzemenin ısıtıldığı ve DNA'nın iki ayrı zincire ayrıldığı bir amplifikatöre yerleştirilir.
2. İkinci adım, malzemenin tavlanması veya hafifçe soğutulmasıdır. ve DNA molekülündeki istenen bölümleri tanıyabilen ve bunlara bağlanabilen primerlerin eklenmesi.
3. Üçüncü adım uzamadır- DNA sarmallarının her birine 2 primerin eklenmesinden sonra oluşur. İşlem sırasında patojenin DNA fragmanı tamamlanır ve kopyası oluşur.

Bu döngüler, her seferinde belirli bir DNA fragmanının (örneğin, belirli bir virüsün programlandığı bir segment) kopyalarının ikiye katlanmasına yol açan bir "zincirleme reaksiyon" gibi tekrarlanır. Birkaç saat içinde DNA fragmanının birçok kopyası oluşur ve bunların numunedeki varlığı tespit edilir. Bundan sonra, enfeksiyon tipini belirlemek için sonuçlar analiz edilir ve çeşitli patojen türlerinin veritabanıyla karşılaştırılır.

Sonuçların yorumlanması ve aşağıdaki PCR reaksiyonuna dayalı sonuç hakkında bilgi edinin.

Sonuçların deşifre edilmesi

Çalışmanın nihai sonucu, biyolojik materyalin tesliminden 1-2 gün sonra verilir. Genellikle - zaten analizden sonraki ilk gün içinde.

Kalitatif Analiz

• Olumsuz sonuç, araştırma için sunulan maddede enfeksiyöz ajan izine rastlanmadığı anlamına gelir.
• Pozitif sonuç, biyolojik bir numunede patojenik virüslerin veya bakterilerin sunulma anında çok yüksek bir doğruluk derecesi ile saptanması anlamına gelir.

Sonuç pozitifse ancak enfeksiyonun aktivasyon belirtisi yoksa vücudun bu durumuna asemptomatik “sağlıklı taşıyıcılık” denir. En sık viral hastalıklarda belirli bir yerden (servikal kanal, üretra, ağız boşluğu) biyomateryal alırken gözlenir. Bu durumda tedavi gerekli değildir, ancak bir olasılık olduğundan sürekli tıbbi gözetim gereklidir:

• virüsün taşıyıcılardan yayılması ve sağlıklı insanların enfeksiyonu;
• sürecin aktivasyonu ve hastalığın kronik bir forma geçişi.

Ancak kan testi pozitif çıkarsa bu, enfeksiyonun vücudu etkilediğini gösterir ve bu artık taşıyıcı bir durum değil, acil spesifik tedavi gerektiren bir patolojidir.

Kantitatif Analiz

Kantitatif sonuç, uzman tarafından belirli bir enfeksiyon türü için özel olarak belirlenir. Temelinde, doğru tedaviyi derhal reçete etmeyi mümkün kılan, hastalığın evresini, gelişme derecesini değerlendirmek mümkündür.

ortalama tutar

Bir polimeraz zincir reaksiyonu yürütme fiyatları şunlar tarafından belirlenir: çalışmanın türü, patojeni tanımlamanın karmaşıklığı, biyolojik materyal toplamanın zorluğu, analiz türü (nitel veya niceliksel), laboratuvardaki fiyat seviyesi.

Öte yandan, PCR çalışmasında, analiz için bir tür materyal alındığında birkaç patojen aynı anda tespit edilebilir. Bu, diğer laboratuvar testlerinden tasarruf sağlar.

Yaklaşık olarak, ruble cinsinden PCR analizinin maliyeti:

• gonococcus, gardnerella, trichomonas vaginalis - 180'den
• klamidya trachomatis - 190'dan itibaren
• papilloma virüsü - 380'den 500'e
• kadınlarda ürogenital sistemin biyosenozu (mikrofloranın niceliksel ve niteliksel değerlendirmesi) - 800'den.

PCR çalışmasıyla ilgili daha yararlı bilgiler için aşağıdaki videoya bakın:

YÖNTEM PRENSİBİ (moleküler biyolojik temel)

DNA analizi için çok çeşitli hibridizasyon yöntemleri arasında, PCR klinik laboratuvar teşhislerinde en yaygın kullanılanıdır.

Yöntem prensibi polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)(Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)) 1983 yılında Cary Mullis (Cetus, ABD) tarafından geliştirilmiştir. ve şu anda pratik sağlık hizmetlerinde ve Devlet Sıhhi ve Epidemiyolojik Denetim hizmetinde (genotipleme, bulaşıcı hastalıkların teşhisi) hem bilimsel araştırma hem de teşhis için yaygın olarak kullanılmaktadır.

PCR yöntemi, DNA polimeraz enzimi yardımıyla gerçekleştirilen, DNA şablonunun tamamlayıcı tamamlanması olan doğal bir işleme dayanmaktadır. Bu reaksiyon denir DNA kopyalama.

Doğal DNA replikasyonu birkaç adımı içerir:

1) DNA denatürasyonu(çift sarmalın çözülmesi, DNA sarmallarının ayrılması);

2) Kısa çift sarmallı DNA segmentlerinin oluşumu(DNA sentezini başlatmak için gerekli tohumlar);

3) Yeni bir DNA zincirinin sentezi(her iki kolun tamamlayıcı tamamlanması)

Bu işlem, kopyaları elde etmek için kullanılabilir belirli mikroorganizmalara özgü kısa DNA segmentleri,şunlar. bulaşıcı hastalıkların patojenlerini tanımlamak için gen teşhisinin amacı olan bu tür belirli alanlar için hedefli bir arama yapmak.

Termofilik bakterilerden termostabil DNA polimerazın (Taq polimeraz) keşfi Thermis Aquatus optimumu 70-72°C aralığında olan , DNA replikasyon sürecini döngüsel hale getirmeyi ve bunu in vitro çalışmak için kullanmayı mümkün kıldı. Belirli bir programa göre döngüsel sıcaklık değişimleri gerçekleştiren programlanabilir termostatların (amplifikatörler) oluşturulması, PCR yönteminin laboratuvar klinik teşhis uygulamasına yaygın bir şekilde dahil edilmesi için ön koşulları yarattı. Sentez döngülerinin tekrarlanmasıyla, belirli bir DNA fragmanının kopya sayısında üstel bir artış meydana gelir; bu, tek bir mikroorganizma hücresi içerebilen az miktarda analiz edilen materyalden yeterli sayıda DNA kopyası elde etmeyi mümkün kılar. , elektroforez ile tanımlamaları için.

Zincirin tamamlayıcı olarak tamamlanması, DNA dizisinin herhangi bir noktasında değil, yalnızca belirli başlangıç ​​bloklarında - kısa çift sarmallı bölümlerde - başlar. Bu tür blokları DNA'nın belirli bölgelerine bağlayarak, yeni bir sarmalın sentez sürecini DNA sarmalının tüm uzunluğu boyunca değil, yalnızca bu bölgede yönlendirmek mümkündür. Belirli DNA bölgelerinde başlangıç ​​blokları oluşturmak için iki oligonükleotid primeri (20 nükleotid çifti) kullanılır. astarlar. Primerler, belirli bir fragmanın sol ve sağ sınırlarındaki DNA dizilerini tamamlayıcı niteliktedir ve yeni bir DNA zincirinin tamamlanması sadece aralarında gerçekleşecek şekilde yönlendirilmiştir.

Dolayısıyla PCR, DNA polimeraz enzimi tarafından katalize edilen belirli bir DNA bölgesinin kopya sayısında (amplifikasyon) çoklu bir artıştır.

Amplifikasyon için aşağıdaki bileşenler gereklidir:

Deoksinükleotit trifosfatların (dNTP'ler) bir karışımı(yeni tamamlayıcı DNA sarmallarının sentezi için malzeme olan dört dNTP'nin bir karışımı)

Enzim Taq polimeraz(büyüyen bir sentezlenmiş DNA zincirine sırayla nükleotit bazları ekleyerek primer zincirlerinin uzamasını katalize eden termostabil bir DNA polimeraz).

tampon çözelti(enzim aktivitesini sürdürmek için gerekli Mg2+ iyonlarını içeren reaksiyon ortamı)
RNA içeren virüslerin genomunun spesifik bölgelerini belirlemek için, önce ters transkriptaz enzimi (ters transkriptaz) tarafından katalize edilen bir ters transkripsiyon (RT) reaksiyonu kullanılarak bir RNA şablonundan bir DNA kopyası elde edilir.

İstenen karakteristik DNA fragmanının yeterli sayıda kopyasını elde etmek için amplifikasyon birkaç (20-40) döngü içerir.

Her amplifikasyon döngüsü, farklı sıcaklık koşullarında ilerleyen 3 aşama içerir Adım 1: DNA Denatürasyonu(çift sarmal çözme). 93-95°C'de 30-40 saniye akar. Aşama 2: Astarların takılması (tavlama). Primer eki, belirli bir bölgenin sınırlarında zıt DNA iplikçiklerinde karşılık gelen dizilere tamamlayıcı olarak gerçekleşir. Her bir primer çifti, değerleri 50-65°C aralığında olan kendi tavlama sıcaklığına sahiptir. Tavlama süresi -20-60 sn. Aşama 3: DNA zincirlerinin oluşturulması. DNA zincirlerinin tamamlayıcı tamamlanması, primer bağlanma bölgelerinden başlayarak zincirin 5' ucundan 3' ucuna zıt yönlerde gerçekleşir. Yeni DNA zincirlerinin sentezi için malzeme, çözeltiye eklenen deoksiribonükleotid trifosfatlardır (dNTP'ler). Sentez işlemi termostabil DNA polimeraz enzimi (Taq polimeraz) tarafından katalize edilir ve 70-72°C sıcaklıkta gerçekleşir. Sentez süresi - 20-40 sn.

Birinci amplifikasyon döngüsünde oluşan yeni DNA şeritleri, içinde istenen spesifik DNA fragmanının (amplikon) oluşturulduğu ikinci amplifikasyon döngüsü için şablon görevi görür. (bkz. şekil 2). Sonraki amplifikasyon döngülerinde amplikonlar, yeni zincirlerin sentezi için bir şablon görevi görür. Böylece, amplikonların solüsyonda birikmesi, n'nin amplifikasyon döngülerinin sayısı olduğu formül 2n'ye göre gerçekleşir. Bu nedenle, ilk çözeltide başlangıçta yalnızca bir çift sarmallı DNA molekülü mevcut olsa bile, 30-40 döngüden sonra çözeltide yaklaşık 108 amplikon molekülü birikir. Bu miktar, bu parçanın agaroz jel elektroforezi ile güvenilir görsel tespiti için yeterlidir. Amplifikasyon işlemi, belirli bir programa göre, amplifikasyon döngülerinin sayısına göre sıcaklıkları otomatik olarak değiştiren özel bir programlanabilir termostatta (amplifikatör) gerçekleştirilir.

PCR AŞAMALARI - ANALİZ

Bulaşıcı hastalıklar için bir laboratuvar teşhis aracı olarak PCR yöntemi, istenen parçayı biriktirmek için bir polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak, yalnızca bu mikroorganizmaya özgü patojenin küçük bir DNA parçasının (birkaç yüz baz çifti) saptanmasına dayanır.
PCR yöntemini kullanan analiz tekniği üç aşama içerir:

1. Klinik bir numuneden DNA (RNA) izolasyonu

2. Spesifik DNA fragmanlarının amplifikasyonu
3. Amplifikasyon ürünlerinin tespiti

DNA İzolasyonu (RNA)
Analizin bu aşamasında, klinik numune, hücresel materyalin parçalanması, protein ve polisakarit fraksiyonlarının çıkarılması ve içermeyen bir DNA veya RNA solüsyonunun hazırlanması ile sonuçlanan özel bir işleme tabi tutulur.
inhibitörler ve daha fazla amplifikasyon için hazır.
DNA (RNA) ekstraksiyon tekniğinin seçimi esas olarak işlenen klinik materyalin doğasına göre belirlenir.

Spesifik DNA fragmanlarının amplifikasyonu
Bu aşamada, kısa spesifik DNA fragmanları, daha sonraki tespitleri için gerekli miktarda birikir. Genomun belirli parçalarını belirlemeye yönelik çoğu yöntem, sözde kullanır. “ klasik versiyon yönlendirilmiş PCR Analizin özgüllüğünü ve hassasiyetini artırmak için, bazı yöntemler 2 çift primer kullanan “iç içe” PCR yöntemini kullanır (“dış” - 1. aşama için ve “iç” - 2. aşama için).

Amplifikasyon ürünlerinin tespiti
Çoğu teknikte bu aşamada 2. aşamada elde edilen amplifikasyon ürünlerinin karışımı yatay agaroz jel elektroforezi ile ayrılır. Elektroforetik ayırmadan önce, amplifikasyon karışımına, çift sarmallı DNA fragmanları ile güçlü interstisyel bağlantılar oluşturan bir etidyum bromür solüsyonu eklenir. UV ışımasının etkisi altındaki bu bileşikler, amplifikasyon karışımının agaroz jelde elektroforetik olarak ayrılmasından sonra turuncu-kırmızı ışıklı bantlar olarak kaydedilen flüoresan yayabilirler.

Bazı dezavantajları olan elektroforetik saptama yöntemine bir alternatif olarak: sonuçların okunmasında öznellik, bir reaksiyonda çeşitli mikroorganizmaların DNA'sının belirlenmesine ilişkin kısıtlamalar önerilebilir. hibridizasyon tespit şemaları. Bu şemalarda, amplifikasyondan kaynaklanan DNA fragmanı, spesifik bir oligonükleotid probu ile hibridleşir (2-şeritli kompleksler oluşturur - "melezler"). Bu tür komplekslerin kaydı, kolorimetrik veya florimetrik olarak gerçekleştirilebilir. SPC "Litekh", sonuçların florimetrik kaydıyla hibridizasyona dayalı saptama kitleri oluşturdu

Bulaşıcı hastalıkların teşhisi için bir yöntem olarak PCR YÖNTEMİNİN AVANTAJLARI:

- Doğrudan tanım patojenlerin varlığı

Birçok geleneksel yöntemler enzim immunoassay gibi teşhisler, enfeksiyöz ajanların hayati aktivitesinin ürünleri olan ve bir enfeksiyonun varlığına dair yalnızca dolaylı kanıt sağlayan işaret proteinlerini ortaya çıkarır. Patojenin spesifik bir DNA bölgesinin PCR ile tanımlanması, enfeksiyöz ajanın varlığının doğrudan bir göstergesidir.

- Yüksek özgüllük
PCR yönteminin yüksek özgüllüğü, test materyalinde yalnızca bu patojen için karakteristik olan benzersiz bir DNA fragmanının saptanmasından kaynaklanmaktadır. Spesifiklik, primerlerin nükleotit dizisi tarafından belirlenir;
çapraz reaksiyona giren antijenler nedeniyle hataların nadir olmadığı enzim immunoassay yönteminin aksine yanlış sonuçlar elde etme olasılığı.

- Yüksek hassasiyet
PCR yöntemi, bakteri veya virüslerin tek hücrelerini bile tespit etmenizi sağlar. PCR teşhisi, diğer yöntemlerin (immünolojik, bakteriyolojik,
mikroskobik) imkansızdır. PCR analizinin hassasiyeti numune başına 10-1000 hücredir (immünolojik ve mikroskobik testlerin hassasiyeti 103-105 hücredir).

-Çeşitli patojenleri tanımlama prosedürünün evrenselliği
PCR ile çalışmanın materyali, patojenin DNA'sıdır. Yöntem, belirli bir organizmaya özgü bir DNA veya RNA fragmanının saptanmasına dayanır. benzerlik kimyasal bileşim tüm nükleik asitlerin sayısı, laboratuvar araştırmaları için birleşik yöntemlerin kullanılmasına izin verir. Bu, bir biyotahlilden birkaç patojeni teşhis etmeyi mümkün kılar. Test materyali olarak çeşitli biyolojik salgılar (mukus, idrar, balgam), epitel hücrelerinin kazınması, kan, serum kullanılabilir.

- Analiz sonucunu elde etmede yüksek hız
PCR analizi, çok zaman alan patojen kültürünün izolasyonunu ve kültivasyonunu gerektirmez. Biyomateryal işleme ve reaksiyon ürünlerinin saptanması için birleşik bir yöntem ve amplifikasyon işleminin otomasyonu, aşağıdakileri gerçekleştirmeyi mümkün kılar: tam analiz 4-4.5 saat içinde.

Unutulmamalıdır ki PCR yöntemi sadece hastadan elde edilen klinik materyalde değil, aynı zamanda çevresel nesnelerden (su, toprak vb.) elde edilen materyalde de patojenleri tespit edebilmektedir.

PRATİK SAĞLIK HİZMETLERİNDE PCR YÖNTEMİNİN UYGULANMASI

Hem bakteriyel hem de viral nitelikteki bulaşıcı hastalıkların teşhisinde PCR yönteminin kullanılması, mikrobiyoloji ve epidemiyolojinin birçok sorununun çözümü için büyük önem taşımaktadır. Bu yöntemin kullanılması, kronik ve az çalışılmış bulaşıcı hastalıklar alanında temel araştırmaların geliştirilmesine de katkıda bulunur.

Yöntemin en etkili ve ekonomik olarak haklı kullanımı:

ürojinekolojik uygulama- klamidya, ureaplasmosis, gonore, herpes, gardnerelloz, mikoplazma enfeksiyonunu saptamak için;

pulmonolojide- için ayırıcı tanı viral ve bakteriyel pnömoni tüberküloz;

gastroenterolojide- helikobakteriyozu saptamak için;

enfeksiyon hastalıkları kliniğinde- Salmonelloz, difteri teşhisi için hızlı bir yöntem olarak, viral hepatit B, C ve G;

hematolojide- sitomegalovirüs enfeksiyonunu, onkovirüsleri saptamak için.

Federal Eğitim Ajansı

devlet eğitim kurumu

Yüce mesleki Eğitim

"Karelya Devlet Pedagoji Akademisi"

Konuyla ilgili ödev:

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve uygulaması

Tamamlayan: öğrenci Koryagina Valeria Aleksandrovna

Kontrol eden: Karpikova Natalya Mihaylovna

Petrozavodsk 2013

giriiş

Bölüm 1 Literatür Taraması

1.5.4 Plato etkisi

1.5.6 Amplifikasyon

Çözüm

giriiş

Son yirmi yıl, moleküler genetik yöntemlerin biyoloji, tıp ve tarım bilimlerine yaygın bir şekilde girmesiyle belirlendi.

1970'lerin başlarında, moleküler biyolojinin belirli bir mükemmellik derecesine ulaştığı görülüyordu. Bu dönemde mikroorganizmalar, moleküler genetik araştırmalarının ana amacıydı. Ökaryotlara geçiş, araştırmacılara o dönemde var olan genetik analiz yöntemleri kullanılarak çözülemeyen tamamen yeni problemler sundu. Moleküler genetiğin geliştirilmesinde bir atılım, yeni bir deneysel araç olan kısıtlama endonükleazlarının ortaya çıkması nedeniyle mümkün oldu. Sonraki yıllarda niteliksel olarak farklı yaklaşımlara dayalı doğrudan DNA analiz yöntemlerinin sayısı hızla artmaya başladı.

Modern teknolojilerçoğu durumda, çeşitli organizmaların nükleer ve çekirdek dışı genomlarının ince yapısal ve işlevsel organizasyonunu daha derin bir düzeyde incelemeye başlamayı mümkün kıldılar. Bu, yeni teşhis ve tedavi yöntemlerinin geliştirilmesi için özel bir önem taşıyordu. çeşitli hastalıklar. Popülasyonların, çeşitlerin ve suşların genetik değişkenliğini belirlemek ve analiz etmek, ekonomik açıdan değerli bireyleri belirlemek ve onaylamak, genetiği değiştirilmiş organizmalar yaratmak ve diğer sorunları çözmek için popülasyon biyolojisi ve ıslahında moleküler genetiğin başarılarını kullanma olasılığı daha az önemli değildi.

Her yöntemin kendine göre avantajları ve dezavantajları vardır. Ortaya çıkan tüm sorunları çözebilecek evrensel bir yöntem yoktur. Bu nedenle, devam eden araştırma için belirli bir yöntemin seçimi, herhangi bir bilimsel çalışmanın en önemli aşamalarından biridir.

Bölüm 1 Literatür Taraması

1.1 Polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) keşfinin tarihi

1983 yılında K.B. Mullis ve diğerleri, nükleik asitlerin tüm araştırma ve uygulama alanlarında derin bir etkiye sahip olması hedeflenen polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemini yayınladı ve patentini aldı. Bu yöntemin moleküler biyoloji ve genetik için önemi o kadar büyük ve açıktı ki, yedi yıl sonra yazara Nobel Kimya Ödülü verildi.

Yöntemin başlangıcında, her ısıtma-soğutma döngüsünden sonra, DNA polimerazın inaktive olması nedeniyle reaksiyon karışımına eklenmesi gerekiyordu. Yüksek sıcaklık DNA sarmalının sarmallarını ayırmak için gereklidir. Reaksiyon prosedürü nispeten verimsizdi ve çok fazla zaman ve enzim gerektiriyordu. 1986'da polimeraz zincir reaksiyonu yöntemi önemli ölçüde geliştirildi. Termofilik bakterilerden elde edilen DNA polimerazların kullanılması önerilmiştir. Bu enzimlerin termostabil oldukları ve birçok reaksiyon döngüsüne dayanabildikleri kanıtlanmıştır. Kullanımları, PCR'yi basitleştirmeyi ve otomatikleştirmeyi mümkün kıldı. İlk termostabil DNA polimerazlardan biri bakterilerden izole edildi Termus suculusve adlı tak-polimeraz.

Nükleotid sekansı bilinen herhangi bir DNA segmentinin amplifiye edilerek PCR sonrasında homojen formda ve hazırlayıcı miktarda elde edilebilmesi, PCR'yi kısa DNA fragmanlarının moleküler klonlanması için alternatif bir yöntem haline getirmektedir. kullanılan karmaşık metodolojik teknikleri uygulamaya gerek yoktur. genetik mühendisliği geleneksel klonlama ile PCR yönteminin gelişimi, moleküler genetiğin ve özellikle genetik mühendisliğinin metodolojik olanaklarını o kadar genişletti ki, birçok alanının bilimsel potansiyelini kökten değiştirdi ve güçlendirdi.

1.2 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) çeşitleri

· İç içe PCR- reaksiyonun yan ürünlerinin sayısını azaltmak için kullanılır. İki çift primer kullanın ve iki ardışık reaksiyon gerçekleştirin. İkinci primer çifti, birinci reaksiyonun ürünü içindeki DNA bölgesini çoğaltır.

· ters PCR- istenen dizi içinde yalnızca küçük bir alan bilindiğinde kullanılır. Bu yöntem, DNA genoma yerleştirildikten sonra komşu dizilerin belirlenmesi gerektiğinde özellikle yararlıdır. Ters PCR'nin uygulanması için, kısıtlama enzimleri ile bir dizi DNA kesimi gerçekleştirilir.<#"justify">polimeraz zincir reaksiyonu primeri

· Gruba özgü PCR- Akrabalar için PCR<#"center">1.3 Polimeraz zincir reaksiyonu

1980'lerin ortalarında keşfedilen polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), orijinal bir numunenin kopya sayısını birkaç saat içinde milyonlarca kez artırabilir. Reaksiyonun her döngüsünde, orijinal molekülden iki kopya oluşur. Sentezlenen DNA kopyalarının her biri, bir sonraki döngüde yeni DNA kopyalarının sentezi için bir şablon görevi görebilir. Böylece, döngülerin tekrar tekrar tekrarı, kopya sayısında bir artışa yol açar. geometrik ilerleme. Hesaplamalardan, 30 döngü olsa bile, orijinal molekülün kopya sayısının 1 milyardan fazla olacağı sonucu çıkıyor. Her döngüde tüm amplikonların kopyalanmadığını dikkate alsak bile, buna rağmen toplam kopya sayısı oldukça büyük bir rakamdır.

Polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) her döngüsü aşağıdaki adımlardan oluşur:

· Denatürasyon - Sıcaklıktaki bir artış, çift sarmallı bir DNA molekülünün çözülmesine ve iki tek sarmallı olana bölünmesine neden olur;

· Tavlama - Sıcaklığın düşürülmesi, primerlerin DNA molekülünün tamamlayıcı bölgelerine bağlanmasına izin verir;

· Uzama - DNA polimeraz enzimi tamamlayıcı ipliği tamamlar.

Seçilen fragmanın amplifikasyonu için, belirli bir DNA bölgesini çevreleyen iki oligonükleotid primeri (tohum) kullanılır. Astar odaklı 3 - birbirine doğru ve yükseltilmesi gereken dizi yönünde biter. DNA polimeraz, primerlerden başlayarak karşılıklı olarak tamamlayıcı DNA zincirlerinin sentezini (tamamlanmasını) gerçekleştirir. DNA sentezi sırasında, primerler fiziksel olarak yeni sentezlenen DNA moleküllerinin zincirine eklenir. Primerlerden biri kullanılarak oluşturulan DNA molekülünün her bir ipliği, diğer primer kullanılarak tamamlayıcı bir DNA ipliğinin sentezi için bir şablon görevi görebilir.

1.4 Bir polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) yürütülmesi

Polimeraz zincir reaksiyonu, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) aşamalarının sıcaklık ve zaman özelliklerini kontrol eden bir cihaz olan kullanılan termal döngüleyici (amplifikatör) ile boyut olarak uyumlu özel ince duvarlı polipropilen test tüplerinde gerçekleştirilir. .

1.5 Polimeraz zincir reaksiyonu yönteminin prensibi

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), belirli bir DNA dizisini izole edip birkaç saat içinde milyarlarca kez çoğaltabilen bir in vitro DNA amplifikasyon yöntemidir. Kesin olarak tanımlanmış bir genom bölgesinin çok sayıda kopyasını elde etme yeteneği, mevcut bir DNA örneğinin çalışılmasını büyük ölçüde basitleştirir.

Bir polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için bir dizi koşulun karşılanması gerekir:

1.5.1 Reaksiyon karışımında çok sayıda bileşenin mevcudiyeti

Reaksiyon (PCR) karışımının ana bileşenleri şunlardır: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, nükleotid trifosfatlar (ATP, GTP, CTP, TTP), primerler (oligonükleotidler), analiz edilmiş DNA preparasyonu, termostabil DNA polimeraz karışımı. Reaksiyon karışımının bileşenlerinin her biri doğrudan polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dahil olur ve reaktiflerin konsantrasyonu, amplifikasyon sürecini doğrudan etkiler.

· Tris-HCl - reaksiyon karışımının pH'ını belirler, bir tampon kapasitesi oluşturur. DNA polimerazın aktivitesi, ortamın pH'ına bağlıdır, bu nedenle pH değeri, polimeraz zincir reaksiyonunun seyrini doğrudan etkiler. Genellikle pH değeri 8 - 9,5 aralığındadır. yüksek değer pH, sıcaklık arttıkça Tril-HCl tamponunun pH'ının düşmesi gerçeğinden alınır.

· KCl - 50 mm'ye kadar olan potasyum klorür konsantrasyonu, denatürasyon ve tavlama işlemlerinin seyrini etkiler, 50 mm'nin üzerindeki konsantrasyon, DNA polimerazı inhibe eder.

· MgCl 2- çünkü DNA polimeraz Mg'dir 2+- bağımlı enzim, daha sonra magnezyum iyonlarının konsantrasyonu enzimin aktivitesini etkiler (Mg 2+NTP ile kompleksler oluşturur - polimeraz için substrat olan bu komplekslerdir). Yüksek bir konsantrasyon, spesifik olmayan amplifikasyonda bir artışa yol açar ve düşük bir konsantrasyon, reaksiyonun inhibisyonuna yol açar, optimum (çeşitli polimerazlar için) 0,5 - 5 mM aralığındadır. Ek olarak, magnezyum tuzlarının konsantrasyonu denatürasyon ve tavlama süreçlerini etkiler - Mg konsantrasyonunda bir artış 2+DNA'nın erime sıcaklığında (yani, çift sarmallı DNA sarmallarının %50'sinin tek sarmallı sarmallara ayrıldığı sıcaklık) bir artışa neden olur.

· NTP - nükleotit trifosfatlar, nükleik asitlerin doğrudan monomerleridir. Zincir sonlandırmasını önlemek için, dört nükleotit trifosfatın hepsinin eşit oranda olması önerilir. Bu bileşenlerin reaksiyon karışımındaki düşük konsantrasyonu, tamamlayıcı DNA sarmalının yapımında hata olasılığını artırır.

· Astarlar - En uygun olanı, erime noktası farkı 2 - 4'ten fazla olmayan astarların kullanılmasıdır. Ö C. Bazen ne zaman Uzun süreli depolama 4 sıcaklığında Ö C veya çok sayıda donma-çözülme primerleri oluştuktan sonra ikincil yapılar- PCR'nin etkinliğini azaltan dimerler. Bu sorunun ortadan kaldırılması su banyosunda inkübasyona indirgenmiştir (T=95 Ö C) 3 dakika ve ardından 0o'ye hızlı soğutma İTİBAREN.

· DNA hazırlıkları - DNA hazırlığının (matris) miktarı ve kalitesi, polimeraz zincir reaksiyonunun seyrini ve parametrelerini doğrudan etkiler. Fazla DNA örneği, polimeraz zincir reaksiyonunu (PCR) inhibe eder. safsızlıklar çeşitli maddeler DNA preparasyonunda bulunan polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) etkinliğini de azaltabilir: sodyum asetat, sodyum klorür, izopropanol, etanol, heparin, fenol, üre, hemoglobin, vb.

· DNA polimeraz - az miktarda DNA polimeraz kullanıldığında, sentezde bir azalma gözlenir son ürün parçaların boyutu ile doğru orantılıdır. 2-4 kat fazla polimeraz, dağınık spektrumların ve 4-16 kat düşük moleküler ağırlıklı spesifik olmayan spektrumların ortaya çıkmasına neden olur. Kullanılan konsantrasyon aralığı, 25 µl PCR karışımı cinsinden 0,5 - 1,5 birim aktivitedir.

PCR karışımının ana bileşenlerine ek olarak, PCR'nin niteliksel ve niceliksel göstergelerini iyileştiren bir dizi ek madde kullanılır: asetamid (% 5) - ana bileşenlerin çözünürlüğünde bir artış; betain (sodyum tuzu) - DNA polimerazın stabilizasyonu, DNA'nın erime noktasının düşürülmesi, erime noktasının eşitlenmesi; sığır albümini (10-100 μg / ml) - DNA polimerazın stabilizasyonu; dimetil sülfoksit (%1-10) - ana bileşenlerin çözünürlüğünü arttırmak; formamid (%2-10) - tavlamanın özgüllüğünde bir artış; gliserol (% 15-20) - enzimin termal stabilitesinde bir artış, bir DNA numunesinin denatürasyon sıcaklığında bir azalma; amonyum sülfat - denatürasyon ve tavlama sıcaklığını düşürür.

1.5.2 Döngü ve sıcaklık

Genel form polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) programları aşağıdaki gibidir:

sahne. DNA preparasyonunun uzun süreli birincil denatürasyonu.1 döngü

sahne. DNA preparasyonunun hızlı denatürasyonu. Astar tavlaması. Uzama.30 - 45 döngü.

sahne. Uzun süreli uzama Reaksiyon karışımının soğutulması 1 döngü.

Aşamanın her elemanı - denatürasyon, tavlama, uzama - ayrı sıcaklık ve zaman özelliklerine sahiptir. Her bir elemanın sıcaklık ve akış süresi parametreleri amplifikasyon ürünlerinin kalitatif ve kantitatif göstergelerine göre ampirik olarak seçilir.

denatürasyon. Polimeraz zincir reaksiyonunun bu unsuru sırasında, çift sarmallı bir DNA molekülü iki tek sarmallı olana bölünür. Denatürasyonun sıcaklık parametreleri 90 - 95 aralığındadır. Ö C, ancak yüksek guanin ve sitozin içeriğine sahip bir DNA örneği söz konusu olduğunda, sıcaklık 98 ° C'ye yükseltilmelidir. Ö C. Denatürasyon sıcaklığı, DNA iplikçiklerini tamamen denatüre etmek - ayırmak ve "ani soğumayı" veya hızlı tavlamayı önlemek için yeterli olmalıdır, ancak termostabil DNA polimeraz, yüksek sıcaklıklarda daha az kararlıdır. Bu nedenle, primer/numune oranı (DNA hazırlığı) için optimum denatürasyon sıcaklık parametrelerinin seçimi önemli koşul amplifikasyon sırasında. İlk adımdaki denatürasyon sıcaklığı 95'in üzerindeyse Ö C, birincil denatürasyondan sonra reaksiyon karışımına DNA polimerazın eklenmesi önerilir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) sırasında aşamanın bu elemanının süresi, tam DNA denatürasyonu için yeterli olmalıdır, ancak aynı zamanda belirli bir sıcaklıkta DNA polimerazın aktivitesini önemli ölçüde etkilememelidir.

tavlama. Tavlama sıcaklığı (T a ) polimeraz zincir reaksiyonunun en önemli parametrelerinden biridir. Her bir spesifik primer için tavlama sıcaklığı ayrı ayrı seçilir. Primerin uzunluğuna ve nükleotit bileşimine bağlıdır. Genellikle 2 - 4 oranında daha düşüktür Ö Erime noktası değerinden (T m ) astar. Sistemin tavlama sıcaklığı optimumun altındaysa, spesifik olmayan amplifiye fragmanların sayısı artar ve tersine, daha yüksek bir sıcaklık amplifiye ürünlerin sayısını azaltır. Bu durumda, spesifik amplikonların konsantrasyonu, polimeraz zincir reaksiyonunun (PCR) inhibisyonuna kadar keskin bir şekilde düşebilir. Tavlama süresinin artması, spesifik olmayan amplikonların sayısında da bir artışa yol açar.

Uzama. Tipik olarak, termostabil DNA polimerazın her tipi, bireysel bir optimum aktivite sıcaklığına sahiptir. Tamamlayıcı bir DNA zincirinin bir enzim tarafından sentezlenme hızı da her polimeraza özgü bir değerdir (ortalama olarak saniyede 30-60 nükleotit veya dakikada 1-2 bin bazdır), bu nedenle uzama süresi bağlı olarak seçilir. DNA polimeraz tipi ve amplifiye bölgenin uzunluğu.

1.5.3 Astar seçiminin temel ilkeleri

Bir PCR test sistemi oluştururken, ana görevlerden biri, bir dizi kriteri karşılaması gereken doğru primer seçimidir:

Primerler spesifik olmalıdır. 3'e özellikle dikkat edilir. - Taq polimerazın tamamlayıcı DNA zincirini tamamlamaya başladığı primerlerin uçları. Spesifiklikleri yetersizse, reaksiyon karışımı ile test tüpünde istenmeyen süreçlerin, yani spesifik olmayan DNA'nın (kısa veya uzun fragmanlar) sentezinin meydana gelmesi muhtemeldir. Ağır veya hafif ek bantlar şeklinde elektroforezde görülebilir. Spesifik bir amplifikasyon ürününü sentezlenmiş yabancı DNA ile karıştırmak kolay olduğundan, bu, reaksiyonun sonuçlarının değerlendirilmesini zorlaştırır. Primerlerin ve dNTP'lerin bir kısmı, belirgin bir duyarlılık kaybına yol açan spesifik olmayan DNA'nın sentezi için tüketilir.

Primerler dimerler ve ilmekler oluşturmamalıdır, örn. Primerlerin kendilerine veya birbirlerine tavlanması ile stabil çift iplik oluşmamalıdır.

1.5.4 Plato etkisi

Spesifik amplifikasyon ürünlerinin biriktirme sürecinin katlanarak yalnızca sınırlı bir süre aldığı ve daha sonra etkinliğinin kritik düzeyde düştüğü belirtilmelidir. Bu sözde "plato" etkisinden kaynaklanmaktadır.

vadeli etki plato amplifikasyonun son döngülerinde PCR ürünlerinin birikme sürecini tanımlamak için kullanılır.

Amplifikasyon reaksiyonunun koşullarına ve döngü sayısına bağlı olarak, etkinin elde edildiği zaman plato substratların kullanımı (dNTP'ler ve primerler), reaktanların stabilitesi (dNTP'ler ve enzim), pirofosfatlar ve DNA dupleksleri dahil olmak üzere inhibitörlerin miktarı, spesifik olmayan ürünler veya primer-dimerler ile reaktanlar için rekabet, spesifik bir ürünün konsantrasyonu ve amplifikasyon ürünlerinin yüksek konsantrasyonlarında eksik denatürasyon.

Hedef DNA'nın başlangıç ​​konsantrasyonu ne kadar düşük olursa, reaksiyon riski o kadar yüksek olur. plato". Bu nokta, belirli amplifikasyon ürünlerinin sayısı analiz için yeterli olmadan önce ortaya çıkabilir. Yalnızca iyi optimize edilmiş test sistemleri bunu önleyebilir.

1.5.5 Biyolojik materyalden numune hazırlama

Görevlere bağlı olarak DNA ekstraksiyonu için farklı teknikler kullanılır. Özleri, biyolojik bir üründen DNA'nın ekstraksiyonu (ekstraksiyonu) ve PCR için uygun saflıkta bir DNA preparasyonu elde etmek için yabancı safsızlıkların çıkarılması veya nötrleştirilmesinde yatmaktadır.

Marmur tarafından açıklanan saf bir DNA preparasyonu elde etme yöntemi standart olarak kabul edilir ve şimdiden klasik hale gelmiştir. Enzimatik proteolizi takiben deproteinizasyon ve DNA'nın alkolle yeniden çökeltilmesini içerir. Bu yöntem, saf bir DNA preparasyonu elde etmeyi mümkün kılar. Ancak oldukça zahmetlidir ve fenol ve kloroform gibi agresif ve yakıcı maddelerle çalışmayı gerektirir.

Şu anda popüler olan yöntemlerden biri Boom ve arkadaşları tarafından önerilen DNA ekstraksiyon yöntemidir. Bu yöntem, hücre lizisi için güçlü bir kaotropik ajan olan guanidin tiyosiyanatın (GuSCN) kullanımına ve ardından bir taşıyıcı (cam boncuklar, diyatomlu toprak, cam süt, vb.) üzerinde DNA sorpsiyonuna dayanır. Yıkamalardan sonra, DNA, bir elüsyon tamponu kullanılarak kolayca çıkarılabileceği taşıyıcı üzerinde adsorbe edilmiş numunede kalır. Yöntem uygun, teknolojik olarak gelişmiş ve amplifikasyon için örnek hazırlamaya uygundur. Bununla birlikte, çok sayıda yıkama sırasında olduğu gibi, taşıyıcı üzerindeki geri döndürülemez soğurma nedeniyle DNA kayıpları da mümkündür. Bu, numunede az miktarda DNA ile çalışırken özellikle önemlidir. Ayrıca eser miktarda GuSCN bile PCR'ı inhibe edebilir. Bu nedenle, bu yöntemi kullanırken doğru sorbent seçimi ve teknolojik nüanslara dikkatle uyulması çok önemlidir.

Başka bir numune hazırlama yöntemi grubu, camdan farklı olarak DNA'yı adsorbe etmeyen, tersine reaksiyona müdahale eden safsızlıkları soğuran Chilex tipi iyon değiştiricilerin kullanımına dayanmaktadır. Kural olarak, bu teknoloji iki aşama içerir: numunenin kaynatılması ve safsızlıkların bir iyon değiştirici üzerinde adsorpsiyonu. Yöntem, yürütme basitliği nedeniyle son derece çekicidir. Çoğu durumda, klinik materyalle çalışmak için uygundur. Ne yazık ki, bazen iyon değiştiriciler kullanılarak giderilemeyen safsızlıklara sahip numuneler vardır. Ayrıca bazı mikroorganizmalar basit kaynatma ile yok edilemez. Bu durumlarda, numune işlemenin ek aşamalarını uygulamak gerekir.

Bu nedenle, numune hazırlama yönteminin seçimi, amaçlanan analizlerin amaçları anlaşılarak ele alınmalıdır.

1.5.6 Amplifikasyon

Amplifikasyon reaksiyonunu gerçekleştirmek için reaksiyon karışımını hazırlamak ve analiz edilen DNA örneğini buna eklemek gerekir. Bu durumda, astar tavlamasının bazı özelliklerini dikkate almak önemlidir. Gerçek şu ki, kural olarak, analiz edilen biyolojik numunede, reaksiyonda kullanılan primerlerin kısmi ve bazı durumlarda önemli homolojiye sahip olduğu çeşitli DNA molekülleri vardır. Ek olarak, primerler birbirlerine tavlanarak primer-dimerler oluşturabilirler. Her ikisi de yan (spesifik olmayan) reaksiyon ürünlerinin sentezi için önemli miktarda primer tüketimine yol açar ve sonuç olarak sistemin hassasiyetini önemli ölçüde azaltır. Bu, elektroforez sırasında reaksiyon sonuçlarını okumayı zorlaştırır veya imkansız hale getirir.

1.6 Standart PCR reaksiyon karışımının bileşimi

x PCR tamponu (100 mM Tris-HCl solüsyonu, pH 9.0, 500 mM KCl solüsyonu, 25 mM MgCl2 solüsyonu ) …….2.5 µl

Su (MilliQ) ……………………………………………………….18,8 µl

Bir nükleotit trifosfat karışımı (dNTP'ler)

Her birinin mM çözeltisi………………………………………….……….0,5 µl

Primer 1 (10 mM solüsyon) ………………………………………….….1 µl

Primer 2 (10 mM solüsyon) ………………………………………….….1 µl

DNA polimeraz (5 birim / µl) ……………………………………………0,2 µl

DNA örneği (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Reaksiyon sonuçlarının değerlendirilmesi

PCR sonuçlarını doğru bir şekilde değerlendirmek için, bu yöntemin kantitatif olmadığını anlamak önemlidir. Teorik olarak, tek hedef DNA moleküllerinin amplifikasyon ürünleri, 30-35 döngüden sonra elektroforez ile tespit edilebilir. Bununla birlikte, pratikte bu, yalnızca reaksiyonun hayatta pek rastlanmayan ideale yakın koşullar altında gerçekleştiği durumlarda yapılır. DNA preparasyonunun saflık derecesi, amplifikasyonun etkinliği üzerinde özellikle büyük bir etkiye sahiptir; reaksiyon karışımında bazı durumlarda kurtulması son derece zor olabilen bazı inhibitörlerin varlığı. Bazen varlıkları nedeniyle onbinlerce hedef DNA molekülünü bile çoğaltmak mümkün olmaz. Bu nedenle, başlangıçtaki hedef DNA miktarı ile son amplifikasyon ürünü miktarı arasında genellikle doğrudan bir ilişki yoktur.

Bölüm 2: Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Uygulamaları

PCR birçok alanda analiz amaçlı ve bilimsel deneylerde kullanılmaktadır.

Kriminalistik

PCR sözde "genetik parmak izlerini" karşılaştırmak için kullanılır. Olay mahallinden bir genetik materyal örneğine ihtiyacımız var - kan, tükürük, meni, saç, vs. Şüphelinin genetik materyali ile karşılaştırılır. Teorik olarak çok az miktarda DNA yeterlidir - bir kopya. DNA fragmanlar halinde kesilir, ardından PCR ile amplifiye edilir. Fragmanlar, DNA elektroforezi ile ayrılır. DNA bantlarının konumunun ortaya çıkan resmine genetik parmak izi denir.

babalık kurulması

PCR ile amplifiye edilmiş DNA fragmanlarının elektroforez sonuçları. Baba. Çocuk. Anne. Çocuk, her iki ebeveynin genetik izinin bazı özelliklerini miras aldı ve bu da yeni, benzersiz bir iz verdi.

"Genetik parmak izleri" benzersiz olsa da, bu tür birkaç parmak izi yapılarak aile bağları kurulabilir. Aynı yöntem, küçük değişikliklerle organizmalar arasında evrimsel ilişkiler kurmak için uygulanabilir.

Tıbbi teşhis

PCR, kalıtsal tanıyı önemli ölçüde hızlandırmayı ve kolaylaştırmayı mümkün kılar ve viral hastalıklar. İlgili gen, uygun primerler kullanılarak PCR ile amplifiye edilir ve daha sonra mutasyonları belirlemek için sekanslanır. Viral enfeksiyonlar enfeksiyondan hemen sonra, hastalığın semptomları ortaya çıkmadan haftalar veya aylar önce tespit edilebilir.

Kişiselleştirilmiş tıp

Bazen ilaçlar bazı hastalar için toksik veya alerjen olabilir. Bunun nedenleri kısmen, ilaçların ve türevlerinin duyarlılığı ve metabolizmasındaki bireysel farklılıklardır. Bu farklılıklar genetik düzeyde belirlenir. Örneğin, bir hastada belirli bir sitokrom daha aktif olabilir, diğerinde - daha az. Ne tür bir sitokromun bulunduğunu belirlemek için bu hasta, ilacı kullanmadan önce bir PCR analizi yapılması önerilir. Bu analize ön genotipleme denir.

gen klonlama

Gen klonlama, genleri izole etme ve genetik mühendisliği manipülasyonlarının bir sonucu olarak, belirli bir genin ürününün büyük bir miktarını elde etme işlemidir. PCR, daha sonra bir vektöre, yabancı geni aynı organizmaya veya büyümesi kolay başka bir organizmaya taşıyan bir DNA parçasına yerleştirilen bir geni çoğaltmak için kullanılır. Vektörler olarak örneğin plazmitler veya viral DNA kullanılır. Genlerin yabancı bir organizmaya eklenmesi genellikle bu genin bir ürününü elde etmek için kullanılır - RNA veya çoğu zaman bir protein. Bu şekilde, endüstriyel miktarlarda kullanılmak üzere birçok protein elde edilir. tarım, ilaç vb.

DNA dizilimi

Sıralama yönteminde floresan etiketli veya radyoaktif izotop dideoxynucleotides PCR, polimerizasyon sırasında floresan veya radyoaktif bir etiketle işaretlenmiş nükleotit türevlerinin DNA zincirine sokulması nedeniyle ayrılmaz bir parçadır. Bu, reaksiyonu durdurur ve jelde sentezlenen şeritlerin ayrılmasından sonra spesifik nükleotitlerin konumlarının belirlenmesine izin verir.

mutagenez

Şu anda, PCR ana mutagenez yöntemi haline gelmiştir. PCR kullanımı, mutajenez prosedürünü basitleştirmeyi ve hızlandırmayı ve ayrıca daha güvenilir ve tekrarlanabilir hale getirmeyi mümkün kıldı.

PCR yöntemi, bu çalışmadan 40 yıl önce parafine gömülmüş insan servikal neoplazmalarının biyopsi bölümlerinde insan papilloma virüsü dizilerinin varlığını analiz etmeyi mümkün kıldı. Üstelik PCR yardımıyla 7 bin yaşındaki insan beyninin fosil kalıntılarından mitokondriyal DNA parçalarını çoğaltmak ve klonlamak mümkün oldu!

Bireysel insan spermlerinin lizatlarında, farklı homolog olmayan kromozomlar üzerinde bulunan iki lokusun eş zamanlı olarak analiz edilmesi olasılığı gösterilmiştir. Bu yaklaşım, hassas genetik analiz ve kromozomal rekombinasyon, DNA polimorfizmi vb. çalışmaları için eşsiz bir fırsat sağlar. Bireysel spermatozoayı analiz etme yöntemi, hemen pratik uygulama bulmuştur. adli tıp, çünkü haploid hücrelerin HLA tiplemesi, babalığı belirlemeyi veya bir suçluyu tanımlamayı mümkün kılar (HLA kompleksi, insan ana histo-uyumluluk kompleksi için bir dizi gendir; HLA kompleksinin lokusları, yüksek omurgalılarda bilinenlerin en polimorfik olanlarıdır: bir tür içinde, her lokusta alışılmadık derecede çok sayıda farklı alel vardır - aynı genin alternatif biçimleri).

PCR kullanılarak, incelenen hücrelerin genomunun önceden belirlenmiş bir bölgesinde yabancı genetik yapıların entegrasyonunun doğruluğunu belirlemek mümkündür. Toplam hücresel DNA, biri konakçı DNA'nın ekleme noktasına yakın bölgesine tamamlayıcı olan ve diğeri antiparalel DNA zincirindeki entegre fragmanın dizisine tamamlayıcı olan iki oligonükleotid primeri ile tavlanır. Önerilen yerleştirme yerinde değişmemiş bir kromozomal DNA yapısı durumunda polimeraz zincir reaksiyonu, belirsiz boyutta tek sarmallı DNA fragmanlarının ve planlı bir yerleştirme durumunda, bilinen bir çift sarmallı DNA fragmanlarının oluşumuna yol açar. boyut, iki primerin tavlama bölgeleri arasındaki mesafe ile belirlenir. Ayrıca, ilk durumda genomun analiz edilen bölgesinin amplifikasyon derecesi, döngü sayısına doğrusal olarak ve ikinci durumda - üssel olarak bağlı olacaktır. PCR sırasında önceden belirlenmiş bir boyutta amplifiye edilmiş bir fragmanın üstel birikimi, bir DNA preparasyonunun elektroforetik fraksiyonasyonundan sonra bunun görsel olarak gözlemlenmesini ve kromozomal DNA'nın belirli bir bölgesine yabancı bir sekansın eklenmesi hakkında kesin bir sonuca varılmasını mümkün kılar.

Çözüm

PCR yöntemi şu anda çeşitli bulaşıcı hastalıkların teşhisi için bir yöntem olarak en yaygın şekilde kullanılmaktadır. PCR, analiz için alınan örnek patojenin yalnızca birkaç DNA molekülünü içerse bile enfeksiyonun etiyolojisini belirlemenizi sağlar. PCR yaygın olarak kullanılmaktadır. erken teşhis HIV enfeksiyonları, viral hepatit vb. Bugüne kadar, PCR kullanılarak tespit edilemeyen neredeyse hiçbir bulaşıcı ajan yoktur.

Kullanılan literatür listesi

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Moleküler - genetik analiz yöntemleri. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 s.

2.PCR "gerçek zamanlı" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. ve benzeri.; ed. b. n. D.V. Rebrikov; önsöz Los Angeles Osterman ve akad. RAS ve RAAS E.D. Sverdlov; 2. baskı, rev. ve ek - M.: BİNOM. Bilgi Laboratuvarı, 2009. - 223 s.

.Patrushev L.I. Yapay genetik sistemler. - M.: Nauka, 2005. - 2 tonda

.B. Glick, J. Pasternak Moleküler biyoteknoloji. İlkeler ve uygulama 589 sayfa, 2002

5.Shchelkunov S.N. genetik mühendisliği. - Novosibirsk: Sib. üniversite yayınevi, 2004. - 496 s.

Düzenleyen A.A. Vorbyeva "Polimeraz zincir reaksiyonu ve bunun dermatovenereolojide diagnostik uygulaması"; Tıp Haber Ajansı - 72 sayfa

https://ru. wikipedia.org

http://bilgin. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - Medikal dergi

özel ders

Bir konuyu öğrenmek için yardıma mı ihtiyacınız var?

Uzmanlarımız ilginizi çeken konularda tavsiyelerde bulunacak veya özel ders vereceklerdir.
Başvuru yapmak Konsültasyon alma olasılığını öğrenmek için şu anda konuyu belirtmek.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)

PCR yönteminin özü. DNA polimeraz

Polimeraz zincir reaksiyonu, belirli nükleik asit fragmanlarının düşük konsantrasyonlarında önemli bir artış elde etmeyi sağlayan deneysel bir moleküler biyoloji yöntemidir. biyolojik malzeme. DNA'nın kopya sayısını arttırma işlemine denir. amplifikasyon. PCR sırasında DNA kopyalama, özel bir enzim tarafından gerçekleştirilir - polimeraz. DNA polimeraz (Şekil 3), DNA'nın replikasyonunda (DNA'nın canlı organizmalarda amplifikasyonu) yer alan bir enzimdir. Bu sınıftaki enzimler, enzimin "okuduğu" ve bir şablon olarak kullandığı DNA nükleotit zinciri boyunca deoksiribonükleotitlerin polimerizasyonunu katalize eder. Yeni bir nükleotidin tipi, okumanın gerçekleştirildiği şablon ile tamamlayıcılık ilkesi tarafından belirlenir.

DNA polimeraz, birleştirilmiş zincirin 3" ucuna serbest nükleotitler ekler. Bu, zincirin 5"-3 yönünde uzamasına yol açar. Bilinen DNA polimerazların hiçbiri "sıfırdan" bir zincir oluşturamaz: onlar sadece zaten var olan 3"-hidroksil grubuna nükleotidler ekleyebilir. Bu nedenle DNA polimeraz ihtiyacı astar- incelenen genin uç kısımlarını tamamlayan kısa bir nükleotid dizisi (genellikle 20-25) - buna ilk nükleotidi ekleyebildi. Primerler her zaman DNA ve RNA bazlarından oluşur ve ilk iki baz daima RNA bazlarıdır. Primerler başka bir enzim tarafından sentezlenir - primaz. Diğer bir enzim ise sarmal- DNA çift sarmalının, yarı koruyucu DNA replikasyon modeline göre her iki sarmalın da replikasyonunu sağlayan tek sarmallı bir yapının oluşumu ile çözülmesi için gereklidir.

Bazı DNA polimerazlar ayrıca yeni birleştirilmiş DNA sarmalındaki hataları düzeltme yeteneğine de sahiptir. Yanlış bir nükleotit çifti tespit edilirse, DNA polimeraz bir adım geri gider, yanlış nükleotidi zincirden çıkarır, ardından doğru olanı yerine yerleştirir ve ardından replikasyon her zamanki gibi devam eder.

PCR yapılması

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), belirli bir DNA dizisini izole edip birkaç saat içinde milyarlarca kez çoğaltabilen bir DNA amplifikasyon yöntemidir. Kesin olarak tanımlanmış bir genom bölgesinin çok sayıda kopyasını elde etme yeteneği, mevcut bir DNA örneğinin çalışılmasını büyük ölçüde basitleştirir.

Polimeraz zincir reaksiyonunun gerçekleşmesi için bir dizi koşulun karşılanması gerekir. PCR için en basit durumda aşağıdaki bileşenler gereklidir:

Amplifiye edilecek DNA bölümünü içeren bir DNA şablonu.

İstenen parçanın uçlarını tamamlayan iki primer. (Hedef DNA'nın karşılık gelen bölgelerine özdeş, genellikle 15 ila 30 bp boyutunda, yapay olarak sentezlenmiş bir çift oligonükleotit. Bunlar, amplifikasyon reaksiyon ürünlerinin oluşumunda önemli bir rol oynar. Uygun şekilde seçilen primerler, testin özgüllüğünü ve duyarlılığını sağlar sistem.)

Termostabil DNA polimeraz. PCR'de kullanılan polimeraz yüksek sıcaklıkta aktif kalmalıdır. uzun zaman bu nedenle termofillerden izole edilen enzimler - Thermus Mediterraneanus (Taq polimeraz) ve diğerleri kullanılır.

Deoksinükleotit trifosfatlar (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Polimerazın çalışması için gerekli Mg 2+ iyonları.

tampon çözüm sağlayan gerekli koşullar reaksiyonlar - pH, çözeltinin iyonik gücü. Tuzlar, serum albümini içerir.

Reaksiyon karışımının buharlaşmasını önlemek için test tüpüne vazelin gibi yüksek kaynama noktalı bir yağ eklenir. Isıtmalı kapaklı bir cihaz kullanılıyorsa buna gerek yoktur.

Pirofosfataz ilavesi, PCR reaksiyonunun verimini artırabilir. Bu enzim, büyüyen DNA ipliğine nükleotit trifosfatların eklenmesinin bir yan ürünü olan pirofosfatın ortofosfata hidrolizini katalize eder. Pirofosfat, PCR reaksiyonunu inhibe edebilir.

Orijinal DNA'nın kopya sayısını çoğaltmak için döngüsel bir reaksiyona ihtiyaç vardır. Kural olarak, sırayla tekrarlanan PCR döngülerinin her biri üç aşamadan oluşur:

1. DNA'nın denatürasyonu veya "erimesi".Çift sarmallı DNA şablonu, DNA sarmallarının ayrılmasını sağlamak için 0,5 - 2 dakika süreyle 94 - 96°C'ye (veya özellikle termostabil bir polimeraz kullanılıyorsa 98°C'ye) ısıtılır. Bu adıma denatürasyon denir çünkü iki DNA zinciri arasındaki hidrojen bağları kırılır. Bazen, ilk döngüden önce (polimeraz eklenmeden önce), şablon ve primerleri tamamen denatüre etmek için reaksiyon karışımı 2-5 dakika önceden ısıtılır. Bu yaklaşım denir sıcak başlangıç, spesifik olmayan reaksiyon ürünlerinin miktarını azaltmaya izin verir.

2. Tavlama - primerlerin şablon DNA'ya bağlanması. Teller ayrıldıktan sonra, primerlerin tek iplikçikli kalıba bağlanmasına izin vermek için sıcaklık yavaşça düşürülür. Tavlama sıcaklığı primer bileşimine bağlıdır ve genellikle 50–65°C olarak seçilir. Aşama süresi - 20 - 60 saniye. yanlış seçim tavlama sıcaklığı ya primerlerin kalıba zayıf bağlanmasına (yüksek sıcaklıkta) ya da yanlış yerde bağlanmaya ve spesifik olmayan ürünlerin görünmesine (düşük sıcaklıkta) yol açar.

3. sentez (zincir uzaması). DNA polimeraz, primeri bir "tohum" olarak kullanarak şablon şeridi çoğaltır. Polimeraz, kalıba bağlanan ve kalıp boyunca hareket eden primerin 3" ucundan ikinci ipliğin sentezini başlatır. Uzama sıcaklığı polimeraza bağlıdır. Yaygın olarak kullanılan Taq ve Pfu polimerazlar en çok 72'de aktiftir. °C amplifiye edilecek parçanın uzunluğu Tipik olarak, uzama süresi her bin baz çifti için bir dakika olarak alınır Tüm döngüler tamamlandıktan sonra, genellikle ek bir adım gerçekleştirilir son uzama tüm tek sarmallı parçaları tamamlamak için. Bu aşama 7 - 10 dakika sürer.

Daha sonra denatürasyon, tavlama ve uzama aşamaları birçok kez (30 veya daha fazla) tekrarlanır. Her döngüde, bir DNA fragmanının sentezlenen kopyalarının sayısı iki katına çıkar.

Tüm reaksiyonlar, bir termostata batırılmış test tüplerinde gerçekleştirilir. Sıcaklık rejiminin değiştirilmesi ve bakımı otomatik olarak gerçekleştirilir.

PCR sırasında belirli bir DNA segmentinin amplifikasyonunun tam olarak nasıl gerçekleştiğini anlamak için, her turda amplifiye edilebilir zincirlerdeki tüm primerlerin ve bunların tamamlayıcı dizilerinin konumunu açıkça anlamak gerekir. İlk turda, yeni sentezlenen zincirlerin her biri, kendi primerinin 3"-hidroksil grubu ile ikinci primeri tamamlayan dizinin terminal nükleotidine olan mesafeden çok daha uzundur. Bu tür zincirlere "uzun şablonlar" denir. onlar üzerinde daha fazla sentez gerçekleşecek.

İkinci turda, benzer ve yeni sentezlenmiş (uzun şablon) ipliklerden oluşan çift sarmallı DNA tekrar denatüre edilir ve ardından primerlerle tavlanır. Bu turdaki sentez sırasında, "uzun şablonlar" ve ayrıca bir uçta bir primer ve diğer uçta ikinci primeri tamamlayıcı bir sekans ("kısa şablonlar") bulunan bir dizi iplikçik yeniden sentezlenir. Üçüncü tur sırasında, daha önce oluşturulan tüm heterodupleksler aynı anda denatüre edilir ve primerlerle tavlanır ve ardından çoğaltılır. Sonraki turlarda, giderek daha fazla "kısa matris" vardır ve 30. turda sayıları, ilk zincirlerin veya "uzun matrislerin" sayısından 10 6 kat daha fazladır.

Spesifik reaksiyon ürününün miktarı (primerlerle sınırlıdır) teorik olarak orantılı olarak 2 n'ye yükselir; burada n, reaksiyon döngülerinin sayısıdır. Aslında, her döngünün verimliliği %100'den az olabilir, yani gerçekte:

burada P ürün miktarı, E çevrimin ortalama verimliliğidir.

"Uzun" DNA kopyalarının sayısı da artar, ancak doğrusal olarak, bu nedenle reaksiyon ürünlerinde belirli bir fragman hakimdir. Gerekli ürünün büyümesi, reaktiflerin miktarı, inhibitörlerin varlığı ve yan ürünlerin oluşumu ile üstel olarak sınırlıdır.

PCR oldukça hassas bir yöntemdir, bu nedenle test örneğinde yanlışlıkla bir reaksiyon karışımından diğerine geçen önemsiz miktarda DNA varsa bile yanlış pozitif sonuçlar alınabilir. Bu, PCR için kullanılan tüm solüsyonların ve aletlerin dikkatli bir şekilde kontrol edilmesini gerekli kılar.

Primer seçiminin temel ilkeleri.

Bir PCR test sistemi oluştururken, ana görevlerden biri, bir dizi kriteri karşılaması gereken doğru primer seçimidir:

1. Primerler spesifik olmalıdır. Primerlerin 3 "ucuna özellikle dikkat edilir, çünkü Taq polimerazın tamamlayıcı DNA zincirini tamamlamaya başladığı yer burasıdır. Spesifiklikleri yetersizse, reaksiyon karışımı ile test tüpünde büyük olasılıkla istenmeyen işlemler meydana gelecektir. , yani spesifik olmayan DNA'nın (kısa veya uzun fragmanlar) sentezi. Elektroforezde ağır veya hafif ek bantlar şeklinde görülebilir. sentezlenmiş yabancı DNA ile amplifikasyon ürünü. Bazı primerler ve dNTP'ler, spesifik olmayan DNA'nın sentezi için tüketilir ve bu da önemli bir duyu kaybına yol açar.

2. Primerler dimer ve ilmek oluşturmamalıdır, örn. Primerlerin kendilerine veya birbirlerine tavlanması ile stabil çift iplik oluşmamalıdır.