ステップPCR。 PCR：それは何ですか？ポリメラーゼ連鎖反応を利用した感染症の診断。新生児学における PCR の応用

PCR 分析 (PCR 診断) の実施は、婦人科医、泌尿器科医、皮膚科医による検査のための材料の収集から始まります。その後得られる結果の品質と信頼性は、Euromedprestige 医療センターの医師の最高の資格と豊富な経験によって保証されており、完全な無菌性、使い捨て材料のみの使用など、PCR 分析を実施するために必要なすべての規則を遵守しています。

ブラシから収集した材料は、生理食塩水の入った容器に入れられます。採取後、サンプルはできるだけ早く PCR 検査室に届ける必要があります。

PCR 分析は研究室で次の 3 段階で実行されます。

DNA抽出
DNA断片の増幅
DNA増幅産物の検出

DNA 抽出は PCR 診断の初期段階であり、その本質は次のとおりです。医師が研究用の材料を患者から受け取り、それに特別な処理を施します。加工中に分割が発生する二重らせん DNA を別々の鎖に分離します。特別な液体が患者の材料に添加され、反応の「純度」を妨げる有機物質を溶解します。これにより、脂質、アミノ酸、ペプチド、炭水化物、タンパク質、多糖類が除去されます。その結果、DNAまたはRNAが形成されます。

PCR 法の原理は、新たな DNA または RNA 感染を「構築」することです。これは細胞物質を除去せずに行うことはできません。

DNA 抽出にかかる時間は、感染の原因物質と PCR 研究に使用される材料の種類によって異なります。たとえば、次の段階に向けて血液を準備するには 1.5 ～ 2 時間かかります。

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DNA増幅

DNA 診断の次の段階である DNA 増幅を実行するために、医師はいわゆる DNA マトリックス、つまり感染症の DNA 分子を使用し、その後その上に DNA の「クローニング」が行われます。感染の完全な DNA が存在する必要はないことはすでに述べましたが、この段階を実行するには、特定の微生物 (感染) にのみ固有の DNA 分子の小片があれば十分です。

DNA 増幅の基礎、つまり PCR 反応の原理全体の基礎は、すべての生物の DNA 完成の自然なプロセスである DNA 複製であり、これは単一の DNA 鎖を倍加することによって行われます。

DNA の 1 つの断片から始めて、検査医師はそれをコピーし、連鎖反応モードでコピー数を増やします。最初のサイクルの後、すでに 2 つの断片があり、2 番目のサイクルの後 - 4、3 番目のサイクルの後 - 8、そして4 番目 - 16、次に 32 、 64、128、256... サイクルごとにコピーの数は 2 倍になり、20 サイクル後にはカウントがすでに数百万になり、30 サイクル後には数十億になります。このサイクルは数分で終わり、最終的には非常に小さな化学反応器内で温度が一定に変化します。ここで、溶液中には、合成に必要なすべての成分が十分な量で存在しており、まず第一に、ヌクレオチド A、G、T、C が存在し、それぞれから正確なコピーが即座に取得されるように、繊細な準備化学操作も実行されます。完成した DNA セグメント、次にこのコピーから - 再びコピー、これが分岐鎖反応です。

DNA 鎖 (微生物 (感染症) の DNA に似た人工的に合成された DNA (ヌクレオチド対) の「部分」) にプライマーを結合することにより、2 本の DNA セクションからなる 2 つの短いらせんが形成されます。これは将来のタンパク質の合成に必要です。 DNA。

新しい鎖の合成は、2 本の DNA 鎖がそれぞれ完成することによって行われます。増幅プロセスは特定の領域、つまり名前の由来となった DNA ポリメラーゼの助けを借りて行われます。実験室の方法。ポリメラーゼは反応の触媒として機能し、成長する新しい DNA 鎖へのヌクレオチド塩基の連続的な結合を監視します。

したがって、DNA 増幅は、特異的な、つまり特定の生物にのみ固有の DNA コピー数の倍増です。感染因子を確認するために DNA 鎖全体を完成させる必要はありません。特定の細菌を個体として特徴づける領域のみが必要です。

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反復性の高い増幅ステップはすべて、異なる温度で行われます。 PCR 分析を実行するには、温度を自動的に変更する、特別にプログラム可能な装置、PCR、サーモスタットまたはアンプが使用されます。増幅は、検出される感染の種類に対応する所定のプログラムに従って実行されます。プログラムと検出される感染の種類に応じて、自動 PCR プロセスには 2 ～ 3 時間かかります。

PCR 診断では、分析を行う検査医師の資格が重要な役割を果たします。PCR 装置の正しい設定と結果の解釈は検査医師に依存します。 Euromedprestige Medical Center の医師は、DNA 診断の実施において豊富な経験を持っており、研究結果の信頼性を確保し、治療の確実な成功を保証します。感染症。 Euromedprestige医療センターでPCR検査を受け、感染症の完全な診断と治療を実施します。

増幅産物の検出中に、得られた増幅産物の混合物が分離されます。特別な溶液が混合物に加えられ、DNA断片に蛍光を発する能力が与えられ、オレンジと赤の発光ストライプが反射されます。結果として生じる光は、PCR 分析のために患者から採取された物質中にウイルス、微生物、または細菌の DNA が存在することを示します。

ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は、あらゆる段階 (急性または慢性) の遺伝性病状、感染症、ウイルス性疾患を診断する分野における高精度の方法です。初期段階- 患者から採取したサンプル中の遺伝物質であるDNA、RNAに基づいて病原体を特定することにより、病気の明らかな症状が現れる前に検査します。そして今日は、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 法の本質、診断段階と原理、そしてそのコストについてお話します。

ポリメラーゼ連鎖反応とは何ですか

分析の基礎は増幅 (倍加)、つまりヒトの遺伝的複合体を表す DNA (デオキシリボ核酸) の短いセクションから多数のコピーを作成することです。この研究には、非常に少量の生理学的物質（喀痰、糞便、上皮擦過物、前立腺液、血液、精子、羊水、粘液、胎盤組織、尿、唾液、胸水、脳脊髄液）が必要です。この場合、たとえば、患者の泌尿生殖器内で有害な微生物が 1 個でも検出される可能性があります。

PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）技術は、1993年にノーベル賞を受賞したアメリカの科学者K.マリスによって開発されました。

積極的に使用されているもの:

感染症の早期診断では、遺伝的。
法医学的検査において、検査に利用できる DNA の量が極めて少ない場合。
獣医学、製薬、生物学、分子遺伝学。
DNAによる個人の識別、親子関係の確認のため。
古生物学、人類学、生態学（製品の品質、環境要因を監視する場合）。

このビデオでは、ポリメラーゼ連鎖反応とは何かを詳しく説明します。

誰に処方されるのですか？

感染症の診断におけるポリメラーゼ連鎖反応は、特に正確さと信頼性を備えた最も信頼できる方法の 1 つです。たとえば、クラミジアや他の多くの病原体に対する PCR 分析の信頼性は 100% (絶対) に近いです。ほとんどの場合、ポリメラーゼ連鎖反応手順は、診断中に特定の病原体を特定することが難しい患者に処方されます。

臨床検査 PCR 検査は次の場合に使用されます。

培養または免疫学的方法では特定することが難しい、泌尿器および生殖器の感染を引き起こす病原体を検出する。
最初の検査で陽性だが疑わしい結果が得られた場合（たとえば、エイズに感染した両親から生まれた新生児の場合）、初期段階での HIV の再診断。
確立する癌初期段階（癌遺伝子変異の研究）および特定の患者に対する治療計画の個別の修正。
遺伝性病状の早期発見と治療の可能性を目的としています。

したがって、将来の親は、子供の遺伝的病理の保因者であるかどうかを調べるために検査を受けます。PCRは、遺伝によって伝染する病気にさらされる可能性を決定します。

胎児の病状を検出するため早い妊娠（成長中の胚の個々の細胞が突然変異の可能性について検査されます）。
臓器移植前の患者の場合 - 「組織タイピング」（組織適合性の決定）用。
ドナーの血液中の危険な病原体を特定する。
新生児の場合 - 隠れた感染症を特定するため。
抗ウイルスおよび抗菌治療の結果を評価するため。

なぜそのような処置を受けるのでしょうか？

PCR は非常に効果的な診断方法であり、ほぼ 100% の結果が得られるため、次の手順が使用されます。

最終的な診断を確認または除外するため。
治療の有効性を迅速に評価します。

多くの場合、PCR が唯一の方法です。可能なテスト他の細菌学的、免疫学的、ウイルス学的診断方法が役に立たない場合に、進行中の病気を検出します。

ウイルスは、感染直後、病気の兆候が現れる前に、PCR 手順を使用して検出されます。ウイルスを早期に発見することで、迅速な治療が可能になります。
いわゆる「」ウイルス量」（または体内のウイルスの数）も定量的な方法を使用したDNA分析によって決定されます。
特定の病原体（コッホ結核菌など）は培養が難しく、培養に時間がかかりすぎます。 PCR 検査では、検査に便利なサンプル中の最小限の病原体 (生死問わず) を迅速に検出できます。

詳細な病原体 DNA 分析が使用されます。

特定の種類の抗生物質に対する感受性を判定し、即時治療を可能にする。
家畜および野生動物の間での伝染病の蔓延を制御する。
過去の流行を引き起こした新たな感染性微生物種や病原体のサブタイプを特定し、追跡する。

診断の種類

標準的な方法

ポリメラーゼ連鎖反応分析は、特別なプライマー酵素を使用した DNA および RNA の特定の断片の多重増幅 (倍加) に基づいて実行されます。コピー連鎖の結果、研究に十分な量の資料が得られます。

手順中、サンプル内に実際に存在する場合、目的のフラグメント (指定された特定の条件に対応する) のみがコピーされます。

有用な図を含むこの詳細なビデオでは、PCR がどのように機能するかを説明しています。

その他の方法

リアルタイム PCR。このタイプの研究では、特定の DNA 断片を識別するプロセスは、30 ～ 40 サイクルのチェーン全体が完了した後ではなく、各サイクルの後に開始されます。このタイプの研究では、体内の病原体 (ウイルスまたは微生物) の量に関する情報を取得する、つまり定量分析を実行できます。
RT-PCR (逆転写モード)。この検査は、一本鎖 RNA を探して、遺伝的基盤が RNA であるウイルス (C 型肝炎ウイルス、免疫不全ウイルスなど) を検出するために使用されます。この研究では、逆転写酵素と特定のプライマーという特別な酵素が使用され、RNA に基づいて一本鎖 DNA が構築されます。次に、この鎖から 2 番目の DNA 鎖が回収され、標準的な手順が実行されます。

検査の適応

PCR 手順は、感染症の診療所、新生児科、産科、小児科、泌尿器科、婦人科、性病科、神経科、腎臓科、眼科で使用されています。

検査の適応:

遺伝性病状の可能性のある小児の遺伝子異常を発症するリスクを判断する。
妊娠を計画する際の両親、または妊娠中の母親の重篤な状態を診断する。
妊娠の困難、不妊の原因の特定。
性感染症の疑いがある急性期そして症状が慢性化した場合。
原因の検出炎症過程起源不明。
無防備なカジュアルかつ定期的な性的接触。
特定の抗生物質に対する病原微生物の感受性を決定する。
潜在的な感染が疑われる患者は、明らかな症状が発現する前に病原体を検出します（前臨床診断）。
患者が病気後の回復を確認する (遡及的診断);:

次の病原体を正確に特定する必要がある場合にも、診断が使用されます。

肝炎ウイルス (A B C G)、ヒト免疫不全症、サイトメガロウイルス。
コレラ菌;
単純ヘルペスウイルス、ヘルペス様種。
レトロウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス。
風疹、エプスタイン・バール、水痘（帯状疱疹）ウイルス。
パルボウイルスとピコルノウイルス。
細菌ヘリコバクター・ピロリ。
レジオネラ菌、大腸菌の病原性タイプ。
黄色ブドウ球菌;
病原体;
クロストリジウム菌、ジフテリア菌、インフルエンザ菌。

感染症の判定にも使用されます。

伝染性単核球症;
ボレリア症、リステリア症、ダニ媒介性脳炎。
カンジダ菌によって引き起こされるカンジダ症。
性感染症 – トリコモナス症、ウレアプラズマ症、梅毒トレポネーマ、ガードネレラ症、淋病、マイコプラズマ症、クラミジア;
結核。

禁忌

この手順は患者に対して行われるのではなく、身体に影響を与えることなく、研究のために採取された生物学的材料を使用して行われるため、潜在的な危険がないため、PCRには禁忌がありません。

ただし、膣鏡検査後には、子宮頸管から生体材料は収集されません。分析のための塗抹標本と掻爬物の提出は、月経が終了し、おりものが完全に停止してから 4 ～ 6 日後にのみ許可されます。

その方法は安全ですか?

なし悪影響実験室条件で患者の生体材料を隔離して研究することは不可能です。

手続きの準備（分析用生体物質の提出）

あらゆる体液、組織、または体分泌物は、外来病原体の DNA を検出する PCR 分析のサンプルとして機能します。被験物質は静脈から採血したり、喉頭、鼻腔、尿道から採取したりする形で採取されます。胸膜腔、頸部。

診断手順の前に、医師は患者にどのような材料が収集されるかを説明します。

性感染症を検査する場合、生殖器からの分泌物、尿、尿道からの塗抹標本が収集されます。
で分析するとヘルペス感染症、サイトメガロウイルス、単核球症 - 分析のために尿を採取し、肝炎、トキソプラズマ症 - 静脈から血液を採取します。
診断目的のためさまざまな種類脳脊髄液を採取します。
呼吸器科では、分析用のサンプルは喀痰と胸水です。
妊娠中に起こり得る子宮内感染症の研究を行う場合、羊水と胎盤細胞が分析に使用されます。

分析の信頼性と精度は、材料を採取するときの条件の無菌性に依存します。 PCR 検査は非常に感度が高いため、検査物質が汚染されていると結果が歪む可能性があります。

生体材料の送達のための適切な準備は、患者にとって何の問題も引き起こしません。特定の推奨事項があります。

性感染症を分析する場合:
- 素材を提出する72時間前に親密な接触を除外する。
- 膣製品の使用は 3 日前までに中止してください。
- 前日の夕方以降は検査部位の衛生管理を行わないでください。
- 尿道からサンプルを採取する 3 ～ 4 時間前には排尿を控えてください。
感染症検査の1か月前に抗生物質の服用を中止する。
献血は朝、飲食の前に行われます。
朝一番の尿サンプルは、徹底的にトイレを行った後、滅菌容器に採取されます。

ポリメラーゼ連鎖反応法を使用して診断がどのように実行されるかについては、以下をお読みください。

手続きはどのように行われますか?

PCR 研究を実行する場合、リアクター (アンプまたはサーマルサイクラー) 内で特定のサイクルが何度も繰り返されます。

最初のステップは変性です。病原体の DNA (または RNA) の存在が疑われる唾液、血液、生検材料、婦人科サンプル、喀痰は増幅器に入れられ、そこで材料が加熱され、DNA が 2 つの別々の鎖に分割されます。
2 番目のステップは、材料のアニーリングまたはわずかな冷却です。そして、DNA 分子内の目的の領域を認識して結合できるプライマーをそれに追加します。
第三段階は伸びです– 2 つのプライマーが各 DNA 鎖に結合した後に発生します。この過程で病原体の DNA 断片が完成し、そのコピーが形成されます。

これらのサイクルは「連鎖反応」のように繰り返され、そのたびに特定の DNA フラグメント (たとえば、特定のウイルスがプログラムされているセグメント) のコピーが 2 倍になります。数時間以内に、DNA 断片の多くのコピーが形成され、サンプル中のそれらの存在が検出されます。その後、結果が分析され、さまざまな種類の病原体のデータベースのデータと比較されて、感染の種類が特定されます。

PCR 反応に基づく結果と結論の解読については、以下をお読みください。

結果をデコードする

研究の最終結果は、生物学的材料の提出から 1 ～ 2 日後に発行されます。多くの場合、すでに分析後の初日に。

定性分析

ネガティブこの結果は、検査に提出された物質中に感染性物質の痕跡が見つからなかったことを意味します。
ポジティブこの結果は、資料の提出時に生体サンプル中の病原性ウイルスまたは細菌が非常に高い精度で検出されることを意味します。

結果が陽性であっても感染増加の兆候が検出されない場合、この体の状態は無症候性の「健康保菌」と呼ばれます。ウイルス性疾患において、特定の場所（子宮頸管、尿道、口腔）から生体材料を採取するときに最もよく観察されます。この場合、治療は必要ありませんが、以下の可能性があるため、継続的な医師の監督が必要です。

キャリアからのウイルスの拡散と健康な人への感染。
プロセスの活性化と病気の慢性形態への移行。

しかし、血液検査が陽性の場合、これは感染が体に起こっていることを示しており、これはもはやキャリア状態ではなく、直ちに特異的な治療を必要とする病状である。

定量分析

定量的な結果は、特定の種類の感染症について専門家によって決定されます。それに基づいて病気の進行度や段階を評価することができ、適切な治療を迅速に処方することが可能になります。

平均コスト

ポリメラーゼ連鎖反応の価格は、研究の種類、病原体の特定の難しさ、生物学的材料の収集の難しさ、分析の種類（定性または定量）、および研究室の価格レベルによって決まります。

一方、PCR の研究では、1 種類の分析材料を収集するだけで、一度に複数の病原体を同定することができます。これにより、他の臨床検査を節約できます。

PCR 分析のおおよその費用 (ルーブル):

淋菌、ガードネレラ、膣トリコモナス – 180～
クラミジア・トラコマチス – 190年から
パピローマウイルス – 380 から 500
女性の泌尿器生殖管の生体内微生物叢（微生物叢の定量的および定性的評価） – 800から。

PCR 検査に関するさらに有益な情報は、以下のビデオに含まれています。

方法の原理（分子生物学的基礎）

DNA 分析のための多種多様なハイブリダイゼーション法の中で、PCR 法は臨床検査診断で最も広く使用されています。

方法の原理 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)(ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)) は、1983 年に Kary Mullis (Cetus、USA) によって開発されました。現在、科学研究と実際の医療および州の衛生疫学監視局 (遺伝子型解析、感染症の診断) における診断の両方に広く使用されています。

PCR 法は、酵素 DNA ポリメラーゼを使用して実行される、DNA マトリックスの相補的完成という自然なプロセスに基づいています。この反応はと呼ばれます DNA複製。

自然な DNA 複製にはいくつかの段階が含まれます。

1) DNAの変性(二重らせんの巻き戻し、DNA 鎖の分岐);

2) 短い二本鎖 DNA セクションの形成(DNA合成を開始するために必要なプライマー);

3) 新しい DNA 鎖の合成(両方のスレッドの補完的な補完)

このプロセスはコピーを取得するために使用できます 特定の微生物に特有の DNA の短いセクション、それらの。感染症の病原体を特定する遺伝子診断の目標である、そのような特定の領域を対象とした検索を実行します。

好熱性細菌からの耐熱性DNAポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ）の発見 テルミス・アクアティクス最適温度は70〜72℃の範囲にあり、これによりDNA複製プロセスを周期的に行い、それをインビトロでの研究に使用することが可能になった。所定のプログラムに従って周期的な温度変化を実行するプログラム可能なサーモスタット (アンプ) の作成により、検査室臨床診断の実践に PCR 法を広く導入するための前提条件が作成されました。合成サイクルを複数回繰り返すと、特定の DNA 断片のコピー数が指数関数的に増加し、単一の微生物細胞を含む可能性のある少量の分析材料から十分な数の DNA コピーを取得することが可能になります。電気泳動によってそれらを識別します。

相補鎖の完成は DNA 配列のどの時点でも始まるのではなく、特定の開始ブロック、つまり短い二本鎖セクションでのみ始まります。このようなブロックを DNA の特定のセクションに取り付けることにより、DNA 鎖の全長に沿ってではなく、このセクションのみで新しい鎖の合成プロセスを指示することができます。特定の DNA セクションに開始ブロックを作成するには、と呼ばれる 2 つのオリゴヌクレオチドプライマー (20 ヌクレオチド対) が必要です。 プライマー。プライマーは、特定のフラグメントの左右の境界にある DNA 配列に相補的であり、新しい DNA 鎖の完成がそれらの間でのみ起こるように配向されています。

したがって、PCR は、酵素 DNA ポリメラーゼによって触媒される特定の DNA 領域のコピー数の倍増 (増幅) です。

増幅を実行するには、次のコンポーネントが必要です。

デオキシヌクレオチド三リン酸 (dNTP) の混合物(新しい相補的な DNA 鎖を合成するための材料である 4 つの dNTP の混合物)

酵素Taqポリメラーゼ(合成された DNA の成長鎖にヌクレオチド塩基を連続的に追加することにより、プライマー鎖の伸長を触媒する熱安定性 DNA ポリメラーゼ)。

緩衝液(酵素活性を維持するために必要なMg2+イオンを含む反応媒体)
RNA ウイルスのゲノムの特定の領域を同定するには、まず酵素リバーターゼ (逆転写酵素) によって触媒される逆転写 (RT) 反応を使用して、RNA テンプレートから DNA コピーを取得します。

目的の特徴的な DNA フラグメントの十分な数のコピーを取得するには、増幅には数回 (20 ～ 40 回) のサイクルが必要です。

各増幅サイクルには、異なる温度条件で発生する 3 つのステージが含まれます

ステージ 1: DNA 変性（二重らせんの編組を解く）。 93～95℃で30～40秒間発生します。

ステージ 2: プライマーの付着 (アニーリング)。プライマーの結合は、特定の領域の境界にある反対側の DNA 鎖上の対応する配列に相補的に発生します。プライマーの各ペアには独自のアニーリング温度があり、その値は 50 ～ 65°C の範囲にあります。アニーリング時間 -20 ～ 60 秒。

ステージ 3: DNA 鎖の完成。 DNA 鎖の相補的付加は、プライマー結合部位から開始して、鎖の 5' 末端から 3' 末端まで反対方向に発生します。新しい DNA 鎖を合成するための材料は、溶液に添加されるデオキシリボヌクレオチド三リン酸 (dNTP) です。合成プロセスは酵素熱安定性 DNA ポリメラーゼ (Taq ポリメラーゼ) によって触媒され、70 ～ 72°C の温度で行われます。合成時間は20～40秒です。

最初の増幅サイクルで形成された新しい DNA 鎖は、2 回目の増幅サイクルの鋳型として機能し、そこで目的の特定の DNA フラグメント (アンプリコン) が形成されます。 (図2を参照)。その後の増幅サイクルでは、アンプリコンは新しい鎖を合成するためのテンプレートとして機能します。したがって、アンプリコンは式 2n に従って溶液中に蓄積します。ここで、n は増幅サイクル数です。したがって、最初の溶液に最初に 1 つの二本鎖 DNA 分子しか含まれていなかったとしても、30 ～ 40 サイクルで約 108 個のアンプリコン分子が溶液中に蓄積します。この量は、アガロースゲル電気泳動によるこのフラグメントの信頼性の高い視覚的検出に十分です。増幅プロセスは、特別なプログラム可能なサーモスタット (アンプ) で実行され、所定のプログラムに従って、増幅サイクル数に応じて温度が自動的に変更されます。

PCR 分析の段階

感染症の実験室診断ツールとしての PCR 法は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、所望の微生物にのみ特異的な病原体の小さな DNA フラグメント (数百塩基対) を検出して目的の情報を蓄積することに基づいています。断片。
PCR 法を使用した分析手順には、次の 3 つの段階があります。

1. 臨床サンプルからの DNA (RNA) の分離

2. 特定の DNA 断片の増幅
3. 増幅産物の検出

DNA (RNA) の分離
分析のこの段階では、臨床サンプルに特別な処理が行われ、その結果、細胞物質の溶解が起こり、タンパク質や多糖類の画分が除去され、不純物を含まない DNA または RNA の溶液が得られます。
阻害剤が存在し、さらなる増幅の準備が整います。
DNA (RNA) 分離技術の選択は、主に処理される臨床材料の性質によって決まります。

特定の DNA 断片の増幅
この段階では、短い特定の DNA フラグメントが、さらなる検出に必要な量だけ蓄積されます。特定のゲノム断片を決定するほとんどの方法では、いわゆる「ゲノム断片」と呼ばれるものが使用されます。「クラシックバージョンダイレクトPCR。分析の特異性と感度を高めるために、一部のメソッドでは 2 対のプライマー (ステージ 1 では「外部」、ステージ 2 では「内部」) を使用する「ネステッド」PCR メソッドが使用されます。

増幅産物の検出
ほとんどの方法では、この段階で、第 2 段階で得られた増幅産物の混合物がアガロースゲルでの水平電気泳動によって分離されます。電気泳動による分離の前に、臭化エチジウム溶液を増幅混合物に添加すると、二本鎖 DNA フラグメントと強力な格子間化合物が形成されます。これらの化合物は、UV 照射下で蛍光を発することができ、アガロースゲルで増幅混合物を電気泳動分離した後、オレンジ色から赤色の発光バンドの形で記録されます。

結果を読み取る際の主観性、1 回の反応でさまざまな微生物の DNA を測定する際の制限など、いくつかの欠点がある電気泳動検出法の代替として、電気泳動検出法を提案できます。 ハイブリダイゼーション検出スキーム。これらのスキームでは、増幅の結果として形成された DNA 断片が特定のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズします (2 本鎖複合体、つまり「ハイブリッド」を形成します)。このような複合体の登録は、比色分析または蛍光分析によって実行できます。 SPF「Litekh」は、ハイブリダイゼーションと結果の蛍光測定登録に基づいた検出キットを作成しました

感染症の診断方法としての PCR 法の利点:

- 直接定義病原体の存在

多くの伝統的な手法診断法、たとえば酵素免疫吸着法は、感染因子の老廃物であるマーカータンパク質を同定しますが、これは感染の存在を示す間接的な証拠のみを提供します。 PCR による病原体 DNA の特定の部分の同定は、感染因子の存在を直接示します。

- 高い特異性
PCR 法の高い特異性は、特定の病原体にのみ特徴的なユニークな DNA フラグメントが研究対象の物質から検出されるという事実によるものです。特異性はプライマーのヌクレオチド配列によって決まります。
抗原の交差反応によるエラーがよくある酵素免疫測定法とは対照的に、誤った結果が得られる可能性があります。

- 高感度
PCR 法を使用すると、細菌やウイルスの単一細胞も検出できます。 PCR 診断は、他の方法（免疫学的、細菌学的、
顕微鏡）これはできません。 PCR 分析の感度はサンプルあたり 10 ～ 1000 細胞です (免疫学的検査および顕微鏡検査の感度は 103 ～ 105 細胞です)。

-さまざまな病原体を同定するための手順の大学
PCR法を用いた研究の材料となるのは病原体のDNAです。この方法は、特定の生物に特異的な DNA または RNA の断片を同定することに基づいています。類似点化学組成すべての核酸を使用することで、統一された実験室研究方法の使用が可能になります。これにより、1 つの生体サンプルから複数の病原体を診断することが可能になります。さまざまな生物学的分泌物（粘液、尿、痰）、上皮細胞の削り取り、血液、血清を試験材料として使用できます。

- 解析結果の取得が高速
PCR 分析では、多くの時間がかかる病原体の分離と培養を必要としません。生体材料の処理方法と反応生成物の検出方法を統一し、増幅工程を自動化することで、完全な分析 4〜4.5時間以内に。

PCR法は、患者から得られた臨床材料だけでなく、環境物体(水、土壌など)から得られた材料からも病原体を検出できることに留意すべきである。

実際の医療における PCR 法の応用

細菌性とウイルス性の両方の感染症を診断するための PCR 法の使用は、微生物学と疫学の多くの問題を解決するために非常に重要です。この方法の使用は、慢性感染症やよく理解されていない感染症の研究分野における基礎研究の発展にも貢献します。

この方法を最も効果的かつ経済的に実行できるのは、次の場合です。

泌尿器科診療- クラミジア、ウレアプラズマ症、淋病、ヘルペス、ガードネレラ症、マイコプラズマ感染症を検出するため。

呼吸器科で- のために鑑別診断ウイルス性と細菌性肺炎、結核。

消化器科- ヘリコバクテリウム症を特定するため。

感染症クリニックで- サルモネラ症、ジフテリアを診断するための迅速な方法としてウイルス性肝炎 B、C、G。

血液学で- サイトメガロウイルス感染、オンコウイルスを検出します。

連邦教育庁

州立教育機関

より高い職業教育

「カレリア国立教育アカデミー」

トピックに関するコースワーク:

ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) とその応用

完成者: 学生 Koryagina Valeria Aleksandrovna

チェック者: カルピコワナタリアミハイロヴナ

ペトロザヴォーツク 2013

導入

第 1 章文献レビュー

1.5.4 プラトー効果

1.5.6 増幅

結論

導入

過去 20 年間は、分子遺伝学的手法が生物学、医学、農業科学に広く導入されたことが特徴です。

1970年代初頭までに、分子生物学はある程度の完成に達したかに見えました。この時代、分子遺伝学的研究の主な対象は微生物でした。真核生物への移行は、当時存在していた遺伝子解析の方法では解決できなかった全く新しい問題を研究者に突きつけました。分子遺伝学の発展におけるブレークスルーは、新しい実験ツールである制限エンドヌクレアーゼの出現のおかげで可能になりました。その後、質的に異なるアプローチに基づく直接 DNA 分析の方法の数が急速に増加し始めました。

最新のテクノロジー多くの場合、それらにより、さまざまな生物の核および核外ゲノムの微細な構造的および機能的構成をより深いレベルで研究し始めることが可能になりました。これは、新しい診断および治療法の開発にとって特に重要でした。さまざまな病気。同様に重要なのは、集団生物学と育種における分子遺伝学の成果を利用して、集団、品種、系統の遺伝的多様性を特定および分析し、経済的に価値のある個体を特定および認定し、遺伝子組み換え生物を作成し、その他の問題を解決できる可能性でした。

各方法には独自の長所と短所があります。発生するすべての問題を解決できる普遍的な方法はありません。したがって、実施される研究のための特定の方法の選択は、あらゆる科学研究の最も重要な段階の 1 つです。

第 1 章文献レビュー

1.1 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の発見の歴史

1983年にKB。 Mullis らは、核酸の研究と応用のすべての分野に大きな影響を与えることになるポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 法を公開し、特許を取得しました。分子生物学と遺伝学におけるこの方法の重要性は非常に大きく明白であることが判明し、7年後に著者はノーベル化学賞を受賞しました。

この方法を使用し始めた当初は、各加熱冷却サイクル後に DNA ポリメラーゼを反応混合物に添加する必要がありました。高温 DNA らせんの鎖を分離するのに必要です。反応手順は比較的非効率であり、多くの時間と酵素を必要としました。 1986 年に、ポリメラーゼ連鎖反応法が大幅に改良されました。好熱性細菌由来の DNA ポリメラーゼを使用することが提案されています。これらの酵素は熱安定性があり、多くの反応サイクルに耐えられることが判明しました。これらを使用することにより、PCR を簡素化および自動化することが可能になりました。最初の熱安定性 DNA ポリメラーゼの 1 つが細菌から単離されました テルマス・アクアティクスそして名前を付けましたタク-ポリメラーゼ。

ヌクレオチド配列が既知の任意の DNA セグメントを増幅し、PCR の完了時にそれを均一な形式および調製量で取得できるため、PCR は短い DNA フラグメントの分子クローニングの代替方法になります。この場合、従来のような複雑な方法論的テクニックを使用する必要はありません。遺伝子工学従来のクローン作成を使用します。 PCR 法の開発により、分子遺伝学、特に遺伝子工学の方法論的能力が大幅に拡張され、多くの分野の科学的可能性が根本的に変化し、強化されました。

1.2 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の種類

· ネステッド PCR- 反応副生成物の数を減らすために使用されます。 2 対のプライマーが使用され、2 つの連続反応が実行されます。 2 番目のプライマー対は、最初の反応の生成物内の DNA 領域を増幅します。

· インバーテッド PCR- 目的の配列内の小さな領域しかわかっていない場合に使用されます。この方法は、DNA がゲノムに挿入された後に隣接する配列を決定する場合に特に役立ちます。逆PCRを実行するには、制限酵素を使用して一連のDNA切断を実行します。<#"justify">ポリメラーゼ連鎖反応プライマー

· グループ特異的 PCR- 親族のPCR<#"center">1.3 ポリメラーゼ連鎖反応

1980 年代半ばに発見されたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は、元のサンプルのコピー数を数時間以内に何百万倍にも増やすことができます。各反応サイクル中に、元の分子から 2 つのコピーが形成されます。合成された DNA のコピーはそれぞれ、次のサイクルで DNA の新しいコピーを合成するためのテンプレートとして機能します。したがって、サイクルを繰り返すと、コピー数が増加します。等比数列。計算から、30 サイクルであっても、元の分子のコピー数は 10 億を超えることがわかります。各サイクル中にすべてのアンプリコンが複製されるわけではないことを考慮しても、コピーの総数はかなり大きな数字になります。

各ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) サイクルは次のステップで構成されます。

· 変性 - 温度の上昇により、二本鎖 DNA 分子がほどかれ、2 つの一本鎖 DNA 分子に分割されます。

· アニーリング - 温度を下げると、プライマーが DNA 分子の相補的領域に結合できるようになります。

· 伸長 - DNA ポリメラーゼという酵素が相補鎖を完成させます。

選択されたフラグメントを増幅するには、特定の DNA 領域に隣接する 2 つのオリゴヌクレオチドプライマー (プライマー) が使用されます。プライマー指向 3 - 相互に向かって、および増幅する必要があるシーケンスに向かって終了します。 DNAポリメラーゼは、プライマーを起点として、相互に相補的なDNA鎖の合成（完成）を行います。 DNA 合成中、プライマーは新しく合成された DNA 分子の鎖に物理的に組み込まれます。プライマーの 1 つを使用して形成された DNA 分子の各鎖は、別のプライマーを使用して相補的な DNA 鎖を合成するためのテンプレートとして機能します。

1.4 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の実行

ポリメラーゼ連鎖反応は、使用するサーマルサイクラー（増幅器）、つまりポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の段階の温度と時間の特性を制御するデバイスとサイズが互換性のある特別な薄肉ポリプロピレンチューブで実行されます。

1.5 ポリメラーゼ連鎖反応法の原理

ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は、特定の DNA 配列を単離し、数時間以内に何十億回も増幅するために使用できる in vitro DNA 増幅法です。ゲノムの厳密に定義された 1 つの領域の膨大な数のコピーを取得できるため、既存の DNA サンプルの研究が大幅に簡素化されます。

ポリメラーゼ連鎖反応を実行するには、いくつかの条件を満たす必要があります。

1.5.1 反応混合物中の多数の成分の存在

反応 (PCR) 混合物の主成分は次のとおりです: Tris-HCl、KCl、MgCl 2、ヌクレオチド三リン酸の混合物（ATP、GTP、CTP、TTP）、プライマー（オリゴヌクレオチド）、サンプルDNAの調製、熱安定性DNAポリメラーゼ。反応混合物の各成分はポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) に直接関与しており、試薬の濃度は増幅の過程に直接影響します。

· Tris-HCl - 反応混合物の pH を決定し、緩衝能を作り出します。 DNA ポリメラーゼの活性は環境の pH に依存するため、pH 値はポリメラーゼ連鎖反応の進行に直接影響します。通常、pH 値は 8 ～ 9.5 です。高い価値 pH は、温度が上昇すると Tril-HCl バッファーの pH が低下するという事実から取得されます。

· KCl - 塩化カリウムの濃度が 50 mM までは変性およびアニーリングの過程に影響を与え、50 mM を超える濃度では DNA ポリメラーゼを阻害します。

· MgCl 2- DNAポリメラーゼはMgなので 2+- 酵素に依存する場合、マグネシウムイオンの濃度は酵素の活性に影響します（Mg 2+NTP と複合体を形成します - これらの複合体はポリメラーゼの基質です)。高濃度では非特異的増幅が増加し、低濃度では反応が阻害されます。最適な濃度は (さまざまなポリメラーゼにとって) 0.5 ～ 5 mM の範囲です。さらに、マグネシウム塩の濃度は、変性およびアニーリングプロセスの進行に影響を及ぼします（Mg 濃度の増加）。 2+DNA の融解温度 (つまり、二本鎖 DNA 鎖の 50% が一本鎖に分離される温度) の上昇を引き起こします。

· NTP - ヌクレオチド三リン酸は、核酸の直接モノマーです。連鎖停止を防ぐために、4 つのヌクレオチド三リン酸をすべて同じ比率にすることが推奨されます。反応混合物中のこれらの成分の濃度が低いと、相補的な DNA 鎖を構築する際にエラーが発生する可能性が高くなります。

· プライマー - 最も最適なのは、融解温度の差が 2 ～ 4 以内のプライマーを使用することです。ああ C. 時々、長期保存庫気温4度でああ凍結と解凍を何度も繰り返すことにより、またはその後、プライマーが形成されます。二次構造- 二量体、PCR の効率を低下させます。この問題を解決するには、ウォーターバス (T=95) でインキュベートする必要があります。ああ C) 3 分間放置し、その後 0℃まで急冷すると。

· DNA 調製物 - DNA 調製物 (マトリックス) の量と質は、ポリメラーゼ連鎖反応の経過とパラメーターに直接影響します。過剰な量の DNA サンプルはポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を阻害します。不純物さまざまな物質 DNA 調製物に含まれる酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、イソプロパノール、エタノール、ヘパリン、フェノール、尿素、ヘモグロビンなどもポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の効率を低下させる可能性があります。

· DNA ポリメラーゼ - 少量の DNA ポリメラーゼを使用すると、合成の低下が観察されます。最終製品フラグメントのサイズに正比例します。ポリメラーゼが 2 ～ 4 倍過剰になると拡散スペクトルが出現し、4 ～ 16 倍になると低分子の非特異的スペクトルが出現します。使用する濃度範囲は、PCR 混合物 25 μl あたり 0.5 ～ 1.5 単位の活性です。

PCR 混合物の主成分に加えて、PCR の定性的および定量的指標を改善するためにいくつかの追加物質が使用されます。アセトアミド (5%) - 主成分の溶解度を高めます。ベタイン (ナトリウム塩) - DNA ポリメラーゼの安定化、DNA の融解温度の低下、融解温度の均一化。ウシアルブミン (10-100 μg/ml) - DNA ポリメラーゼの安定化。ジメチルスルホキシド (1-10%) - 主成分の溶解度を高めます。ホルムアミド (2-10%) - アニーリングの特異性を高めます。グリセロール (15-20%) - 酵素の熱安定性を高め、DNA サンプルの変性温度を下げます。硫酸アンモニウム - 変性およびアニーリング温度を下げます。

1.5.2 サイクルモードと温度モード

一般的な形式ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) プログラムは次のとおりです。

ステージ。 DNA 調製の長期一次変性 1 サイクル目。

ステージ。 DNA 調製物の急速な変性。プライマーのアニーリング。伸び 30 ～ 45 サイクル。

ステージ。伸びが長い。第 1 サイクルは反応混合物を冷却します。

変性、アニーリング、伸長などの段階の各要素には、個別の温度と時間の特性があります。各要素の温度と時間のパラメーターは、増幅産物の定性的および定量的指標に従って経験的に選択されます。

変性。ポリメラーゼ連鎖反応のこの要素中に、二本鎖 DNA 分子は 2 つの一本鎖 DNA 分子に分割されます。変性温度パラメータは 90 ～ 95 の範囲です。ああただし、グアニンとシトシンの含有量が高い DNA サンプルの場合は、温度を 98 ℃まで上げる必要があります。ああ変性温度は、DNA鎖を完全に変性させ、「瞬間冷却」や急速なアニーリングを避けるのに十分な温度でなければなりませんが、熱安定性DNAポリメラーゼは高温では安定性が低くなります。したがって、プライマー/サンプル (DNA 調製) 比に対する最適な変性温度パラメーターの選択は次のとおりです。重要な条件増幅中。第一段階の変性温度が95℃以上の場合ああ Cの場合、最初の変性後に反応混合物にDNAポリメラーゼを添加することをお勧めします。ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 中のこの段階の要素の継続時間は、DNA を完全に変性させるのに十分である必要がありますが、同時に、所定の温度での DNA ポリメラーゼの活性に重大な影響を及ぼさない必要があります。

アニーリング。アニーリング温度 (T あ ) はポリメラーゼ連鎖反応の最も重要なパラメーターの 1 つです。それぞれの特定のプライマーのアニーリング温度は個別に選択されます。それはプライマーの長さとヌクレオチド組成に依存します。通常は 2 ～ 4 低くなりますああ融点の値(T メートル）プライマー。システムのアニーリング温度が最適温度より低い場合、非特異的な増幅断片の数が増加し、逆に温度が高いと増幅産物の数が減少します。この場合、特定のアンプリコンの濃度は、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) が阻害されるまで急激に減少する可能性があります。アニーリング時間を長くすると、非特異的なアンプリコンの数も増加します。

伸長。通常、各タイプの熱安定性 DNA ポリメラーゼには、活性に最適な温度が個別にあります。酵素による相補DNA鎖の合成速度もポリメラーゼごとに異なるため（平均して1秒あたり30～60ヌクレオチド、または1分あたり1～2000塩基）、そのため伸長時間はポリメラーゼの種類に応じて選択されます。 DNA ポリメラーゼの量と増幅領域の長さ。

1.5.3 プライマー選択の基本原則

PCR 検査システムを作成する場合、主な作業の 1 つはプライマーを正しく選択することであり、プライマーは次のような多くの基準を満たす必要があります。

プライマーは特異的である必要があります。特に3に注目 - プライマーの末端。Taq ポリメラーゼが相補的な DNA 鎖を完成させるのはプライマーの末端からであるため。特異性が不十分な場合、反応混合物を含む試験管内で望ましくないプロセス、つまり非特異的な DNA (短いまたは長い断片) の合成が発生する可能性があります。電気泳動では、重いまたは軽い追加のバンドの形で表示されます。これは、特定の増幅産物と合成された外来 DNA を混同しやすいため、反応結果の評価を妨げます。一部のプライマーと dNTP は非特異的 DNA の合成に消費され、感度が大幅に低下します。

プライマーはダイマーやループを形成すべきではありません。プライマー自体または相互にアニーリングする結果として、安定した二本鎖が形成されるべきではありません。

1.5.4 プラトー効果

特定の増幅産物が等比数列的に蓄積するプロセスは限られた時間しか続かず、その後その効率が大幅に低下することに注意してください。これはいわゆるプラトー効果によるものです。

期間効果高原最後の増幅サイクルにおける PCR 産物の蓄積プロセスを説明するために使用されます。

増幅反応の条件やサイクル数にもよりますが、効果が発現する時点では高原基質（dNTP およびプライマー）の利用、反応物質（dNTP および酵素）の安定性、ピロリン酸および DNA 二重鎖などの阻害剤の量、非特異的生成物またはプライマーダイマーによる反応物質の競合、特定の生成物の濃度によって影響されます。高濃度の増幅産物では不完全な変性が起こります。

ターゲット DNA の初期濃度が低いほど、反応が失敗するリスクが高くなります。この点は、分析すべき特定の増幅産物が十分に存在する前に発生する可能性があります。これを回避できるのは、十分に最適化されたテストシステムのみです。

1.5.5 生体サンプルの調製

DNA を分離するには、当面のタスクに応じてさまざまな技術が使用されます。その本質は、PCR に適した純度の DNA 調製物を得るために、生物学的調製物からの DNA の抽出 (抽出) と外来不純物の除去または中和にあります。

Marmur によって記載された純粋な DNA 調製物を得る方法は標準的なものと考えられており、すでに古典的となっています。これには、酵素によるタンパク質分解、その後の脱タンパク質およびアルコールによる DNA の再沈殿が含まれます。この方法により、純粋な DNA 調製物を得ることができます。ただし、これは非常に労働集約的であり、フェノールやクロロホルムなどの攻撃的で強い臭いの物質を扱う必要があります。

現在普及している方法の 1 つは、Boom らによって提案された DNA 抽出方法です。この方法は、細胞溶解とそれに続く担体 (ガラスビーズ、珪藻土、ガラスミルクなど) への DNA の収着のための強力なカオトロピック剤であるグアニジンチオシアネート (GuSCN) の使用に基づいています。洗浄後、DNA はサンプル中に残り、担体に吸着されます。DNA は溶出バッファーを使用して簡単に除去されます。この方法は便利で技術的に進歩しており、増幅用のサンプルを準備するのに適しています。ただし、担体への不可逆的な吸着や、何度も洗浄することにより、DNA が失われる可能性があります。これは、サンプル中の少量の DNA を扱う場合に特に重要です。さらに、たとえ微量の GuSCN であっても PCR を阻害する可能性があります。したがって、この方法を使用する場合は、吸着剤を正しく選択し、技術的なニュアンスを注意深く遵守することが非常に重要です。

別のグループのサンプル前処理方法は、ガラスとは異なり、DNA を吸着せず、むしろ反応を妨げる不純物を吸着する Chilex タイプのイオン交換体の使用に基づいています。通常、この技術には、サンプルの沸騰とイオン交換体への不純物の吸着という 2 つの段階が含まれます。この方法は、実行が簡単であるため、非常に魅力的です。ほとんどの場合、臨床資料を扱うのに適しています。残念ながら、イオン交換体を使用しても除去できない不純物を含むサンプルが存在する場合があります。さらに、微生物の中には、単に煮沸するだけでは死滅できないものもあります。このような場合、サンプル処理の追加段階を導入する必要があります。

したがって、サンプル前処理方法の選択は、意図する分析の目的を理解した上で考慮する必要があります。

1.5.6 増幅

増幅反応を実行するには、反応混合物を調製し、分析した DNA サンプルをそれに加える必要があります。プライマーアニーリングのいくつかの特徴を考慮することが重要です。実際には、一般に、分析される生体サンプルにはさまざまな DNA 分子が含まれており、反応に使用されるプライマーは部分的、場合によっては重大な相同性を持っています。さらに、プライマーは互いにアニールし、プライマーダイマーを形成することがあります。どちらも、副産物 (非特異的) 反応生成物を合成するためのプライマーの大量の消費につながり、その結果、システムの感度が大幅に低下します。このため、電気泳動中に反応結果を読み取ることが困難または不可能になります。

1.6 標準 PCR 反応混合物の組成

× PCR バッファー (100 mM Tris-HCl 溶液、pH 9.0、500 mM KCl 溶液、25 mM MgCl2 溶液) ) …….2.5μl

水 (MilliQ)…………………………………………………….18.8 µl

ヌクレオチド三リン酸 (dNTP) の混合物

各 mM 溶液…………………………………….………….0.5 μl

プライマー 1 (10 mM 溶液) …………………………………………………….…….1 μl

プライマー 2 (10 mM 溶液) …………………………………………………….…….1 μl

DNA ポリメラーゼ (5 ユニット/μl) ……………………………………0.2 μl

DNA サンプル (20 ng/μl) …………………………………………..1 μl

1.7 反応結果の評価

PCR 結果を正しく評価するには、この方法が定量的ではないことを理解することが重要です。理論的には、単一の標的 DNA 分子の増幅産物は、30 ～ 35 サイクル後の電気泳動を使用して検出できます。しかし、実際には、これは理想に近い条件で反応が起こる場合にのみ行われ、現実にはそのようなことはあまりありません。 DNA 調製物の純度は、増幅効率に特に大きな影響を与えます。反応混合物中に特定の阻害剤が存在し、場合によっては除去することが非常に困難になる場合があります。場合によっては、それらの存在により、数万の標的 DNA 分子でさえも増幅できないことがあります。したがって、多くの場合、標的 DNA の初期量と増幅産物の最終量との間に直接の関係はありません。

第 2 章: ポリメラーゼ連鎖反応の応用

PCR は検査や科学実験の多くの分野で使用されています。

法医学

PCR は、いわゆる「遺伝子指紋」を比較するために使用されます。犯罪現場からの血液、唾液、精液、毛髪などの遺伝物質のサンプルが必要です。それは容疑者の遺伝物質と比較される。非常に少量の DNA、理論的には 1 コピーで十分です。 DNA は断片に分解され、PCR を使用して増幅されます。断片は DNA 電気泳動を使用して分離されます。結果として得られる DNA バンドの配置パターンは、遺伝的フィンガープリントと呼ばれます。

父性の確立

PCRで増幅したDNA断片の電気泳動結果。父親。子供。母親。子供は両親の遺伝的痕跡のいくつかの特徴を受け継ぎ、その結果、新しくユニークな痕跡が生まれました。

遺伝子の指紋は一意ですが、複数の指紋を作成することで家族関係を確立することができます。同じ方法を少し変更して適用して、生物間の進化的関連性を確立することができます。

医療診断

PCR により、遺伝性疾患や遺伝性疾患の診断を大幅に迅速化し、容易にすることが可能になります。ウイルス性疾患。目的の遺伝子は、適切なプライマーを使用して PCR によって増幅され、その後配列決定されて変異が特定されます。ウイルス感染症感染直後、症状が現れる数週間または数か月前に検出できます。

個別化医療

場合によっては、薬が一部の患者にとって有毒またはアレルギー誘発性であることが判明することがあります。この理由の一部は、薬物およびその誘導体の感受性および代謝における個人差によるものです。これらの違いは遺伝子レベルで決定されます。たとえば、ある患者では特定のチトクロムの活性が高く、別の患者では活性が低い場合があります。どのような種類のチトクロムを持っているかを調べるにはこの患者、薬を使用する前にPCR分析を実施することが提案されています。この分析は予備的なジェノタイピングと呼ばれます。

遺伝子クローニング

遺伝子クローニングは、遺伝子を単離し、遺伝子工学操作の結果として、特定の遺伝子の産物を大量に取得するプロセスです。 PCR は遺伝子を増幅するために使用され、その後ベクター (外来遺伝子を同じ生物または増殖に便利な別の生物に導入する DNA 片) に挿入されます。例えば、プラスミドまたはウイルスDNAがベクターとして使用される。外来生物への遺伝子の挿入は、通常、その遺伝子の産物である RNA またはほとんどの場合タンパク質を生成するために使用されます。このようにして、多くのタンパク質が工業用量で得られ、農業、薬など。

DNA配列決定

蛍光標識または放射性同位体ジデオキシヌクレオチド蛍光標識または放射性標識で標識されたヌクレオチド誘導体が DNA 鎖に挿入されるのは重合中にであるため、PCR は不可欠な部分です。これにより反応が停止し、合成された鎖がゲル内で分離された後、特定のヌクレオチドの位置を決定できるようになります。

突然変異誘発

現在、PCR は突然変異誘発を実行する主な方法となっています。 PCR の使用により、突然変異誘発手順の簡素化と高速化が可能になり、さらに信頼性と再現性も向上しました。

この研究の 40 年前に、PCR 法により、ヒト子宮頸腫瘍のパラフィン包埋生検切片におけるヒトパピローマウイルス配列の存在を分析することが可能になりました。さらに、PCR を使用すると、7,000 年前の人間の脳の化石残骸からミトコンドリア DNA の断片を増幅してクローン化することができました。

個々のヒト精子の溶解物を使用して、異なる非相同染色体上に位置する 2 つの遺伝子座を同時に分析できることが実証されました。このアプローチは、精密な遺伝子分析と染色体組換え、DNA 多型などの研究にユニークな機会を提供します。個々の精子を分析する方法は、すぐに実用化されました。法医学なぜなら、一倍体細胞の HLA タイピングにより、親子関係を特定したり、犯人を特定したりできるからです (HLA 複合体は、ヒト主要組織適合性複合体の遺伝子セットです。HLA 複合体の遺伝子座は、高等脊椎動物で知られている遺伝子座の中で最も多型的です。 1 つの種内では、各遺伝子座に異常に多数の異なる対立遺伝子 (同じ遺伝子の代替形態) が存在します。

PCR を使用すると、研究対象の細胞のゲノムの所定の領域への外来遺伝子構造の正確な組み込みを決定することができます。全細胞 DNA は 2 つのオリゴヌクレオチドプライマーにアニーリングされ、その 1 つは挿入点近くの宿主 DNA の一部に相補的で、もう 1 つは逆平行 DNA 鎖に組み込まれたフラグメントの配列に相補的です。ポリメラーゼ連鎖反応は、意図した挿入部位の染色体 DNA 構造が変化していない場合には、サイズが未知の一本鎖 DNA 断片の形成をもたらし、計画的な挿入の場合には、サイズの二本鎖 DNA 断片が形成されます。既知のサイズ。2 つのプライマーのアニーリング部位間の距離によって決定されます。さらに、最初のケースでは、分析されたゲノム領域の増幅の程度はサイクル数に線形に依存し、2 番目のケースでは指数関数的になります。 PCR中に所定のサイズの増幅断片が指数関数的に蓄積するため、DNA調製物の電気泳動分画後にそれを視覚的に観察し、染色体DNAの所定の領域への外来配列の挿入について明確な結論を下すことができます。

結論

PCR法は現在、さまざまな感染症の診断方法として最も広く利用されています。 PCR を使用すると、分析のために採取されたサンプルに病原体の DNA 分子がわずかしか含まれていない場合でも、感染の病因を特定できます。 PCR は以下の分野で広く使用されています。早期診断 HIV感染症、ウイルス性肝炎など現在、PCR を使用して検出できない感染因子はほとんどありません。

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ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)

PCR法の本質。 DNAポリメラーゼ

ポリメラーゼ連鎖反応は、分子生物学の実験方法であり、これを使用すると、体内の特定の核酸フラグメントを低濃度で大幅に増加させることができます。生物材料。 DNA のコピー数を増やすこのプロセスは、増幅。 PCR中のDNAコピーは特別な酵素によって行われます - ポリメラーゼ。 DNAポリメラーゼ（図3）は、DNAの複製（生体内でのDNAの増幅）に関与する酵素です。このクラスの酵素は、DNA ヌクレオチドの鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの重合を触媒し、酵素はそれを「読み取り」、鋳型として使用します。新しいヌクレオチドのタイプは、それが読み取られるテンプレートとの相補性の原理によって決定されます。

DNA ポリメラーゼは、組み立てられた鎖の 3" 末端に遊離ヌクレオチドを追加します。これにより、鎖が 5"-3 方向に長くなります。既知の DNA ポリメラーゼはいずれも、鎖を最初から作成することができません。ヌクレオチドを追加することしかできません。既存の 3"-ヒドロキシル基に。このため、DNA ポリメラーゼには プライマー- 研究対象の遺伝子の末端部分に相補的な短いヌクレオチド配列 (通常は 20 ～ 25) - そこに最初のヌクレオチドを追加することができます。プライマーは常に DNA 塩基と RNA 塩基で構成され、最初の 2 塩基は常に RNA 塩基です。プライマーは別の酵素によって合成されます - プリマーゼ。もう一つの酵素 ヘリカーゼ- DNA二重らせんをほどいて一本鎖構造を形成するために必要であり、これによりDNA複製の半保存的モデルに従って両鎖の複製が確実に行われます。

一部の DNA ポリメラーゼには、新しく組み立てられた DNA 鎖のエラーを修正する能力もあります。間違ったヌクレオチドのペアが検出された場合、DNA ポリメラーゼは 1 ステップ戻り、鎖から間違ったヌクレオチドを削除し、その位置に正しいヌクレオチドを挿入し、その後通常どおり複製が続行されます。

PCRの実施

ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は、特定の DNA 配列を単離し、数時間以内に何十億回も増幅するために使用できる DNA 増幅方法です。ゲノムの厳密に定義された 1 つの領域の膨大な数のコピーを取得できるため、既存の DNA サンプルの研究が大幅に簡素化されます。

ポリメラーゼ連鎖反応を実行するには、多くの条件を満たす必要があります。最も単純なケースで PCR を実行するには、次のコンポーネントが必要です。

増幅する必要がある DNA の部分を含む DNA テンプレート。

目的のフラグメントの末端に相補的な 2 つのプライマー。 (人工的に合成された一対のオリゴヌクレオチドで、通常はサイズが 15 ～ 30 bp で、標的 DNA の対応するセクションと同一です。これらは増幅反応生成物の形成において重要な役割を果たします。正しく選択されたプライマーは、増幅反応の特異性と感度を保証します。テストシステムです。）

熱安定性 DNA ポリメラーゼ。 PCRで使用されるポリメラーゼは高温でも活性を維持する必要があります長い間したがって、彼らは好熱菌から単離された酵素、Thermus aquaticus (Taq ポリメラーゼ) などを使用します。

デオキシヌクレオチド三リン酸 (dATP、dGTP、dCTP、dTTP)。

ポリメラーゼが機能するために必要な Mg 2+ イオン。

緩衝液の提供必要な条件反応 - 溶液の pH、イオン強度。塩類、血清アルブミンが含まれています。

反応混合物の蒸発を避けるために、ワセリンなどの高沸点油を試験管に加えます。加熱蓋付きのデバイスを使用している場合、これは必要ありません。

ピロホスファターゼを添加すると、PCR 反応の収率が増加します。この酵素は、成長する DNA 鎖にヌクレオチド三リン酸が付加される副産物であるピロリン酸のオルトリン酸への加水分解を触媒します。ピロリン酸は PCR 反応を阻害する可能性があります。

元の DNA のコピー数を増やすには、循環反応が必要です。原則として、連続して繰り返される PCR サイクルはそれぞれ、次の 3 つの段階で構成されます。

1。変性、つまり DNA の「溶解」。二本鎖 DNA テンプレートを 94 ～ 96℃ (特に熱安定性ポリメラーゼを使用する場合は 98℃) に 0.5 ～ 2 分間加熱して、DNA 鎖を分離します。 2 本の DNA 鎖間の水素結合が切断されるため、この段階は変性と呼ばれます。場合によっては、最初のサイクルの前 (ポリメラーゼの添加前)、反応混合物を 2 ～ 5 分間予熱して、マトリックスとプライマーを完全に変性させます。このテクニックはと呼ばれます ホットスタート、非特異的な反応生成物の量を減らすことができます。

2. アニーリング - テンプレート DNA へのプライマーの結合。鎖が分離したら、温度をゆっくりと下げてプライマーを一本鎖テンプレートに接触させます。アニーリング温度はプライマーの組成によって異なりますが、通常は 50 ～ 65°C が選択されます。ステージ時間は20～60秒。間違った選択アニーリング温度により、プライマーの鋳型への結合が不十分になる（高温の場合）か、間違った場所に結合して非特異的産物が出現する（低温の場合）かのいずれかになります。

3. 合成 (チェーンの伸び)。 DNAポリメラーゼは、プライマーをプライマーとして使用して鋳型鎖を複製します。ポリメラーゼは、プライマーの 3 インチ末端から 2 番目の鎖の合成を開始します。この鎖はテンプレートに結合し、テンプレートに沿って移動します。伸長温度はポリメラーゼによって異なります。頻繁に使用される Taq および Pfu ポリメラーゼは、72 ℃で最も活性が高くなります。 C. 合成時間は DNA ポリメラーゼの種類と増幅された断片の長さに依存し、通常、伸長時間は 1,000 塩基対あたり 1 分とみなされ、すべてのサイクルが完了した後、追加の段階が行われます。実行されました。 最終伸び、すべての一本鎖フラグメントを完成させます。この段階は 7 ～ 10 分間続きます。

続いて、変性、アニーリング、伸長の工程を何度も（30回以上）繰り返します。各サイクルで、DNA フラグメントの合成コピー数は 2 倍になります。

すべての反応は、サーモスタットに浸した試験管内で実行されます。温度レジームの変更とその維持は自動的に実行されます。

PCR 中に特定の DNA セグメントがどのように増幅されるかを正確に理解するには、各ラウンドで増幅された鎖内のすべてのプライマーの位置とその相補配列を明確に想像する必要があります。最初のラウンドでは、新しく合成された鎖のそれぞれは、そのプライマーの 3" ヒドロキシル基から 2 番目のプライマーに相補的な配列の末端ヌクレオチドまでの距離よりもはるかに長い長さを持ちます。このような鎖は「長いテンプレート」と呼ばれます。 ; さらなる合成が行われるのは彼らです。

第 2 ラウンドでは、同様の新しく合成された (長いテンプレート) 鎖からなる二本鎖 DNA が再び変性され、その後プライマーでアニーリングされます。このラウンドの合成中に、「長いテンプレート」が再度合成されるほか、一端にプライマー、もう一端に 2 番目のプライマーに相補的な配列を持つ多数の鎖 (「短いテンプレート」) が合成されます。 3 回目のラウンドでは、以前に形成されたすべてのヘテロ二本鎖が同時に変性され、プライマーでアニールされ、その後複製されます。後続のラウンドでは、「短い行列」がますます多くなり、30 ラウンド目までに、その数はすでに最初のチェーンまたは「長い行列」の数の 10 6 倍になります。

特定の反応生成物（プライマーによって制限される）の量は、理論的には 2n に比例して増加します。ここで、n は反応サイクル数です。実際には、各サイクルの効率は 100% 未満になる可能性があるため、実際には次のようになります。

ここで、P は生成物の量、E は平均サイクル効率です。

「長い」DNA コピーの数も増加しますが、直線的に増加するため、反応生成物では特定のフラグメントが優勢になります。必要な生成物の増殖は、試薬の数、阻害剤の存在、副生成物の形成によって指数関数的に制限されます。

PCR は非常に感度の高い方法であるため、テストサンプルに、ある反応混合物から別の反応混合物に誤って移入した DNA がたとえ微量でも含まれている場合、偽陽性の結果が得られる可能性があります。このため、PCR に使用されるすべての溶液とガラス器具を注意深く管理する必要があります。

プライマー選択の基本原則。

1. プライマーは特異的である必要があります。 Taq ポリメラーゼが相補的な DNA 鎖の完成を開始するのはプライマーの 3" 末端であるため、プライマーの 3" 末端には特に注意が払われます。プライマーの特異性が不十分な場合、試験管内で望ましくないプロセスが発生する可能性があります。反応混合物、つまり非特異的な DNA (短いまたは長い断片) の合成が、電気泳動で重いまたは軽い追加のバンドの形で表示されます。これは、特異的な DNA を混同しやすいため、反応結果の評価を妨げます。増幅産物に合成された外来 DNA が含まれるため、非特異的な DNA が合成され、感度が大幅に低下します。

2. プライマーはダイマーやループを形成すべきではありません。プライマー自体または相互にアニーリングする結果として、安定した二本鎖が形成されるべきではありません。

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