Realizácia PCR analýzy (PCR diagnostika) začína odberom materiálu na vyšetrenie gynekológom, urológom alebo dermatovenerológom. Kvalita a spoľahlivosť následne získaných výsledkov je zabezpečená najvyššou kvalifikáciou a rozsiahlymi skúsenosťami lekárov medicínskeho centra Euromedprestige, ktorí dodržiavajú všetky potrebné pravidlá na vykonávanie PCR analýzy: úplná sterilita, používanie výhradne jednorazových materiálov.

Zozbieraný materiál z kefy sa umiestni do nádoby s fyziologickým roztokom. Po odbere vzoriek by sa vzorky mali čo najskôr doručiť do laboratória PCR.

PCR analýza v laboratóriu prebieha v troch fázach:

1. izolácia DNA
2. Amplifikácia fragmentov DNA
3. Detekcia produktov amplifikácie DNA

Extrakcia DNA je počiatočným štádiom diagnostiky PCR, ktorej podstata je nasledovná: lekár odoberie materiál na výskum od pacienta a podrobí ho špeciálnemu spracovaniu. Počas spracovania dochádza k štiepeniu Dvojitý helix DNA na jednotlivé vlákna. Do materiálu pacienta sa pridáva špeciálna kvapalina, ktorá rozpúšťa organické látky, ktoré narúšajú "čistotu" reakcie. Tým sa odstránia lipidy, aminokyseliny, peptidy, sacharidy, proteíny a polysacharidy. Výsledkom je DNA alebo RNA.

Princípom metódy PCR je „vybudovanie“ nových infekcií DNA alebo RNA. To sa nedá urobiť bez odstránenia bunkového materiálu.

Množstvo času stráveného extrakciou DNA závisí od pôvodcu infekcie a od typu materiálu použitého na testovanie PCR. Napríklad príprava krvi na ďalší krok trvá 1,5-2 hodiny.

0Pole ( => Analýzy) Pole ( => 2) Pole ( =>.html) 2

amplifikácia DNA

Na realizáciu ďalšej etapy DNA diagnostiky – amplifikácie DNA – používajú lekári takzvané DNA matrice – molekuly DNA infekcií, na ktorých následne dôjde k „klonovaniu“ DNA. Už bolo spomenuté, že nie je potrebná prítomnosť kompletnej DNA infekcie, pre toto štádium stačí malý kúsok molekuly DNA, ktorá je pre tento mikrób jedinečná (infekcia).

V srdci amplifikácie DNA, a teda aj v srdci celého princípu reakcie PCR, je prirodzený proces kompletizácie DNA pre všetky živé veci - replikácia DNA, ktorá sa uskutočňuje zdvojením jedného reťazca DNA.

Počnúc jedným fragmentom DNA, laboratórny lekár ho skopíruje a zvyšuje počet kópií v reťazovej reakcii: po prvom cykle máte už 2 fragmenty, po druhom cykle - 4, po treťom - 8, po štvrtom - 16, potom 32, 64, 128, 256... S každým cyklom sa počet kópií zdvojnásobuje a po dvadsiatich cykloch ide počet na milióny a po tridsiatich na miliardy. Cyklus trvá niekoľko minút a redukuje sa na určitú zmenu teplotného režimu vo veľmi malom chemickom reaktore. Tu sú v roztoku v dostatočnom množstve všetky potrebné zložky syntézy, predovšetkým nukleotidy A, G, T a C, a tiež sa vykonali jemné prípravné chemické operácie, aby sa okamžite vytvorila presná kópia každý hotový segment DNA, potom z tejto kópie - opäť kópia, toto je rozvetvená reťazová reakcia.

Naviazaním primerov na reťazec DNA - umelo syntetizované "kúsky" DNA (nukleotidové páry) podobné DNA mikróbov (infekcia) - dva krátke, pozostávajúce z dvoch reťazcov úsekov DNA, vznikajú helixy, ktoré sú nevyhnutné pre syntézu budúcej DNA.

Syntéza nového reťazca nastáva dokončením každého z dvoch reťazcov DNA. K procesu amplifikácie dochádza pomocou špecifického miesta - DNA polymerázy, ktorá dala meno laboratórna metóda. Polymeráza pôsobí ako katalyzátor reakcie a monitoruje sekvenčné pripojenie nukleotidových báz k rastúcemu novému vláknu DNA.

Amplifikácia DNA je teda viacnásobné zvýšenie počtu kópií DNA, ktoré sú špecifické, t. j. vlastné len určitému organizmu. Nie je potrebné dokončiť celý reťazec DNA, aby ste videli pôvodcu infekcie. Potrebná je len oblasť, ktorá je charakteristická pre túto baktériu ako jednotlivca.

5360 rubľov. Náklady na komplexný program s gastroenterológom

25% ZĽAVA NA PRÍJME KU KARDIOLOGOVI

- 25%primárny
Návšteva lekára
víkendový terapeut

5 160 rubľov. namiesto 5 420 rubľov. Vyšetrenie mužov na urologické infekcie

ALERGOLÓGIA 5 120 rubľov. namiesto 5 590 rubľov.

Všetky početne sa opakujúce kroky amplifikácie prebiehajú pri rôznych teplotách. Na PCR analýzu sa používa špeciálne programovateľné zariadenie - PCR - termostat alebo zosilňovač, ktorý automaticky mení teploty. Amplifikácia sa uskutočňuje podľa vopred určeného programu zodpovedajúceho typu detekovanej infekcie. V závislosti od programu a typu detekovanej infekcie trvá proces automatizovanej PCR 2 až 3 hodiny.

Dôležitú úlohu v diagnostike PCR zohráva kvalifikácia laboratórneho asistenta vykonávajúceho analýzu, od toho závisí správne nastavenie PCR zariadenia a interpretácia výsledkov. Lekári Euromedprestige Medical Center majú bohaté skúsenosti s vykonávaním DNA diagnostiky, čo zaisťuje spoľahlivosť výsledkov štúdie a zaručuje pozitívny úspech v liečbe. infekčné choroby. Absolvovať testy PCR a vykonať kompletnú diagnostiku a liečbu infekčných chorôb v našom lekárskom centre "Euromedprestige".

Počas detekcie produktov amplifikácie sa výsledná zmes produktov amplifikácie oddelí. Do zmesi sa pridávajú špeciálne roztoky, ktoré dodávajú fragmentom DNA schopnosť fluorescencie - odrážať oranžovo-červené svietiace pásiky. Výsledná žiara indikuje prítomnosť DNA vírusov, mikróbov alebo baktérií v materiáli odobratom pacientovi na analýzu PCR.

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je vysoko presná metóda v oblasti diagnostiky dedičných patológií, infekcií, vírusových ochorení v akomkoľvek štádiu (akútnom alebo chronickom), ako aj skoré štádium- k zjavným prejavom ochorenia identifikáciou patogénov na základe ich DNA, RNA, ktoré sú genetickým materiálom, vo vzorkách, ktoré sa získajú od pacienta. A dnes budeme hovoriť o podstate, diagnostických štádiách a princípoch metód polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ako aj o jej nákladoch.

Čo je polymerázová reťazová reakcia

Základom analýzy je amplifikácia (zdvojenie) - vytvorenie mnohých kópií z krátkeho úseku DNA (kyselina deoxyribonukleová), ktorá predstavuje ľudský genetický komplex. Štúdia vyžaduje veľmi malé množstvo fyziologických látok (spútum, výkaly, epiteliálne škrabance, šťava z prostaty, krv, sperma, plodová voda, hlien, placentárne tkanivo, moč, sliny, pleurálna tekutina, cerebrospinálny mok). V tomto prípade môže byť napríklad v urogenitálnom trakte pacienta detegovaný aj jediný škodlivý mikrób.

Techniku ​​PCR (polymerázovú reťazovú reakciu) vyvinul americký vedec K. Mullis, ktorý v roku 1993 dostal Nobelovu cenu.

Aktívne používané:

• pri včasnej diagnostike infekcií, genetických,;
• pri forenznom lekárskom vyšetrení v prítomnosti extrémne malého množstva DNA na výskum;
• vo veterinárnej medicíne, farmácii, biológii, molekulárnej genetike;
• na identifikáciu osoby podľa DNA, potvrdenie otcovstva;
• v paleontológii, antropológii, ekológii (pri sledovaní kvality produktov, environmentálnych faktorov).

Toto video vám povie, čo je polymerázová reťazová reakcia:

Komu je pridelený

Polymerázová reťazová reakcia v diagnostike infekčných ochorení je jednou z najspoľahlivejších metód vysokej presnosti a spoľahlivosti. Napríklad spoľahlivosť analýzy PCR na chlamýdie a mnohé iné patogény sa blíži 100 % (absolútne). Najčastejšie je postup polymerázovej reťazovej reakcie predpísaný pacientom, ktorí majú pri diagnostike ťažkosti s identifikáciou konkrétneho patogénu.

Laboratórny test PCR sa používa:

• na detekciu patogénov, ktoré spôsobujú infekciu močových a pohlavných orgánov, ktoré je ťažké identifikovať pomocou plodín alebo imunologických metód;
• na opätovnú diagnostiku HIV v počiatočnom štádiu v prípade pozitívneho, ale sporného výsledku počiatočnej analýzy (napríklad u novorodencov od rodičov infikovaných AIDS);
• vytvoriť onkologické ochorenie v počiatočnom štádiu (štúdium mutácií onkogénov) a individuálna korekcia liečebného režimu u konkrétneho pacienta;
• na účely včasnej detekcie a potenciálnej liečby dedičných patológií.

Budúci rodičia sú teda testovaní, aby sa zistilo, či sú nositeľmi genetickej patológie, u detí PCR určuje pravdepodobnosť vystavenia dedičnej chorobe.

• na zistenie abnormalít plodu skorý termín gestácia (jednotlivé bunky rastúceho embrya sa vyšetrujú na možné mutácie);
• u pacientov pred transplantáciou orgánov - na "typizáciu tkaniva" (určenie kompatibility tkaniva);
• na zistenie nebezpečných patogénnych organizmov v darovanej krvi;
• u novorodencov - na detekciu latentných infekcií;
• na vyhodnotenie výsledkov antivírusovej a antimikrobiálnej liečby.

Prečo prejsť týmto postupom?

Keďže PCR je vysoko účinná diagnostická metóda, ktorá poskytuje takmer 100% výsledok, používa sa postup:

• potvrdiť alebo vylúčiť konečnú diagnózu;
• rýchle posúdenie účinnosti terapie.

V mnohých prípadoch je PCR jediná možný test na zistenie vyvíjajúceho sa ochorenia, ak sú iné bakteriologické, imunologické a virologické diagnostické metódy zbytočné.

• Vírusy sa detegujú pomocou PCR bezprostredne po infekcii a pred objavením sa príznakov ochorenia. Včasná detekcia vírusu umožňuje rýchlu liečbu.
• tzv. vírusová záťaž» (alebo - počet vírusov v tele) sa zisťuje aj analýzou DNA kvantitatívnou metódou.
• Špecifické patogény (ako je Kochov tuberkulózny bacil) sú náročné a kultivácia trvá príliš dlho. Analýza PCR vám umožňuje rýchlo identifikovať minimálny počet patogénov (živých a mŕtvych) vo vzorkách, ktoré sú vhodné na výskum.

Používa sa podrobná analýza DNA patogénu:

• určiť jeho citlivosť na špecifické typy antibiotík, čo vám umožňuje okamžite začať liečbu;
• kontrolovať šírenie epidémií medzi domácimi, voľne žijúcimi zvieratami;
• identifikovať a monitorovať nové nákazlivé mikrobiálne druhy a podtypy patogénov, ktoré podnietili predchádzajúce epidémie.

Typy diagnostiky

Štandardná metóda

Analýza polymerázovej reťazovej reakcie sa uskutočňuje na základe viacnásobnej amplifikácie (zdvojenia) špecifického fragmentu DNA a RNA pomocou špeciálnych primerových enzýmov. V dôsledku reťazca kopírovania sa získa množstvo materiálu dostatočné na výskum.

Počas postupu sa skopíruje iba požadovaný fragment (zodpovedajúci špecifikovaným špecifickým podmienkam), aj keď je skutočne prítomný vo vzorke.

Toto podrobné video s užitočnými schémami hovorí, ako funguje PCR:

Iné metódy

• PCR v reálnom čase. Pri tomto type štúdie sa proces identifikácie daného fragmentu DNA začína po každom cykle a nie po dokončení celého reťazca 30-40 cyklov. Tento typ štúdie vám umožňuje získať informácie o množstve patogénu (vírusu alebo mikróbu) v tele, to znamená vykonať kvantitatívnu analýzu.
• RT-PCR (reverzný transkripčný režim). Tento test sa používa na nájdenie jednovláknovej RNA na detekciu vírusov, ktorých genetickým základom je RNA (napríklad vírus hepatitídy C, vírus imunodeficiencie). Pri takejto štúdii sa používa špeciálny enzým - reverzná transkriptáza a určitý primér a na báze RNA sa vytvára jednovláknová DNA. Potom sa z tohto vlákna obnoví druhý reťazec DNA a vykoná sa štandardný postup.

Indikácie na držanie

Postup PCR sa používa na klinike infekčných chorôb, neonatológie, pôrodníctva, pediatrie, urológie, gynekológie, venerológie, neurológie, nefrológie, oftalmológie.

Indikácie na účely analýzy:

• objasnenie rizika vzniku genetických abnormalít u dieťaťa s pravdepodobnosťou dedičných patológií;
• diagnostikovanie oboch rodičov pri plánovaní tehotenstva alebo závažného stavu matky počas prebiehajúceho tehotenstva;
• ťažkosti s počatím, identifikácia príčin neplodnosti;
• podozrenie na sexuálne prenosné infekcie akútne štádium a s príznakmi ich prechodu na chronické;
• odhalenie príčin zápalové procesy nejasný pôvod;
• nechránené náhodné a neustále sexuálne kontakty;
• stanovenie citlivosti patogénneho mikroorganizmu na špecifické antibiotiká;
• pacienti s podozrením na latentnú infekciu na detekciu patogénov pred rozvojom zjavných symptómov (predklinická diagnóza);
• pacientov na potvrdenie zotavenia po chorobe (retrospektívna diagnóza);

Diagnostika sa používa aj vtedy, ak je potrebné presne identifikovať nasledujúce patogény:

• vírusy hepatitídy (A B C G), ľudská imunodeficiencia, cytomegalovírus;
• vibrio cholera;
• vírus herpes simplex, herpetiformné druhy;
• retro - adeno - a rinovírusy;
• vírusy rubeoly, Epstein-Barr, varicella (vírus Zoster);
• parvo a pikornavírusy;
• baktéria Helicobacter pylori;
• legionella, patogénne typy Escherichia coli;
• staphylococcus aureus;
• patogén;
• Clostridia, diftéria a Haemophilus influenzae;

Používa sa tiež na určenie infekcií:

• Infekčná mononukleóza;
• borelióza, listerióza, kliešťová encefalitída;
• kandidóza spôsobená hubami Candida;
• sexuálne infekcie - trichomoniáza, ureaplazmóza, bledý treponém, gardnerelóza, kvapavka, mykoplazmóza, chlamýdie;
• tuberkulóza.

Kontraindikácie pre držanie

Keďže postup sa nevykonáva s pacientom, bez akéhokoľvek účinku na telo, ale s biologickým materiálom odobratým na výskum, neexistujú žiadne kontraindikácie pre PCR kvôli absencii potenciálneho nebezpečenstva.

Odber biomateriálu z cervikálneho kanála maternice sa však po kolposkopickom zákroku nevykonáva. Dodanie náterov, škrabancov na analýzu je povolené len 4 až 6 dní po ukončení menštruácie a úplnom zastavení výtoku.

Je metóda bezpečná

žiadny Negatívny vplyv na pacienta v izolovanom štúdiu jeho biomateriálu v laboratóriu je nemožné.

Príprava na postup (dodanie biologických látok na analýzu)

Ako vzorka na analýzu PCR, v ktorej sa deteguje DNA cudzieho patogénu, sa používa akákoľvek biologická tekutina, tkanivo, telesné sekréty. Odber vzorky testovanej látky sa vykonáva formou odberu krvi zo žily, zoškrabu z hrtana, nosovej dutiny, močovej trubice, pleurálna dutina, krčka maternice.

Pred diagnostickým postupom lekár vysvetlí pacientovi, aký materiál sa odoberie:

1. Pri vyšetrovaní sexuálnych infekcií sa odoberá sekrét z pohlavných orgánov, moč a ster z močovej trubice.
2. Pri analýze na herpetické infekcie, cytomegalovírus, mononukleóza - odoberú moč na rozbor, výter z hrdla, na hepatitídu, toxoplazmózu - krv zo žily.
3. Za účelom diagnostiky rôzne druhy odoberá sa mozgovomiechový mok.
4. V pulmonológii sú vzorky na analýzu spútum a pleurálna tekutina.
5. Pri vykonávaní štúdie o možných vnútromaternicových infekciách počas tehotenstva sa na analýzu používa plodová voda a placentárne bunky.

Spoľahlivosť a presnosť analýzy závisí od sterility podmienok pri odbere materiálu. Keďže test PCR je vysoko citlivý, akákoľvek kontaminácia testovanej látky môže skresliť výsledok.

Kompetentná príprava na dodávku biomateriálu nepredstavuje pre pacientov žiadne ťažkosti. Existujú určité odporúčania:

• pri analýze sexuálnych infekcií:
  • vylúčiť intímne kontakty 72 hodín pred dodaním materiálu;
  • prestať používať akékoľvek vaginálne produkty na 3 dni;
  • od večera predchádzajúceho dňa nevykonávajte hygienu skúmanej oblasti;
  • vylúčiť močenie na 3-4 hodiny pri odbere vzorky z močovej trubice;
• prestať užívať antibiotiká mesiac pred testovaním na infekcie;
• darovať krv ráno pred jedlom a pitím;
• odber prvej rannej časti moču sa vykonáva do sterilnej nádoby po dôkladnej intímnej toalete.

Prečítajte si viac o tom, ako sa vykonáva diagnostika pomocou metódy polymerázovej reťazovej reakcie.

Aký je postup

Pri opakovanom vykonávaní štúdie PCR v reaktore (zosilňovač alebo tepelný cyklovač) sa určité cykly opakujú:

1. Prvým krokom je denaturácia. Sliny, krv, biopsia, gynekologické vzorky, spútum, v ktorých je podozrenie na prítomnosť DNA (alebo RNA) patogénu, sa umiestnia do zosilňovača, kde sa materiál zahreje a DNA sa rozštiepi na dva samostatné reťazce.
2. Druhým krokom je žíhanie alebo mierne ochladenie materiálu. a pridanie primérov, ktoré dokážu rozpoznať požadované úseky v molekule DNA a naviazať sa na ne.
3. Tretím krokom je predĺženie- nastáva po pridaní 2 primérov ku každému z reťazcov DNA. Počas procesu sa dokončí fragment DNA patogénu a vytvorí sa jeho kópia.

Tieto cykly sa opakujú ako „reťazová reakcia“, pričom zakaždým vedú k zdvojnásobeniu kópií špecifického fragmentu DNA (napríklad segmentu, v ktorom je naprogramovaný určitý vírus). V priebehu niekoľkých hodín sa vytvorí veľa kópií fragmentu DNA a zistí sa ich prítomnosť vo vzorke. Potom sa výsledky analyzujú a porovnajú s databázou rôznych typov patogénov, aby sa určil typ infekcie.

Prečítajte si o interpretácii výsledkov a závere na základe reakcie PCR nižšie.

Dešifrovanie výsledkov

Konečný výsledok štúdie sa vydáva 1-2 dni po dodaní biologického materiálu. Často - už v prvý deň po analýze.

Kvalitatívna analýza

• Negatívne výsledok znamená, že v látke predloženej na výskum sa nenašli žiadne stopy infekčných agens.
• Pozitívny výsledok znamená zistenie patogénnych vírusov alebo baktérií v biologickej vzorke s veľmi vysokým stupňom presnosti v čase predloženia.

Ak je výsledok pozitívny, ale nie sú žiadne známky aktivácie infekcie, tento stav tela sa nazýva asymptomatický „zdravý vozík“. Najčastejšie pozorované pri odbere biomateriálu z určitého miesta (cervikálny kanál, močová trubica, ústna dutina) pri vírusových ochoreniach. Liečba v tomto prípade nie je potrebná, ale je potrebný neustály lekársky dohľad, pretože existuje možnosť:

• šírenie vírusu z nosičov a infekcie zdravých ľudí;
• aktivácia procesu a prechod choroby na chronickú formu.

Ak je však krvný test pozitívny, znamená to, že infekcia zasiahla telo, a to už nie je stav nosiča, ale patológia, ktorá si vyžaduje okamžitú špecifickú terapiu.

Kvantitatívna analýza

Kvantitatívny výsledok určuje špecialista špeciálne pre konkrétny typ infekcie. Na jeho základe je možné posúdiť stupeň vývoja, štádium ochorenia, čo umožňuje rýchlo predpísať správnu liečbu.

priemerná cena

Ceny za uskutočnenie polymerázovej reťazovej reakcie sa určujú podľa: typu štúdie, zložitosti identifikácie patogénu, náročnosti odberu biologického materiálu, typu analýzy (kvalitatívnej alebo kvantitatívnej), cenovej úrovne v laboratóriu.

Na druhej strane, pri štúdiu PCR možno naraz odhaliť niekoľko patogénov pri odbere jedného typu materiálu na analýzu. To šetrí ďalšie laboratórne testy.

Približne náklady na analýzu PCR v rubľoch:

• gonokok, gardnerella, trichomonas vaginalis - od 180
• chlamydia trachomatis - od 190
• papilomavírus - od 380 do 500
• biocenóza urogenitálneho traktu u žien (kvantitatívne a kvalitatívne hodnotenie mikroflóry) - od 800.

Ďalšie užitočné informácie týkajúce sa štúdie PCR nájdete vo videu nižšie:

PRINCÍP METÓDY (molekulárne biologické základy)

Zo širokej škály hybridizačných metód na analýzu DNA je PCR najrozšírenejšia v klinickej laboratórnej diagnostike.

Princíp metódy polymerázová reťazová reakcia (PCR)(Polymerázová reťazová reakcia (PCR)) bola vyvinutá Carym Mullisom (Cetus, USA) v roku 1983. a je v súčasnosti široko využívaný ako na vedeckovýskumnú činnosť, tak aj na diagnostiku v praktickom zdravotníctve a službe Štátneho hygienicko-epidemiologického dozoru (genotypizácia, diagnostika infekčných chorôb).

Metóda PCR je založená na prirodzenom procese - komplementárnom dopĺňaní templátu DNA, realizovanom pomocou enzýmu DNA polymerázy. Táto reakcia sa nazýva replikácia DNA.

Prirodzená replikácia DNA zahŕňa niekoľko krokov:

1) denaturácia DNA(odvíjanie dvojitej špirály, divergencia reťazcov DNA);

2) Tvorba krátkych dvojvláknových segmentov DNA(semená potrebné na začatie syntézy DNA);

3) Syntéza nového reťazca DNA(doplnkové dokončenie oboch prameňov)

Tento proces možno použiť na získanie kópií krátke segmenty DNA špecifické pre špecifické mikroorganizmy, tie. vykonávať cielené vyhľadávanie takýchto špecifických oblastí, čo je cieľom génovej diagnostiky identifikovať pôvodcov infekčných ochorení.

Objav termostabilnej DNA polymerázy (Taq polymeráza) z termofilných baktérií Thermis aquaticus, ktorej optimum je v oblasti 70-72°C, umožnilo zacykliť proces replikácie DNA a využiť ho na prácu in vitro. Vytvorenie programovateľných termostatov (zosilňovačov), ktoré podľa daného programu uskutočňujú cyklické zmeny teploty, vytvorilo predpoklady pre plošné zavedenie metódy PCR do praxe laboratórnej klinickej diagnostiky. Pri opakovanom opakovaní syntéznych cyklov dochádza k exponenciálnemu zvýšeniu počtu kópií špecifického fragmentu DNA, čo umožňuje získať dostatočný počet kópií DNA z malého množstva analyzovaného materiálu, ktorý môže obsahovať jednotlivé bunky mikroorganizmov. na ich identifikáciu elektroforézou.

Komplementárne dokončenie reťazca sa nezačína v žiadnom bode sekvencie DNA, ale iba v určitých východiskových blokoch – krátkych dvojvláknových úsekoch. Pripojením takýchto blokov na špecifické oblasti DNA je možné nasmerovať proces syntézy nového vlákna iba do tejto oblasti, a nie po celej dĺžke vlákna DNA. Na vytvorenie štartovacích blokov v daných oblastiach DNA sa používajú dva oligonukleotidové priméry (20 nukleotidových párov), tzv primery. Priméry sú komplementárne k sekvenciám DNA na ľavom a pravom okraji špecifického fragmentu a sú orientované tak, že k dokončeniu nového reťazca DNA dochádza iba medzi nimi.

PCR je teda mnohonásobné zvýšenie počtu kópií (amplifikácie) špecifickej oblasti DNA katalyzované enzýmom DNA polymerázou.

Na zosilnenie sú potrebné nasledujúce komponenty:

Zmes deoxynukleotidových trifosfátov (dNTP)(zmes štyroch dNTP, ktoré sú materiálom na syntézu nových komplementárnych reťazcov DNA)

Enzým Taq polymeráza(termostabilná DNA polymeráza, ktorá katalyzuje predlžovanie reťazcov primérov postupným pridávaním nukleotidových báz do rastúceho reťazca syntetizovanej DNA).

Tlmivého roztoku(reakčné médium obsahujúce ióny Mg2+ potrebné na udržanie aktivity enzýmu)
Na určenie špecifických oblastí genómu vírusov obsahujúcich RNA sa najskôr získa kópia DNA z templátu RNA pomocou reakcie reverznej transkripcie (RT) katalyzovanej enzýmom reverzná transkriptáza (reverzná transkriptáza).

Aby sa získal dostatočný počet kópií požadovaného charakteristického fragmentu DNA, amplifikácia zahŕňa niekoľko (20-40) cyklov.

Každý zosilňovací cyklus zahŕňa 3 stupne prebiehajúce v rôznych teplotných podmienkach Krok 1: Denaturácia DNA(odvíjanie dvojitej špirály). Tečie pri 93-95°C po dobu 30-40 sekúnd. Fáza 2: Pripevňovanie primerov (žíhanie). Pripojenie priméru prebieha komplementárne k zodpovedajúcim sekvenciám na opačných reťazcoch DNA na hraniciach špecifického miesta. Každý pár primerov má svoju vlastnú teplotu žíhania, ktorej hodnoty sú v rozmedzí 50-65°C. Doba žíhania -20-60 sek. 3. fáza: Budovanie reťazcov DNA. Komplementárna kompletizácia reťazcov DNA nastáva od 5'-konca po 3'-koniec reťazca v opačných smeroch, počínajúc od miest pripojenia priméru. Materiálom na syntézu nových reťazcov DNA sú deoxyribonukleotidtrifosfáty (dNTP) pridané do roztoku. Proces syntézy je katalyzovaný enzýmom termostabilná DNA polymeráza (Taq polymeráza) a prebieha pri teplote 70-72°C. Čas syntézy - 20-40 sekúnd.

Nové reťazce DNA vytvorené v prvom amplifikačnom cykle slúžia ako templáty pre druhý amplifikačný cyklus, v ktorom sa vytvára požadovaný špecifický fragment DNA (amplikón). (pozri obr. 2). V nasledujúcich amplifikačných cykloch slúžia amplikóny ako templát pre syntézu nových reťazcov. Ku akumulácii amplikónov v roztoku teda dochádza podľa vzorca 2n, kde n je počet amplifikačných cyklov. Preto, aj keď bola v počiatočnom roztoku pôvodne prítomná iba jedna molekula dvojvláknovej DNA, po 30–40 cykloch sa v roztoku nahromadí asi 108 molekúl amplikónu. Toto množstvo je dostatočné na spoľahlivú vizuálnu detekciu tohto fragmentu elektroforézou na agarózovom géli. Proces zosilnenia prebieha v špeciálnom programovateľnom termostate (zosilňovači), ktorý podľa daného programu automaticky mení teploty podľa počtu cyklov zosilnenia.

ETAPY PCR - ANALÝZA

Metóda PCR, ako laboratórny diagnostický nástroj infekčných chorôb, je založená na detekcii malého fragmentu DNA patogénu (niekoľko stoviek párov báz), špecifického len pre tento mikroorganizmus, pomocou polymerázovej reťazovej reakcie na akumuláciu požadovaného fragmentu.
Technika analýzy využívajúca metódu PCR zahŕňa tri fázy:

1. Izolácia DNA (RNA) z klinickej vzorky

2. Amplifikácia špecifických fragmentov DNA
3. Detekcia amplifikačných produktov

Izolácia DNA (RNA)
V tejto fáze analýzy je klinická vzorka podrobená špeciálnemu spracovaniu, ktorého výsledkom je lýza bunkového materiálu, odstránenie proteínových a polysacharidových frakcií a príprava roztoku DNA alebo RNA bez obsahu
inhibítory a pripravené na ďalšiu amplifikáciu.
Výber techniky extrakcie DNA (RNA) je určený najmä povahou spracovávaného klinického materiálu.

Amplifikácia špecifických fragmentov DNA
V tomto štádiu sa hromadia krátke špecifické fragmenty DNA v množstve potrebnom na ich ďalšiu detekciu. Väčšina metód na určenie špecifických fragmentov genómu využíva tzv. “ klasická verzia riadená PCR. Na zvýšenie špecifickosti a citlivosti analýzy používajú niektoré metódy metódu „nested“ PCR, ktorá využíva 2 páry primérov („externé“ - pre 1. štádium a „interné“ - pre 2. štádium).

Detekcia amplifikačných produktov
Vo väčšine techník sa v tomto štádiu zmes produktov amplifikácie získaná v 2. štádiu oddelí horizontálnou elektroforézou na agarózovom géli. Pred elektroforetickou separáciou sa k amplifikačnej zmesi pridá roztok etídiumbromidu, ktorý vytvorí silné intersticiálne spojenia s dvojvláknovými fragmentmi DNA. Tieto zlúčeniny sú pôsobením UV žiarenia schopné fluoreskovať, čo sa po elektroforetickej separácii amplifikačnej zmesi v agarózovom géli zaznamenáva ako oranžovo-červené svietiace pásy.

Ako alternatíva k elektroforetickej metóde detekcie, ktorá má niektoré nevýhody: subjektivita pri čítaní výsledkov, môžu byť navrhnuté obmedzenia na stanovenie DNA rôznych mikroorganizmov v jednej reakcii. hybridizačné detekčné schémy. V týchto schémach sa fragment DNA, ktorý je výsledkom amplifikácie, hybridizuje (tvorí 2-vláknové komplexy - "hybridy") so špecifickou oligonukleotidovou sondou. Registrácia takýchto komplexov sa môže uskutočniť kolorimetricky alebo fluorimetricky. SPC "Litekh" vytvorilo detekčné súpravy založené na hybridizácii s fluorimetrickou registráciou výsledkov

VÝHODY METÓDY PCR ako metódy diagnostiky infekčných ochorení:

- Priama definícia prítomnosť patogénov

veľa tradičné metódy diagnostika, ako je enzýmová imunoanalýza, odhaľuje markerové proteíny, ktoré sú produktmi vitálnej aktivity infekčných agens, čo poskytuje len nepriamy dôkaz o prítomnosti infekcie. Identifikácia špecifickej oblasti DNA patogénu pomocou PCR poskytuje priamu indikáciu prítomnosti infekčného agens.

- Vysoká špecifickosť
Vysoká špecifickosť metódy PCR je spôsobená skutočnosťou, že v testovanom materiáli je detegovaný jedinečný fragment DNA charakteristický len pre tento patogén. Špecifickosť je určená nukleotidovou sekvenciou primérov, ktorá vylučuje
možnosť získania falošných výsledkov, na rozdiel od metódy enzýmovej imunoanalýzy, kde chyby nie sú nezvyčajné v dôsledku krížovo reagujúcich antigénov.

- Vysoká citlivosť
Metóda PCR umožňuje detekovať aj jednotlivé bunky baktérií alebo vírusov. PCR diagnostika zisťuje prítomnosť patogénov infekčných ochorení v prípadoch, keď sa používajú iné metódy (imunologické, bakteriologické,
mikroskopické) je nemožné. Citlivosť PCR analýzy je 10-1000 buniek na vzorku (citlivosť imunologických a mikroskopických testov je 103-105 buniek).

-Univerzálnosť postupu pri identifikácii rôznych patogénov
Materiálom pre štúdiu pomocou PCR je DNA patogénu. Metóda je založená na detekcii fragmentu DNA alebo RNA, ktorý je špecifický pre konkrétny organizmus. podobnosť chemické zloženie všetkých nukleových kyselín umožňuje použitie jednotných metód pre laboratórny výskum. To umožňuje diagnostikovať niekoľko patogénov z jedného biologického testu. Ako testovací materiál možno použiť rôzne biologické sekréty (hlien, moč, spútum), zoškraby epitelových buniek, krv, sérum.

- Vysoká rýchlosť získania výsledku analýzy
Analýza PCR nevyžaduje izoláciu a kultiváciu kultúry patogénu, čo si vyžaduje veľa času. Jednotná metóda spracovania biomateriálu a detekcie reakčných produktov a automatizácia procesu amplifikácie umožňujú vykonávať úplná analýza za 4-4,5 hodiny.

Je potrebné poznamenať, že metóda PCR dokáže odhaliť patogény nielen v klinickom materiáli získanom od pacienta, ale aj v materiáli získanom z objektov životného prostredia (voda, pôda atď.)

APLIKÁCIA METÓDY PCR V PRAKTICKEJ ZDRAVOTNEJ STAROSTLIVOSTI

Využitie metódy PCR na diagnostiku infekčných ochorení bakteriálnej aj vírusovej povahy má veľký význam pre riešenie mnohých problémov mikrobiológie a epidemiológie. Využitie tejto metódy prispieva aj k rozvoju základného výskumu v oblasti chronických a málo prebádaných infekčných ochorení.

Najúčinnejšie a ekonomicky opodstatnené použitie metódy v:

urogynekologická prax- na detekciu chlamýdií, ureaplazmózy, kvapavky, herpesu, gardnerelózy, mykoplazmovej infekcie;

v pneumológii- za odlišná diagnóza vírusové a bakteriálny zápal pľúc tuberkulóza;

v gastroenterológii- na detekciu helikobakteriózy;

na klinike infekčných chorôb- ako expresná metóda na diagnostiku salmonelózy, záškrtu, vírusová hepatitída B, C a G;

v hematológii- na zistenie cytomegalovírusovej infekcie, onkovírusov.

Federálna agentúra pre vzdelávanie

Štátna vzdelávacia inštitúcia

Najvyšší odborné vzdelanie

"Kareliánska štátna pedagogická akadémia"

Cvičenie na tému:

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) a jej aplikácia

Vyplnila: študentka Koryagina Valeria Alexandrovna

Kontrolovala: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

Úvod

Kapitola 1 Prehľad literatúry

1.5.4 Plató efekt

1.5.6 Zosilnenie

Záver

Úvod

Posledných dvadsať rokov sa nieslo v znamení rozsiahleho zavádzania molekulárno-genetických metód do biologických, lekárskych a poľnohospodárskych vied.

Začiatkom 70. rokov sa zdalo, že molekulárna biológia dosiahla určitý stupeň dokonalosti. V tomto období boli mikroorganizmy hlavným objektom molekulárneho genetického výskumu. Prechod na eukaryoty postavil výskumníkov pred úplne nové problémy, ktoré nebolo možné vyriešiť pomocou metód genetickej analýzy, ktoré v tom čase existovali. Prelom vo vývoji molekulárnej genetiky bol možný vďaka objaveniu sa nového experimentálneho nástroja - reštrikčných endonukleáz. V nasledujúcich rokoch sa počet metód priamej analýzy DNA založených na kvalitatívne odlišných prístupoch začal rýchlo zvyšovať.

Moderné technológie v mnohých prípadoch umožnili začať hlbšie študovať jemnú štrukturálnu a funkčnú organizáciu jadrových a mimojadrových genómov rôznych organizmov. To malo osobitný význam pre vývoj nových metód diagnostiky a liečby. rôzne choroby. Nemenej dôležitá bola možnosť využitia výdobytkov molekulárnej genetiky v populačnej biológii a šľachtení na identifikáciu a analýzu genetickej variability populácií, odrôd a kmeňov, identifikáciu a certifikáciu ekonomicky hodnotných jedincov, vytváranie geneticky modifikovaných organizmov a riešenie ďalších problémov.

Každá metóda má svoje výhody a nevýhody. Neexistuje univerzálna metóda, ktorá by dokázala vyriešiť všetky vzniknuté problémy. Preto je výber konkrétnej metódy pre prebiehajúci výskum jednou z najdôležitejších etáp každej vedeckej práce.

Kapitola 1 Prehľad literatúry

1.1 História objavu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)

V roku 1983 K.B. Mullis a spol., publikovali a patentovali metódu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), ktorá bola predurčená na to, aby mala hlboký vplyv na všetky oblasti výskumu a aplikácie nukleových kyselín. Význam tejto metódy pre molekulárnu biológiu a genetiku sa ukázal byť taký veľký a zrejmý, že o sedem rokov neskôr bola autorovi udelená Nobelova cena za chémiu.

Na začiatku používania metódy, po každom cykle zahrievania-chladenia, bolo potrebné do reakčnej zmesi pridať DNA polymerázu, pretože bola inaktivovaná počas vysoká teplota potrebné na oddelenie vlákien špirály DNA. Reakčný postup bol relatívne neefektívny, vyžadoval veľa času a enzýmov. V roku 1986 sa výrazne zlepšila metóda polymerázovej reťazovej reakcie. Bolo navrhnuté použiť DNA polymerázy z termofilných baktérií. Tieto enzýmy sa ukázali ako termostabilné a boli schopné odolať mnohým reakčným cyklom. Ich použitie umožnilo zjednodušiť a zautomatizovať PCR. Jedna z prvých termostabilných DNA polymeráz bola izolovaná z baktérií Thermus aquaticusa pomenované Taq-polymeráza.

Možnosť amplifikácie akéhokoľvek segmentu DNA, ktorého nukleotidová sekvencia je známa, a jeho získania po PCR v homogénnej forme a preparatívnom množstve, robí z PCR alternatívnu metódu molekulárneho klonovania krátkych fragmentov DNA. Nie je potrebné aplikovať zložité metodické techniky, ktoré sa používajú v genetické inžinierstvo s konvenčným klonovaním. Rozvoj metódy PCR výrazne rozšíril metodologické možnosti molekulárnej genetiky a najmä genetického inžinierstva natoľko, že radikálne zmenil a posilnil vedecký potenciál mnohých jej oblastí.

1.2 Odrody polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)

· Nested PCR- používa sa na zníženie počtu vedľajších produktov reakcie. Použite dva páry primérov a vykonajte dve po sebe idúce reakcie. Druhý pár primérov amplifikuje oblasť DNA v produkte prvej reakcie.

· Invertovaná PCR- používa sa, keď je známa len malá oblasť v rámci požadovanej sekvencie. Táto metóda je užitočná najmä vtedy, keď je potrebné určiť susedné sekvencie po vložení DNA do genómu. Na implementáciu invertovanej PCR sa uskutoční séria rezov DNA reštrikčnými enzýmami<#"justify">primer polymerázovej reťazovej reakcie

· Skupinovo špecifická PCR- PCR pre príbuzných<#"center">1.3 Polymerázová reťazová reakcia

Polymerázová reťazová reakcia (PCR), objavená v polovici 80. rokov 20. storočia, môže v priebehu niekoľkých hodín miliónkrát zvýšiť počet kópií pôvodnej vzorky. Počas každého cyklu reakcie sa z pôvodnej molekuly vytvoria dve kópie. Každá zo syntetizovaných kópií DNA môže slúžiť ako templát pre syntézu nových kópií DNA v ďalšom cykle. Opakované opakovanie cyklov teda vedie k zvýšeniu počtu kópií v geometrická progresia. Z výpočtov vyplýva, že aj keď ide o 30 cyklov, počet kópií pôvodnej molekuly bude viac ako 1 miliarda. Aj keď vezmeme do úvahy, že nie všetky amplikóny sa počas každého cyklu duplikujú, celkový počet kópií je napriek tomu dosť veľký údaj.

Každý cyklus polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) pozostáva z nasledujúcich krokov:

· Denaturácia – Zvýšenie teploty spôsobí, že sa dvojvláknová molekula DNA rozvinie a rozdelí na dve jednovláknové;

· Žíhanie - Zníženie teploty umožňuje primérom pripojiť sa ku komplementárnym oblastiam molekuly DNA;

· Predlžovanie – enzým DNA polymeráza dopĺňa komplementárne vlákno.

Na amplifikáciu vybraného fragmentu sa použijú dva oligonukleotidové priméry (semená) lemujúce určitú oblasť DNA. Priméry orientované 3 - končia smerom k sebe a v smere sekvencie, ktorú je potrebné zosilniť. DNA polymeráza uskutočňuje syntézu (kompletizáciu) vzájomne komplementárnych reťazcov DNA, počnúc primérmi. Počas syntézy DNA sa priméry fyzicky vkladajú do reťazca novosyntetizovaných molekúl DNA. Každý reťazec molekuly DNA vytvorený pomocou jedného z primérov môže slúžiť ako templát na syntézu komplementárneho reťazca DNA pomocou druhého priméru.

1.4 Vedenie polymerázovej reťazovej reakcie (PCR)

Polymerázová reťazová reakcia sa uskutočňuje v špeciálnych tenkostenných polypropylénových skúmavkách, ktoré sú svojou veľkosťou kompatibilné s použitým tepelným cyklovačom (zosilňovačom) - zariadením, ktoré riadi teplotné a časové charakteristiky fáz polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) .

1.5 Princíp metódy polymerázovej reťazovej reakcie

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je in vitro metóda amplifikácie DNA, ktorá dokáže izolovať a znásobiť špecifickú sekvenciu DNA miliardkrát v priebehu niekoľkých hodín. Možnosť získať obrovské množstvo kópií jednej striktne definovanej oblasti genómu výrazne zjednodušuje štúdium existujúcej vzorky DNA.

Na uskutočnenie polymerázovej reťazovej reakcie je potrebné splniť niekoľko podmienok:

1.5.1 Prítomnosť viacerých zložiek v reakčnej zmesi

Hlavné zložky reakčnej (PCR) zmesi sú: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, zmes nukleotidových trifosfátov (ATP, GTP, CTP, TTP), primery (oligonukleotidy), analyzovaný preparát DNA, termostabilná DNA polymeráza. Každá zo zložiek reakčnej zmesi sa priamo zúčastňuje polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) a koncentrácia činidiel priamo ovplyvňuje priebeh amplifikácie.

· Tris-HCl - určuje pH reakčnej zmesi, vytvára pufrovaciu kapacitu. Aktivita DNA polymerázy závisí od pH média, takže hodnota pH priamo ovplyvňuje priebeh polymerázovej reťazovej reakcie. Zvyčajne sa hodnota pH pohybuje v rozmedzí 8 - 9,5. vysoká hodnota Hodnota pH je odvodená zo skutočnosti, že ako teplota stúpa, pH Tril-HCl pufra klesá.

· KCl - koncentrácia chloridu draselného do 50 mm ovplyvňuje priebeh procesov denaturácie a žíhania, koncentrácia nad 50 mm inhibuje DNA polymerázu.

· MgCl 2- pretože DNA polymeráza je Mg 2+- závislý enzým, potom koncentrácia horčíkových iónov ovplyvňuje aktivitu enzýmu (Mg 2+tvorí komplexy s NTP – práve tieto komplexy sú substrátom pre polymerázu). Vysoká koncentrácia vedie k zvýšeniu nešpecifickej amplifikácie a nízka vedie k inhibícii reakcie, optimum (pre rôzne polymerázy) je v oblasti 0,5 - 5 mM. Okrem toho koncentrácia horečnatých solí ovplyvňuje priebeh procesov denaturácie a žíhania - zvýšenie koncentrácie Mg 2+spôsobuje zvýšenie teploty topenia DNA (t.j. teploty, pri ktorej sa 50 % dvojvláknových reťazcov DNA rozbije na jednovláknové reťazce).

· NTP - nukleotid trifosfáty sú priame monoméry nukleových kyselín. Aby sa zabránilo ukončeniu reťazca, odporúča sa rovnaký pomer všetkých štyroch nukleotidových trifosfátov. Nízka koncentrácia týchto zložiek v reakčnej zmesi zvyšuje pravdepodobnosť chýb pri konštrukcii komplementárneho reťazca DNA.

· Priméry - Najoptimálnejšie je použitie primérov s rozdielom teploty topenia nie väčším ako 2 - 4 o C. Niekedy keď dlhodobé skladovanie pri teplote 4 o C, alebo po veľkom počte zmrazovaní a rozmrazovaní sa tvoria primery sekundárne štruktúry- diméry, znižujúce účinnosť PCR. Odstránenie tohto problému sa redukuje na inkubáciu vo vodnom kúpeli (T=95 o C) po dobu 3 minút a následné rýchle ochladenie na 0 °C OD.

· DNA preparáty - množstvo a kvalita preparátu DNA (matrice) priamo ovplyvňuje priebeh a parametre polymerázovej reťazovej reakcie. Nadbytok vzorky DNA inhibuje polymerázovú reťazovú reakciu (PCR). nečistoty rôzne látky, ktoré sú v prípravku DNA, môžu tiež znížiť účinnosť polymerázovej reťazovej reakcie (PCR): octan sodný, chlorid sodný, izopropanol, etanol, heparín, fenol, močovina, hemoglobín atď.

· DNA polymeráza - pri použití malého množstva DNA polymerázy sa pozoruje pokles syntézy finálny produkt priamo úmerné veľkosti úlomkov. 2- až 4-násobný nadbytok polymerázy vedie k vzniku difúznych spektier a 4 až 16-násobný nešpecifický spektier s nízkou molekulovou hmotnosťou. Rozsah použitých koncentrácií je 0,5 - 1,5 jednotky aktivity v zmysle 25 ul zmesi PCR.

Okrem hlavných zložiek zmesi PCR sa používa množstvo ďalších látok, ktoré zlepšujú kvalitatívne a kvantitatívne ukazovatele PCR: acetamid (5%) - zvýšenie rozpustnosti hlavných zložiek; betaín (sodná soľ) - stabilizácia DNA polymerázy, zníženie teploty topenia DNA, vyrovnanie teploty topenia; hovädzí albumín (10-100 μg / ml) - stabilizácia DNA polymerázy; dimetylsulfoxid (1-10%) - zvýšenie rozpustnosti hlavných zložiek; formamid (2-10%) - zvýšenie špecifickosti žíhania; glycerol (15-20%) - zvýšenie tepelnej stability enzýmu, zníženie teploty denaturácie vzorky DNA; síran amónny - zníženie teploty denaturácie a žíhania.

1.5.2 Cyklus a teplota

Všeobecná forma Programy polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) sú nasledovné:

etapa. Predĺžená primárna denaturácia preparátu DNA.1 cyklus

etapa. Rýchla denaturácia preparátu DNA. Žíhanie základného náteru. Predĺženie.30 - 45 cyklov.

etapa. Predĺžené predĺženie. Ochladenie reakčnej zmesi 1 cyklus.

Každý prvok fázy - denaturácia, žíhanie, predĺženie - má individuálne teplotné a časové charakteristiky. Parametre teploty a doby prietoku každého prvku sa vyberajú empiricky v súlade s kvalitatívnymi a kvantitatívnymi ukazovateľmi produktov amplifikácie.

Denaturácia. Počas tohto prvku polymerázovej reťazovej reakcie sa molekula dvojvláknovej DNA rozdelí na dve jednovláknové. Teplotné parametre denaturácie sú v rozmedzí 90 - 95 o C, ale v prípade vzorky DNA s vysokým obsahom guanínu a cytozínu treba teplotu zvýšiť na 98 o C. Teplota denaturácie by mala byť dostatočná na úplnú denaturáciu – rozštiepenie reťazcov DNA a vyhnúť sa „náhlemu ochladeniu“ alebo rýchlemu žíhaniu, avšak termostabilná DNA polymeráza je pri vysokých teplotách menej stabilná. Výber optimálnych denaturačných teplotných parametrov pre pomer primér/vzorka (príprava DNA) je teda dôležitá podmienka počas zosilnenia. Ak je teplota denaturácie v prvom kroku vyššia ako 95 o C sa odporúča po primárnej denaturácii pridať do reakčnej zmesi DNA polymerázu. Trvanie tohto prvku štádia počas polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) by malo postačovať na úplnú denaturáciu DNA, ale zároveň by nemalo výrazne ovplyvniť aktivitu DNA polymerázy pri danej teplote.

Žíhanie. Teplota žíhania (T a ) je jedným z najdôležitejších parametrov polymerázovej reťazovej reakcie. Teplota žíhania pre každý špecifický primer sa volí individuálne. Závisí to od dĺžky a nukleotidového zloženia priméru. Zvyčajne je nižšia o 2 - 4 o Z hodnoty bodu topenia (T m ) základný náter. Ak je teplota žíhania systému pod optimom, potom sa zvyšuje počet nešpecifických amplifikovaných fragmentov a naopak vyššia teplota znižuje počet amplifikovaných produktov. V tomto prípade môže koncentrácia špecifických amplikónov prudko klesnúť až do inhibície polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Predĺženie doby žíhania tiež vedie k zvýšeniu počtu nešpecifických amplikónov.

Predĺženie. Typicky má každý typ termostabilnej DNA polymerázy individuálne teplotné optimum aktivity. Rýchlosť syntézy komplementárneho reťazca DNA enzýmom je tiež hodnota špecifická pre každú polymerázu (v priemere je to 30–60 nukleotidov za sekundu alebo 1–2 000 báz za minútu), takže čas predĺženia sa volí v závislosti na type DNA polymerázy a dĺžke amplifikovanej oblasti.

1.5.3 Základné princípy výberu primérov

Pri vytváraní testovacieho systému PCR je jednou z hlavných úloh správny výber primerov, ktoré musia spĺňať niekoľko kritérií:

Priméry musia byť špecifické. Osobitná pozornosť sa venuje 3 - konce primérov, pretože práve z nich Taq polymeráza začína dopĺňať reťazec komplementárnej DNA. Ak je ich špecificita nedostatočná, potom je pravdepodobné, že v skúmavke s reakčnou zmesou dôjde k nežiaducim procesom, konkrétne k syntéze nešpecifickej DNA (krátke alebo dlhé fragmenty). Pri elektroforéze je viditeľný vo forme ťažkých alebo ľahkých prídavných pásov. To sťažuje vyhodnotenie výsledkov reakcie, pretože je ľahké zameniť špecifický produkt amplifikácie so syntetizovanou cudzou DNA. Časť primerov a dNTP sa spotrebuje na syntézu nešpecifickej DNA, čo vedie k významnej strate citlivosti.

Priméry by nemali vytvárať diméry a slučky, t.j. žíhaním primérov k sebe alebo k sebe navzájom by sa nemali vytvárať stabilné dvojreťazce.

1.5.4 Plató efekt

Treba poznamenať, že proces akumulácie špecifických amplifikačných produktov trvá exponenciálne len obmedzený čas a potom jeho účinnosť kriticky klesá. Je to spôsobené takzvaným „plató“ efektom.

termínovaný efekt plošina používa sa na opis procesu akumulácie produktov PCR v posledných cykloch amplifikácie.

V závislosti od podmienok a počtu cyklov amplifikačnej reakcie v čase dosiahnutia účinku plošina využitie substrátov (dNTP a primery), stabilita reaktantov (dNTP a enzým), množstvo inhibítorov vrátane pyrofosfátov a DNA duplexov, súťaž o reaktanty s nešpecifickými produktmi alebo primer-diméry, koncentrácia špecifického produktu a neúplná denaturácia pri vysokých koncentráciách amplifikačných produktov.

Čím nižšia je počiatočná koncentrácia cieľovej DNA, tým vyššie je riziko reakcie plateau". Tento bod môže nastať skôr, než bude dostatočný počet špecifických amplifikačných produktov na analýzu. Len dobre optimalizované testovacie systémy sa tomu môžu vyhnúť.

1.5.5 Príprava vzorky biologického materiálu

Na extrakciu DNA sa používajú rôzne techniky v závislosti od úloh. Ich podstata spočíva v extrakcii (extrakcii) DNA z biologického produktu a odstránení alebo neutralizácii cudzích nečistôt na získanie preparátu DNA s čistotou vhodnou pre PCR.

Spôsob získania čistého preparátu DNA, ktorý opísal Marmur, sa považuje za štandardný a už sa stal klasickým. Zahŕňa enzymatickú proteolýzu, po ktorej nasleduje deproteinizácia a reprecipitácia DNA alkoholom. Táto metóda umožňuje získať čistý preparát DNA. Je to však dosť namáhavé a zahŕňa prácu s takými agresívnymi a štipľavými látkami, ako je fenol a chloroform.

Jednou zo súčasných populárnych metód je metóda extrakcie DNA navrhnutá Boomom a kol. Táto metóda je založená na použití silného chaotropného činidla, guanidíntiokyanátu (GuSCN), na lýzu buniek a následnú sorpciu DNA na nosič (sklenené guľôčky, kremelina, sklenené mlieko a pod.). Po premytí zostáva DNA vo vzorke adsorbovaná na nosiči, z ktorého sa dá ľahko odstrániť pomocou elučného pufra. Metóda je pohodlná, technologicky vyspelá a vhodná na prípravu vzoriek na amplifikáciu. Straty DNA sú však možné v dôsledku ireverzibilnej sorpcie na nosiči, ako aj počas početných premývaní. Toto je obzvlášť dôležité pri práci s malým množstvom DNA vo vzorke. Navyše aj stopové množstvá GuSCN môžu inhibovať PCR. Preto je pri použití tejto metódy veľmi dôležitý správny výber sorbentu a starostlivé dodržiavanie technologických odtieňov.

Ďalšia skupina metód prípravy vzoriek je založená na použití iónomeničov typu Chilex, ktoré na rozdiel od skla neadsorbujú DNA, ale naopak nečistoty interferujúce s reakciou. Táto technológia spravidla zahŕňa dva stupne: var vzorky a adsorpciu nečistôt na iónomeniči. Metóda je mimoriadne atraktívna vďaka svojej jednoduchosti prevedenia. Vo väčšine prípadov je vhodný na prácu s klinickým materiálom. Bohužiaľ, niekedy existujú vzorky s nečistotami, ktoré nie je možné odstrániť pomocou iónomeničov. Navyše niektoré mikroorganizmy nemožno zničiť jednoduchým varom. V týchto prípadoch je potrebné zaviesť ďalšie stupne spracovania vzoriek.

Preto by sa výber metódy prípravy vzorky mal posudzovať s pochopením účelu zamýšľaných analýz.

1.5.6 Zosilnenie

Na uskutočnenie amplifikačnej reakcie je potrebné pripraviť reakčnú zmes a pridať do nej analyzovanú vzorku DNA. V tomto prípade je dôležité vziať do úvahy niektoré vlastnosti žíhania primérov. Faktom je, že v analyzovanej biologickej vzorke sú spravidla rôzne molekuly DNA, s ktorými majú priméry použité v reakcii čiastočnú a v niektorých prípadoch významnú homológiu. Okrem toho môžu priméry na seba napojiť za vzniku primér-dimérov. Oboje vedie k značnej spotrebe primerov na syntézu vedľajších (nešpecifických) reakčných produktov a v dôsledku toho výrazne znižuje citlivosť systému. To sťažuje alebo znemožňuje odčítanie výsledkov reakcie počas elektroforézy.

1.6 Zloženie štandardnej reakčnej zmesi PCR

x PCR pufor (100 mM roztok Tris-HCl, pH 9,0, 500 mM roztok KCl, 25 mM roztok MgCl2 ) …….2,5 µl

Voda (MilliQ) ………………………………………………………. 18,8 µl

Zmes nukleotidových trifosfátov (dNTP)

mM roztok z každého……………………………………………….. 0,5 µl

Primer 1 (10 mM roztok) ………………………………………….….1 µl

Primer 2 (10 mM roztok) ………………………………………….….1 µl

DNA polymeráza (5 jednotiek / µl) …………………………………………………0,2 µl

Vzorka DNA (20 ng/µl) …………………………………………..1 µl

1.7 Vyhodnotenie výsledkov reakcií

Aby bolo možné správne posúdiť výsledky PCR, je dôležité pochopiť, že táto metóda nie je kvantitatívna. Teoreticky možno produkty amplifikácie jednotlivých cieľových molekúl DNA detegovať elektroforézou už po 30–35 cykloch. V praxi sa to však robí len v prípadoch, keď reakcia prebieha za podmienok blízkych ideálnym, s čím sa v živote často nestretávame. Stupeň čistoty preparátu DNA má obzvlášť veľký vplyv na účinnosť amplifikácie; prítomnosť určitých inhibítorov v reakčnej zmesi, ktorých sa v niektorých prípadoch môže mimoriadne ťažko zbaviť. Niekedy kvôli ich prítomnosti nie je možné amplifikovať ani desaťtisíce cieľových molekúl DNA. Preto často neexistuje priamy vzťah medzi počiatočným množstvom cieľovej DNA a konečným množstvom amplifikačných produktov.

Kapitola 2: Aplikácie polymerázovej reťazovej reakcie

PCR sa používa v mnohých oblastiach na analýzu a vo vedeckých experimentoch.

Kriminalistika

PCR sa používa na porovnanie takzvaných „genetických odtlačkov prstov“. Potrebujeme vzorku genetického materiálu z miesta činu – krv, sliny, semeno, vlasy atď. Porovnáva sa s genetickým materiálom podozrivého. Teoreticky stačí veľmi malé množstvo DNA - jedna kópia. DNA sa rozreže na fragmenty a potom sa amplifikuje pomocou PCR. Fragmenty sa oddelia elektroforézou DNA. Výsledný obraz umiestnenia pásov DNA sa nazýva genetický odtlačok prsta.

Stanovenie otcovstva

Výsledky elektroforézy DNA fragmentov amplifikovaných pomocou PCR. otec. Dieťa. matka. Dieťa zdedilo niektoré znaky genetického odtlačku oboch rodičov, čo dalo nový, jedinečný odtlačok.

Aj keď sú „genetické odtlačky prstov“ jedinečné, rodinné väzby sa stále dajú vytvoriť vytvorením niekoľkých takýchto odtlačkov prstov. Rovnakú metódu možno použiť s malými úpravami na stanovenie evolučných vzťahov medzi organizmami.

Lekárska diagnostika

PCR umožňuje výrazne urýchliť a uľahčiť diagnostiku dedičných a vírusové ochorenia. Požadovaný gén sa amplifikuje pomocou PCR s použitím vhodných primerov a potom sa sekvenuje, aby sa určili mutácie. Vírusové infekcie možno zistiť ihneď po infekcii, týždne alebo mesiace predtým, ako sa objavia príznaky ochorenia.

Personalizovaná medicína

Niekedy sú lieky pre niektorých pacientov toxické alebo alergénne. Príčiny sú čiastočne v individuálnych rozdieloch v citlivosti a metabolizme liečiv a ich derivátov. Tieto rozdiely sú určené na genetickej úrovni. Napríklad u jedného pacienta môže byť určitý cytochróm aktívnejší, u iného - menej. Aby bolo možné určiť, aký druh cytochrómu má tohto pacienta Pred použitím lieku sa navrhuje vykonať analýzu PCR. Táto analýza sa nazýva predbežná genotypizácia.

Klonovanie génov

Génové klonovanie je proces izolácie génov a ako výsledok manipulácií genetického inžinierstva získanie veľkého množstva produktu daného génu. PCR sa používa na amplifikáciu génu, ktorý sa potom vloží do vektora, časti DNA, ktorá prenáša cudzí gén do toho istého organizmu alebo iného organizmu, ktorý sa ľahko pestuje. Ako vektory sa používajú napríklad plazmidy alebo vírusová DNA. Vloženie génov do cudzieho organizmu sa zvyčajne využíva na získanie produktu tohto génu – RNA alebo najčastejšie proteínu. Týmto spôsobom sa mnohé proteíny získavajú v priemyselných množstvách na použitie v poľnohospodárstvo, lieky a pod.

Sekvenovanie DNA

Pri sekvenačnej metóde s použitím fluorescenčne značenej resp rádioaktívny izotop dideoxynukleotidy PCR je neoddeliteľnou súčasťou, pretože práve počas polymerizácie sa do reťazca DNA vkladajú nukleotidové deriváty značené fluorescenčnou alebo rádioaktívnou značkou. To zastaví reakciu, čo umožňuje určiť polohy špecifických nukleotidov po separácii syntetizovaných vlákien v géli.

Mutagenéza

V súčasnosti sa PCR stala hlavnou metódou mutagenézy. Použitie PCR umožnilo zjednodušiť a urýchliť postup mutagenézy, ako aj zvýšiť jeho spoľahlivosť a reprodukovateľnosť.

Metóda PCR umožnila analyzovať prítomnosť sekvencií ľudského papilomavírusu v rezoch biopsií ľudských cervikálnych novotvarov uložených v parafíne 40 rokov pred touto štúdiou. Navyše, pomocou PCR bolo možné amplifikovať a klonovať fragmenty mitochondriálnej DNA z fosílnych pozostatkov ľudského mozgu vo veku 7 tisíc rokov!

Na lyzátoch jednotlivých ľudských spermií bola preukázaná možnosť simultánnej analýzy dvoch lokusov umiestnených na rôznych nehomologických chromozómoch. Tento prístup poskytuje jedinečnú príležitosť pre jemnú genetickú analýzu a štúdium chromozomálnej rekombinácie, polymorfizmu DNA atď. Metóda analýzy jednotlivých spermií okamžite našla praktické uplatnenie v forenzná medicína, keďže HLA typizácia haploidných buniek umožňuje určiť otcovstvo alebo identifikovať zločinca (HLA komplex je súbor génov pre ľudský hlavný histokompatibilný komplex; lokusy HLA komplexu sú najpolymorfnejšie zo všetkých známych u vyšších stavovcov: v rámci druhu je na každom lokuse nezvyčajne veľké množstvo rôznych alel - alternatívnych foriem toho istého génu).

Pomocou PCR je možné identifikovať správnosť integrácie cudzích genetických štruktúr vo vopred určenej oblasti genómu študovaných buniek. Celková bunková DNA sa aneluje s dvoma oligonukleotidovými primérmi, z ktorých jeden je komplementárny k miestu hostiteľskej DNA blízko miesta inzercie a druhý k sekvencii integrovaného fragmentu v antiparalelnom reťazci DNA. Polymerázová reťazová reakcia v prípade nezmenenej štruktúry chromozomálnej DNA na navrhovanom mieste inzercie vedie k vytvoreniu jednovláknových fragmentov DNA neurčitej veľkosti a v prípade plánovanej inzercie dvojvláknových fragmentov DNA známej veľkosť, určená vzdialenosťou medzi miestami nasadenia dvoch primérov. Okrem toho bude stupeň amplifikácie analyzovanej oblasti genómu v prvom prípade lineárne závislý od počtu cyklov av druhom - exponenciálne. Exponenciálna akumulácia počas PCR amplifikovaného fragmentu vopred stanovenej veľkosti umožňuje jeho vizuálne pozorovanie po elektroforetickej frakcionácii preparátu DNA a jednoznačný záver o inzercii cudzej sekvencie do danej oblasti chromozomálnej DNA.

Záver

Metóda PCR je v súčasnosti najpoužívanejšia ako metóda na diagnostiku rôznych infekčných ochorení. PCR umožňuje identifikovať etiológiu infekcie, aj keď vzorka odobratá na analýzu obsahuje len niekoľko molekúl DNA patogénu. PCR sa široko používa v skorá diagnóza HIV infekcie, vírusová hepatitída atď. K dnešnému dňu neexistuje takmer žiadne infekčné činidlo, ktoré by nebolo možné zistiť pomocou PCR.

Zoznam použitej literatúry

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Metódy molekulárno - genetickej analýzy. - Minsk: Unipol, 2007. - 176 s.

2.PCR "v reálnom čase" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. atď.; vyd. b. n. D.V. Rebrikov; predslov L.A. Osterman a akad. RAS a RAAS E.D. Sverdlov; 2. vydanie, rev. a dodatočné - M.: BINOM. Vedomostné laboratórium, 2009. - 223 s.

.Patrushev L.I. Umelé genetické systémy. - M.: Nauka, 2005. - V 2 tonách

.B. Glick, J. Pasternak Molekulárna biotechnológia. Princípy a aplikácia 589 strán, 2002

5.Shchelkunov S.N. genetické inžinierstvo. - Novosibirsk: Sib. univ. vydavateľstvo, 2004. - 496 s.

Upravil A.A. Vorbyeva "Polymerázová reťazová reakcia a jej využitie v diagnostike v dermatovenerológii"; Lekárska tlačová agentúra - 72 strán

Http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

.

.

http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. nie/ - lekársky časopis

Doučovanie

Potrebujete pomôcť s učením témy?

Naši odborníci vám poradia alebo poskytnú doučovacie služby na témy, ktoré vás zaujímajú.
Odoslať žiadosť s uvedením témy práve teraz, aby ste sa dozvedeli o možnosti konzultácie.

Polymerázová reťazová reakcia (PCR)

Podstata metódy PCR. DNA polymeráza

Polymerázová reťazová reakcia je experimentálna metóda molekulárnej biológie, ktorá umožňuje dosiahnuť výrazné zvýšenie nízkych koncentrácií určitých fragmentov nukleových kyselín v biologický materiál. Tento proces zvyšovania počtu kópií DNA sa nazýva zosilnenie. Kopírovanie DNA počas PCR sa vykonáva špeciálnym enzýmom - polymeráza. DNA polymeráza (obr. 3) je enzým podieľajúci sa na replikácii (amplifikácii DNA v živých organizmoch) DNA. Enzýmy tejto triedy katalyzujú polymerizáciu deoxyribonukleotidov pozdĺž nukleotidového reťazca DNA, ktorý enzým „číta“ a používa ako templát. Typ nového nukleotidu je určený princípom komplementarity s templátom, z ktorého sa čítanie vykonáva.

DNA polymeráza pridáva voľné nukleotidy na 3" koniec zostaveného reťazca. To vedie k predĺženiu reťazca v smere 5"-3. Žiadna zo známych DNA polymeráz nie je schopná vytvoriť reťazec "od začiatku": sú schopné pridávať nukleotidy len k už existujúcej 3"-hydroxylovej skupine. Z tohto dôvodu potrebuje DNA polymerázu primer- krátka sekvencia nukleotidov (zvyčajne 20-25), komplementárna ku koncovým úsekom skúmaného génu - ku ktorým mohla pridať prvý nukleotid. Priméry sú vždy zložené z báz DNA a RNA, pričom prvé dve bázy sú vždy bázy RNA. Priméry sú syntetizované iným enzýmom - prvoradý. Ďalším enzýmom je helicase- nevyhnutné pre rozvinutie dvojzávitnice DNA s vytvorením jednovláknovej štruktúry, ktorá zabezpečuje replikáciu oboch vlákien v súlade so semikonzervatívnym modelom replikácie DNA.

Niektoré DNA polymerázy majú tiež schopnosť opraviť chyby v novo zostavenom reťazci DNA. Ak sa deteguje nesprávny pár nukleotidov, DNA polymeráza sa vráti o krok späť, odstráni nesprávny nukleotid z reťazca a potom na jeho miesto vloží správny, po čom replikácia pokračuje ako zvyčajne.

Vedenie PCR

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je metóda amplifikácie DNA, ktorá dokáže izolovať a znásobiť určitú sekvenciu DNA miliardkrát v priebehu niekoľkých hodín. Možnosť získať obrovské množstvo kópií jednej striktne definovanej oblasti genómu výrazne zjednodušuje štúdium existujúcej vzorky DNA.

Aby polymerázová reťazová reakcia prebehla, musí byť splnených niekoľko podmienok. Pre PCR sú v najjednoduchšom prípade potrebné tieto komponenty:

DNA templát obsahujúci úsek DNA, ktorý sa má amplifikovať.

Dva priméry komplementárne ku koncom požadovaného fragmentu. (Pár umelo syntetizovaných oligonukleotidov, zvyčajne s veľkosťou 15 až 30 bp, zhodných s príslušnými oblasťami cieľovej DNA. Hrajú kľúčovú úlohu pri tvorbe produktov amplifikačnej reakcie. Správne zvolené priméry zabezpečujú špecifickosť a citlivosť testu systém.)

Termostabilná DNA polymeráza. Polymeráza použitá v PCR musí zostať aktívna pri vysokej teplote dlho, preto sa používajú enzýmy izolované z termofilov - Thermus aquaticus (Taq polymeráza) a iné.

Deoxynukleotid trifosfáty (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Mg 2+ ióny potrebné na fungovanie polymerázy.

poskytovanie tlmivého roztoku potrebné podmienky reakcie - pH, iónová sila rozt. Obsahuje soli, sérový albumín.

Aby sa zabránilo odparovaniu reakčnej zmesi, do skúmavky sa pridá olej s vysokou teplotou varu, ako je vazelína. Ak sa používa zariadenie s vyhrievaným vekom, nie je to potrebné.

Pridanie pyrofosfatázy môže zvýšiť výťažok PCR reakcie. Tento enzým katalyzuje hydrolýzu pyrofosfátu, vedľajšieho produktu adície nukleotidtrifosfátov do rastúceho reťazca DNA, na ortofosfát. Pyrofosfát môže inhibovať reakciu PCR.

Na znásobenie počtu kópií pôvodnej DNA je potrebná cyklická reakcia. Každý zo sekvenčne opakovaných cyklov PCR pozostáva spravidla z troch etáp:

1. Denaturácia, čiže „tavenie“ DNA. Dvojvláknový templát DNA sa zahrieva na 94 - 96 °C (alebo 98 °C, ak sa použije obzvlášť termostabilná polymeráza) počas 0,5 - 2 minút, aby sa vlákna DNA oddelili. Tento krok sa nazýva denaturácia, pretože vodíkové väzby medzi dvoma vláknami DNA sú prerušené. Niekedy sa pred prvým cyklom (pred pridaním polymerázy) reakčná zmes predhreje na 2 až 5 minút, aby sa úplne denaturoval templát a primery. Tento prístup sa nazýva horúci štart umožňuje znížiť množstvo nešpecifických reakčných produktov.

2. Annealing - naviazanie primerov na templátovú DNA. Akonáhle sa vlákna oddelia, teplota sa pomaly zníži, aby sa umožnilo primérom naviazať sa na jednovláknový templát. Teplota žíhania závisí od zloženia základného náteru a zvyčajne sa volí pri 50–65 °C. Čas fázy - 20 - 60 sekúnd. Nesprávny výber teplota žíhania vedie buď k slabej väzbe primerov na templát (pri zvýšenej teplote), alebo k väzbe na nesprávnom mieste a objaveniu sa nešpecifických produktov (pri nízkej teplote).

3. Syntéza (predĺženie reťaze). DNA polymeráza replikuje templátový reťazec pomocou priméru ako "zárodku". Polymeráza začína syntézu druhého vlákna od 3" konca primeru, ktorý sa naviazal na templát a pohybuje sa pozdĺž templátu. Teplota predĺženia závisí od polymerázy. Bežne používané Taq a Pfu polymerázy sú najaktívnejšie pri 72 °C dĺžka fragmentu, ktorý sa má amplifikovať Typicky sa elongačný čas považuje za jednu minútu na každých tisíc párov báz Po dokončení všetkých cyklov sa často vykoná ďalší krok konečné predĺženie na dokončenie všetkých jednovláknových fragmentov. Táto fáza trvá 7 - 10 minút.

Následne sa fázy denaturácie, žíhania a predlžovania mnohokrát opakujú (30 alebo viackrát). V každom cykle sa počet syntetizovaných kópií fragmentu DNA zdvojnásobí.

Všetky reakcie sa uskutočňujú v skúmavkách ponorených do termostatu. Zmena teplotného režimu a jeho údržba sa vykonáva automaticky.

Aby sme presne pochopili, ako dochádza k amplifikácii určitého segmentu DNA počas PCR, je potrebné jasne pochopiť polohu všetkých primérov a ich komplementárnych sekvencií v amplifikovateľných reťazcoch v každom kole. V prvom kole je každý z novosyntetizovaných reťazcov oveľa dlhší ako vzdialenosť od 3"-hydroxylovej skupiny jeho priméru po koncový nukleotid sekvencie komplementárnej s druhým primérom. Takéto reťazce sa nazývajú "dlhé templáty". je na nich, že prebehne ďalšia syntéza.

V druhom kole sa dvojvláknová DNA, pozostávajúca z podobných a novo syntetizovaných (dlhých templátových) vlákien, opäť denaturuje a potom sa žíha s primérmi. Počas syntézy v tomto kole sa opäť syntetizujú „dlhé templáty“, ako aj množstvo reťazcov s primérom na jednom konci a so sekvenciou komplementárnou k druhému priméru na druhom („krátke templáty“). Počas tretieho kola sa všetky heteroduplexy vytvorené skôr súčasne denaturujú a anelujú s primérmi a potom sa replikujú. V ďalších kolách je čoraz viac „krátkych matíc“ a do 30. kola je ich počet už 10 6-krát väčší ako počet počiatočných reťazcov alebo „dlhých matíc“.

Množstvo špecifického reakčného produktu (obmedzeného primérmi) sa teoreticky zvyšuje úmerne k 2 n, kde n je počet reakčných cyklov. V skutočnosti môže byť účinnosť každého cyklu nižšia ako 100 %, takže v skutočnosti:

kde P je množstvo produktu, E je priemerná účinnosť cyklu.

Počet "dlhých" kópií DNA tiež rastie, ale lineárne, takže v produktoch reakcie dominuje špecifický fragment. Rast požadovaného produktu je exponenciálne obmedzený množstvom činidiel, prítomnosťou inhibítorov a tvorbou vedľajších produktov.

PCR je vysoko citlivá metóda, preto ak je v testovanej vzorke čo i len nepatrné množstvo DNA, ktoré sa náhodne dostalo z jednej reakčnej zmesi do druhej, môžu sa získať falošne pozitívne výsledky. Preto je potrebné starostlivo kontrolovať všetky roztoky a nástroje používané na PCR.

Základné princípy výberu základného náteru.

Pri vytváraní testovacieho systému PCR je jednou z hlavných úloh správny výber primerov, ktoré musia spĺňať niekoľko kritérií:

1. Priméry musia byť špecifické. Osobitná pozornosť sa venuje 3" koncom primérov, pretože práve od nich Taq polymeráza začína dopĺňať reťazec komplementárnej DNA. Ak je ich špecificita nedostatočná, potom s najväčšou pravdepodobnosťou dôjde v skúmavke s reakčnou zmesou k nežiaducim procesom , menovite syntéza nešpecifickej DNA (krátke alebo dlhé fragmenty). Na elektroforéze je viditeľná vo forme ťažkých alebo ľahkých prídavných pásov. To sťažuje vyhodnotenie výsledkov reakcie, pretože je ľahké zameniť špecifický amplifikačný produkt so syntetizovanou cudzou DNA. Niektoré priméry a dNTP sú spotrebované na syntézu nešpecifickej DNA, čo vedie k významnej strate vnímania.

2. Priméry by nemali vytvárať diméry a slučky, t.j. žíhaním primérov k sebe alebo k sebe navzájom by sa nemali vytvárať stabilné dvojreťazce.