アポトーシスと細胞増殖のマーカー。科学と教育の現代の問題アポトーシスのマーカー

アポトーシスの加速と減速は両方とも、体内の多くの病理学的プロセスの経過に劇的な影響を与える可能性があります。アポトーシスの制御に関与する物質は通常タンパク質であり、その合成は対応する遺伝子によって制御されます。アポトーシスのレベルを調節する同じ遺伝子が、進化のはしごの非常に異なるレベルの生物に見られることがあります。アポトーシスを刺激する遺伝子には、p53、Bax、bcl-xS 遺伝子などがあります。一方で、アポトーシスを阻害するタンパク質を合成する遺伝子 (Bcl-2、Ced-9、BHRF1、MCL-1) が報告されています。プロアポトーシスタンパク質と抗アポトーシスタンパク質は互いに結合して、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成することができます。たとえば、アポトーシス阻害タンパク質 Bcl-2 をアポトーシス活性化タンパク質 Bax と組み合わせる場合、結果 (アポトーシスの阻害または活性化) は、この組み合わせでどのタンパク質が優勢になるかによって決まります。

細胞や組織で進行中の合成プロセスを反映する最も印象的で有益なタンパク質は、アポトーシスプロセスの制御の研究において中心的な位置を占める Bcl-2 ファミリーのタンパク質です。このプロセスの制御機構を、このファミリーのタンパク質間の構造的および機能的関係の観点から検討することをお勧めします。これにより、それらを1つのファミリーであるBcl-2タンパク質に組み合わせることが可能になります。この Bcl-2 ファミリーのタンパク質は常に動的平衡状態にあり、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成し、最終的に細胞アポトーシスの進行に影響を与えます。したがって、これらのタンパク質の活性型の比率が細胞の生と死のバランスを決定すると考えられています。

Bcl-2 ファミリーのタンパク質は、アポトーシス誘導因子 (Bad、Bax、J3ik、Bid、Bak) または阻害因子 (Bcl-2、Bcl-X) であることが現在知られています。 Bcl-2 ファミリータンパク質は、G タンパク質のクラスに属します。 Bcl-2 遺伝子によってコードされる 26 kJ タンパク質は膜貫通ドメインを含み、ミトコンドリア膜、核周囲小胞体、核膜、および有糸分裂染色体に局在しています。

Bcl-2 は細胞生存因子であり、プログラムされた死から細胞を保護し、アポトーシスを防ぐため発癌特性を示します。 Bcl-2 遺伝子は、アポトーシスの負の制御因子として機能します。 Bcl-2 の濃度の低下はアポトーシスによる細胞死を引き起こす一方、その過剰発現は細胞を死から保護することが確立されています。

TNF ファミリーのタンパク質と特定の受容体との相互作用の結果として細胞をアポトーシスに導く一連の現象は、最もよく研究されています。明るい代表このタンパク質のグループは、Apo-1/Fas/FasL システムです。このシステムには、細胞のアポトーシスを誘導する以外の機能は知られていないことに注意してください。

Apo-1/Fas/CD-95 は、その構造が TNF ファミリーの受容体に属する受容体です。 Apo-1/Fas (受容体) と FasL (リガンド) またはモノクローナル抗体との相互作用は、細胞のアポトーシスを引き起こします。 Apo-1/Fas は、胸腺細胞、リンパ芽球様細胞株、活性化 T および B リンパ球、さらに線維芽細胞、肝細胞、ケラチノサイト、骨髄細胞など、多くの細胞型の表面に構成的に発現しています。ヒト Apo-1/Fas は 325 アミノ酸残基からなり、I 型膜タンパク質です。それらの。その構造では、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞質ドメインを区別できます。 TNFファミリー受容体間のアミノ酸配列の相同性は高い。約 80 個のアミノ酸残基がデスドメイン (DD) を形成し、細胞質タンパク質とのタンパク質間相互作用に関与し、死シグナルを生成します。ヒトの Apo-1/Fas 遺伝子は 10 番染色体の長腕に局在しており、9 つのエクソンで構成されています。

FasL はサイトカインであり、サイトカインの TNF ファミリーに属します。 FasL は、活性化 T リンパ球とナチュラルキラー細胞、ならびにセルトリ細胞と前眼房の実質細胞で発現され、これらの細胞が活性化 T リンパ球を含むあらゆる Fas 発現細胞を殺すことができます。このメカニズムは、保護されたものの外観を決定します。免疫系場所 FasL は、不溶性または膜結合型と、メタロプロテイナーゼによって細胞から切断される可溶型の 2 つの形態で存在します。可溶型のヒト sFasL はその活性を保持します。他の TNF ファミリー受容体リガンドと同様に、sFasL ホモ三量体は 3 つの Apo-1/Fas 分子に結合します。

リガンドが受容体に結合すると、受容体に関連する DD (デスドメイン)、DED を含むアダプタータンパク質 - FADD (Fas 関連デスドメイン)、デスエフェクタードメイン、プロカスパーゼ 8 などの細胞質タンパク質のオリゴマー化が発生します。このプロセスの結果、アポトーシス特異的プロテアーゼであるカスパーゼ 8 が活性化され、アポトーシスに特徴的なプロセスが発生します。 fas遺伝子またはFasL遺伝子の変異が発症につながる自己免疫疾患.

Apo-1/Fas は、FasL に結合して標的細胞にアポトーシスを誘導する単一膜貫通領域を含むタンパク質です。血清やその他の体液中には、膜貫通を持たない可溶型の Apo-1 (sApo-1/Fas) も存在します。文献によると、この分泌型 (sApo-1/Fas) は Apo-1/リガンド誘導性のアポトーシスから細胞を保護することができ、膜貫通ドメインからのアミノ酸残基の切断によって形成されます。

近年、アポトーシスの同定は、イニシエーターとエフェクターの両方であるカスパーゼの活性を測定することによって行われることがよくあります。カスパーゼ活性の研究で行われた研究のほとんどはカスパーゼ-3 を考慮しています。アポトーシス死のさまざまな経路がそれに集中し、その活性化はアポトーシスの存在を示します。ただし、研究にカスパーゼ 8 活性の測定が含まれている場合は、プログラム細胞死そのものを特定することに加えて、その誘発経路を決定することも可能です。カスパーゼ 8 の活性化は、プロセスを開始するための受容体 (外部) メカニズムを示します。これこそが大きな利点ですこの方法.

現在までに60以上が開発されていますさまざまな方法インビトロでのアポトーシス細胞の検出と研究。文献には、生体内でのアポトーシス細胞の生体内検出に対するいくつかの方法論的アプローチが記載されています。これらの方法は定性的または定量化細胞外膜の変化、核 DNA の選択的断片化、細胞内成分の構造またはその再分布の変化、細胞質 pH の低下によって引き起こされる現象。さらに、アポトーシスのマーカーとなる変化が存在しない、非定型のアポトーシスもあります。

明らかな理由により、ヒトの POAG における RGC のアポトーシスのメカニズムを in vivo で研究することは不可能です。 POAG の病因におけるアポトーシスの役割を研究する際の間接的な指標として、末梢血リンパ球のアポトーシスへの準備状態を特徴付ける末梢血リンパ球のアポトーシスマーカーが評価されました。アポトーシス細胞を判定するには、レーザースキャンとフローサイトメトリー、単一光子放出が使用されます。 CTスキャン、磁気 – 共鳴断層撮影法(MRI)、磁気共鳴分光法、陽電子放射断層撮影法。また、アポトーシス細胞死を同定するには、従来の固定および染色方法を使用した光学顕微鏡および蛍光顕微鏡、電子顕微鏡法、in situ でのオリゴヌクレオソーム DNA 分解の検出、プログラムされた細胞死に関与するマーカーまたは断片化された DNA などのタンパク質の免疫組織化学的検出、活性の測定などがあります。カスパーゼ。

標準的な方法で染色した標本でのアポトーシスの研究は、これらの方法が比較的簡単であるため、非常に広く使用されています。アポトーシス細胞を計数することによって得られた結果は、いわゆるアポトーシスインデックスの形で表されます。プログラムされた細胞死の基準には、クロマチンの辺縁化と濃縮、核の輪郭の変化、細胞の輪郭の変化と断片化、自由に横たわる核の出現が含まれる場合があります。

プログラムされた細胞死を特定するには主観的な方法蛍光顕微鏡法がよく使用されます。懸濁液中の生き生きと染色された細胞と固定標本の両方が研究されます。生細胞を扱う場合、アネキシン V 標識が広く使用されており、アネキシン V 標識により、アポトーシス中に原形質膜の外側に現れるホスファチジルセリンを検出できます。

蛍光顕微鏡下で細胞を分析する場合、次の特性が考慮されます: 核サイズ (縮小)、クロマチン分布の性質 (凝集塊への凝縮) 不規則な形状、圧縮）、クロマチン体（膜分離の保存）、DNA 発光の性質。アポトーシス DNA は凝縮して明るい黄緑色に見えます。生細胞では、アクリジンオレンジは拡散緑色蛍光を発します。

免疫組織化学的研究を使用して、アポトーシスにつながる生化学プロセスのカスケードを形成するタンパク質の存在が確認されます。このグループのメソッドには、多くの場合、TUNEL と ELISA が含まれます。

多くの研究者は、椎間板の構造変化においてアポトーシスが主要な役割を果たしていると考えています視神経(OND)、GCS の喪失によって引き起こされます。変性疾患の発症におけるアポトーシスの役割には疑いの余地がありません。 POAGにおけるGONの機構におけるアポトーシスプロセスの関与を示す説得力のある実験材料がある。しかし、一般に、さまざまな段階の緑内障患者におけるアポトーシス因子の臨床研究は非常に限られているため、GON の発症におけるアポトーシス因子の役割を研究することが困難です。

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CAD (カスパーゼ活性化 DNase) を 180 ～ 200 ヌクレオチドの倍数のサイズのフラグメントに分割します。アポトーシスの結果として、無傷の細胞小器官と核クロマチンの断片を含む膜小胞であるアポトーシス体が形成されます。これらの体は、食作用を通じて隣接する細胞またはマクロファージに飲み込まれます。細胞外マトリックスは細胞酵素の影響を受けないため、アポトーシス細胞が多数存在しても炎症は観察されません。

アポトーシスのプロセスは、体細胞数の生理学的調節、古い細胞の破壊、抗原（自己抗原）に反応しないリンパ球の形成、植物の葉の秋の落下、体の胎児発育に対するキラーTリンパ球の細胞傷害作用（鳥の胎児における指の間の皮膚膜の消失）など。

正常な細胞のアポトーシスが破壊されると、制御不能な細胞増殖が発生し、腫瘍が発生します。

1. アポトーシスの意味

アポトーシスは、ほとんどの多細胞生物の生命にとって不可欠な部分です。特に重要な役割開発プロセスで活躍します。たとえば、四足動物の四肢はスペード状の成長物として形成され、指の形成はそれらの間の細胞の死によって起こります。不要になった細胞もアポトーシスの対象となるため、オタマジャクシの尾は変態中に特に破壊されます。胚発生中の脊椎動物の神経組織では、ニューロンの半分以上が形成直後にアポトーシスによって死滅します。

アポトーシスは細胞の「品質」を制御するシステムの一部でもあり、誤って配置されている細胞、損傷を受けている細胞、機能していない細胞、または身体にとって危険な可能性のある細胞を破壊することができます。例としては B リンパ球が挙げられます。B リンパ球は、有用な抗原特異的受容体を持たない場合、または自己反応性がある場合に死滅します。感染中に活性化されたほとんどのリンパ球も、感染を克服した後にアポトーシスによって死滅します。

成体生物では、細胞増殖とアポトーシスを同時に制御することにより、個体全体とその個々の器官のサイズを維持することが可能になります。たとえば、肝細胞の増殖を刺激する薬剤フェノバルビタールを投与すると、ラットの肝臓が肥大します。しかし、この物質の作用が止まるとすぐに、過剰な細胞はすべてアポトーシスを起こし、肝臓は通常の大きさに戻ります。

アポトーシスは細胞が「感じる」ときにも発生しますたくさんの彼女が修復できない内部の損傷。たとえば、DNA 損傷が発生した場合、細胞はがん化する可能性がありますが、通常の状態ではそれを防ぐために「自殺」します。ウイルスに感染した多数の細胞もアポトーシスによって死滅します。

2. アポトーシス細胞のマーカー

アポトーシスマーカー

TUNEL 法を使用したアポトーシス細胞の DNA 断片化の検出。アポトーシス細胞の核は茶色です。光学顕微鏡で観察。

アガロースゲル電気泳動を使用したアポトーシス細胞における DNA 断片化の検出。左: アポトーシス細胞から単離された DNA - 「DNA のはしご」が見えます。中央: マーカー。ケース: 未処理細胞からのコントロール DNA サンプル。細胞株 H4IIE (ラット肝癌)、アポトーシス誘導剤 - パラコート、臭化エチジウムを使用した視覚化。

上: 蛍光色素 (Hoechst 34580) による染色によるクロマチンの凝縮と断片化の検出。中央: アネキシン V による染色による、原形質膜の外層へのホスファジジルセリンの転座の検出。下: アポトーシス細胞の明視野顕微鏡写真。細胞株 - Jurkat、アポトーシス誘導剤 - TRAIL、共焦点そして光学光学顕微鏡検査。

アポトーシスによって死滅する細胞は、多くの形態学的特徴によって認識できます。それらはより小さくなり、より高密度になり（濃縮症）、丸くなり、仮足を失い、それらの細胞骨格が破壊され、核膜が崩壊し、クロマチンが凝縮して断片化します。多数の小胞が細胞の表面に現れますが、細胞が十分に大きい場合、それらは膜に囲まれた断片、つまりアポトーシス体に崩壊します。

アポトーシス細胞では、形態学的変化に加えて、多数の生化学的変化も起こります。 DNA の一部は、ヌクレオソーム間のリンカー領域にある特殊なヌクレアーゼによって断片に切断されます。等しい長さ。したがって、電気泳動を使用してアポトーシス細胞からすべての DNA を分離すると、特徴的な「はしご」が観察されます。 DNA 断片化を検出するもう 1 つの方法は、TUNEL 法 ( Tターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ d U TP nいやー e nd 私アーベリング ) .

アポトーシス細胞の原形質膜も変化します。通常の状態では、負に帯電したリン脂質ホスファチジルセリンはその内層（サイトゾルに戻される）にのみ含まれていますが、アポトーシス時には外層に「ジャンプ」します。この分子は、近くの食細胞への「私を食べてください」信号として機能します。ホスファチジルセリンによるアポトーシス細胞の飲み込みは、他のタイプの食作用とは異なり、炎症性メディエーターの放出を引き起こしません。記載されている形質膜の変化は、アポトーシスによって死滅する細胞を同定する別の方法、つまりホスファチジルセリンに特異的に結合するアネキシン V による染色の基礎となっています。

3. カスパーゼ - アポトーシスのメディエーター

アポトーシスを媒介する細胞システムはすべての動物で類似しており、カスパーゼタンパク質のファミリーが中心的な位置を占めています。カスパーゼは、活性中心にシステイン残基を持ち、特定のアスパラギン酸残基で基質を切断するプロテアーゼです（そのため、次の名前が付けられています）。 cから システインそして アスプから アスパラギン酸）。カスパーゼは細胞内で不活性プロカスパーゼとして合成され、他のすでに活性化されたカスパーゼの基質となり、アスパラギン酸残基の 1 か所または 2 か所でプロカスパーゼを切断します。形成された 2 つのフラグメント (大きいフラグメントと小さいフラグメント) が互いに接続されて二量体を形成し、同じディマーと結合します。このようにして形成された四量体は活性プロテアーゼであり、基質タンパク質を切断することができます。メジャーサブユニットとマイナーサブユニットに対応する領域に加えて、プロカスパーゼには、切断後に分解される阻害性プロドメインも含まれる場合があります。

一部のカスパーゼが他のカスパーゼによって切断および活性化される結果、タンパク質分解カスケードが形成され、シグナルが大幅に強化され、ある時点からアポトーシスが不可逆的なプロセスになります。このカスケードを開始するプロカスパーゼはイニシエーターと呼ばれ、その基質はエフェクターと呼ばれます。エフェクターカスパーゼは、一度活性化されると、他のエフェクタープロカスパーゼや標的タンパク質を切断することができます。アポトーシス中に破壊されるエフェクターカスパーゼの標的には、特に核層タンパク質が含まれ、その破壊によりこの構造の崩壊が引き起こされます。このタンパク質はまた分解し、通常の条件下では CAD エンドヌクレアーゼを阻害し、結果として DNA 断片化を引き起こします。カスパーゼ、細胞骨格および細胞間接着タンパク質が切断されると、アポトーシス細胞が集まって隣接する細胞から剥がれ、食細胞の標的になりやすくなります。

アポトーシスを起こすのに必要なカスパーゼのセットは、組織の種類と細胞死が活性化される経路によって異なります。たとえば、マウスでは、エフェクターカスパーゼ 3 をコードする遺伝子が「オフ」になっている場合、アポトーシスは脳では発生しませんが、他の組織では通常どおり発生します。

プロカスパーゼ遺伝子は健康な細胞内では活性であるため、アポトーシスが起こるにはタンパク質が常に存在しており、細胞自殺を引き起こすにはその活性化のみが必要です。イニシエータープロカスパーゼには、CARD ( カスパーゼリクルートドメイン 、カスパーゼ採用ドメイン）。細胞がアポトーシスを刺激するシグナルを受け取ると、CARD によりイニシエータープロカスパーゼがアダプタータンパク質に結合して活性化複合体を形成できるようになります。活性化複合体では、いくつかのプロカスパーゼ分子が互いに近接していることがわかり、活性状態に入るには十分であり、その後互いに切断します。

哺乳動物細胞におけるカスパーゼカスケードの活性化について最もよく研究されている 2 つのシグナル伝達経路は、外因性および内因性 (ミトコンドリア) と呼ばれ、それぞれ独自のイニシエータープロカスパーゼを使用します。

4. アポトーシスを活性化する経路

4.1. 外部パス

細胞は、外部から、例えば細胞傷害性リンパ球から、アポトーシスを誘導するシグナルを受け取ることができます。この場合、いわゆる外部パスが有効になります ( 外部経路)、デスレセプターから始めます。デスレセプターは、TNF 受容体自体やデスレセプター Fas など、腫瘍壊死因子 (TNF) 受容体ファミリーに属する膜貫通タンパク質です。それらはホモ三量体を形成し、各単量体は細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質死ドメインを持ち、アダプタータンパク質を介してプロカスパーゼを引き付けて活性化します。

デスレセプターリガンドもホモ三量体です。それらは互いに関連しており、シグナル伝達分子の腫瘍壊死因子ファミリーに属しています。例えば、細胞傷害性リンパ球は、その表面にFasリガンドを有しており、これは標的細胞の形質膜上のFas死受容体に結合することができる。この場合、これらの受容体の細胞内ドメインはアダプタータンパク質（ FADD、Fas関連死ドメイン )、そしてこれらは、今度はイニシエータープロカスパーゼ 8 および/または 10 を引きつけます。この一連の出来事の結果として、死を誘導するシグナル伝達複合体が形成されます - DISC ( 死を誘導するシグナル伝達複合体 ）。この複合体内で活性化されると、イニシエーターカスパーゼはエフェクタープロカスパーゼを遮断し、アポトーシスカスケードを引き起こします。

多くの細胞は、外部アポトーシス経路の活性化から細胞をある程度保護する分子を合成します。そのような防御の例は、いわゆるデコイ受容体の発現です( おとり受容体）、細胞外リガンド結合ドメインは持っていますが、細胞質デスドメインは持たないため、アポトーシスを引き起こしたり、リガンドを求めて従来のデスレセプターと競合したりすることができません。細胞は、プロカスパーゼ 8 および 10 と構造が似ていますが、タンパク質分解活性を持たない FLIP など、外因性アポトーシス経路をブロックするタンパク質も生成します。これは、イニシエータープロカスパーゼの DISC 複合体への結合を阻害します。

4.2. 内側のパス

アポトソーム

アポトーシスは、たとえば損傷、DNA損傷、酸素欠乏などの場合に、細胞内から引き起こされることもあります。栄養素または細胞外生存シグナル。脊椎動物では、このシグナル伝達経路は内因性 ( 固有経路) またはミトコンドリア、主要なイベントこれには、ミトコンドリアの膜間腔からの特定の分子の放出が含まれます。このようなゾクレム分子の前にシトクロムcがあり、これはほとんどの場合ミトコンドリアの電子伝達ランシンに作用し、細胞質内のタンパク質には別の機能があります。アダプタータンパク質Apafに作用します( アポトーシスプロテアーゼ活性化因子-1 ）、オリゴマー化してアポトソームと呼ばれる車輪のような 7 員構造を形成します。アポトソームはイニシエータープロカスパーゼ 9 を動員して活性化し、イニシエータープロカスパーゼ 9 を活性化します。

一部の細胞では、細胞を効果的に殺すために、外因性アポトーシス経路が内因性アポトーシス経路を活性化する必要があります。内因性経路は、Bcl-2 ファミリータンパク質によって厳密に制御されています。

4.2.1. Bcl-2ファミリータンパク質による内因性経路の制御

Bcl-2 ファミリーには進化的に保存されたタンパク質が含まれており、その主な機能はミトコンドリアの膜間腔からのシトクロム c およびその他の分子の放出の制御です。それらの中には、さまざまな組み合わせで相互作用し、相互に抑制し、それらの活性間のバランスをとり、細胞の運命を決定するプロアポトーシス分子と抗アポトーシス分子があります。

このファミリーのタンパク質は現在約 20 種類知られており、そのすべてが BH1-4 ( bcl2 相同性）。 Bcl2 ファミリーの抗アポトーシスタンパク質には、Bcl-2 自体に加え、Bcl-X L、Bcl-w、Mcl-1、および A1 を含む 4 つのドメインすべてが含まれています。プロアポトーシスタンパク質は 2 つのグループに分けられ、最初のグループのメンバーには 3 つの BH ドメイン (BH1 ～ 3)、特に Bak、Bax、および Bok が含まれます (後者は生殖器官の組織でのみ発現します)。 Bcl-2 ファミリーの中で最も数が多いのは、BH3 ドメインのみ (BH3 のみ) を含むプロアポトーシスタンパク質の 2 番目のグループです。これには、Bim、Bid、Bad、Bik/Nbk、Bmf、Nix/BNIP3、Hrk、ノクサ、プーマ。

通常の条件下 (つまり、細胞がアポトーシスを起こしていないとき) では、Bcl-2 や Bcl-X L などの抗アポトーシスタンパク質は、プロアポトーシスタンパク質 BH123 (Bax および Bak) に結合し、それらがミトコンドリア外側で重合するのを防ぎます。細孔を形成する膜。特定のアポトーシス刺激の作用の結果として、BH3 ドメインのみを含むプロアポトーシスタンパク質が細胞内で活性化されるか、合成され始めます。次に、それらは抗アポトーシスタンパク質を阻害してBakおよびBaxに対する阻害効果を除去するか、後者と直接相互作用してそれらのオリゴマー化および細孔形成を促進します。浸透化により外膜シトクロム c は、AIF などのアポトーシスの他のメディエーターと同様にサイトゾルに入ります。 アポトーシス誘導因子 ).

たとえば、細胞内に生存シグナルが欠如している場合、MAP キナーゼ JNK の仲介を通じて BH3 タンパク質 Bim の発現が活性化され、内因性アポトーシス経路が引き起こされます。 DNA損傷の場合、腫瘍抑制因子p53が蓄積し、BH3タンパク質であるPumaおよびNoxaをコードする遺伝子の転写を刺激し、これらはアポトーシスも媒介します。別の BH3 タンパク質 - Bid は外部との接続を提供します。内部的な方法アポトーシス。デスレセプターとその結果としてカスパーゼ-8が活性化された後、後者はBidを切断して切断型tBid（切断型Bid）を形成し、これがミトコンドリアに移動してBcl-2を抑制します。

アポトーシスプログラム可能な遺伝子媒介型の細胞死であり、外部または内部シグナルが細胞に衝動を与え、酵素を形成または活性化し、細胞を自己破壊に導きます。形態学的には、アポトーシスは、細胞の収縮、核の凝縮と断片化、細胞骨格の破壊、および細胞膜の水疱状の突出によって特徴付けられます。アポトーシスの特徴は、瀕死の細胞がそのプロセスが完了するまでその膜の完全性を維持し、その後初めてその膜の破壊が近くの食細胞への信号となり、残りの断片を吸収して細胞分解のプロセスを完了させることです。即時食作用を受けないアポトーシス細胞は、「アポトーシス小体」と呼ばれる小さな膜結合断片になります。アポトーシスの重要な特徴は、炎症を起こさずに死にかけている細胞の除去が起こることです。

アポトーシスは、器官形成、胚発生、成体の組織における細胞集団の組成と数の制御などの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。いろいろな種類体内のホルモンの変化。アポトーシスの役割はさまざまな分野でも重要です病理学的プロセス。腫瘍増殖に関して最も詳しく研究されています。

アポトーシスのプロセスは 2 つの段階に分けられます。

· アポトーシスシグナルの形成と伝達 - 意思決定段階。

・解体細胞構造– エフェクターフェーズ。

アポトーシス機構の実現は、内因性細胞酵素であるシステインプロテアーゼ（カスパーゼ）の活性化に関連しています。カスパーゼは細胞内で不活性状態にあります（プロカスパーゼ）。活性化は、タンパク質分解による切断とそれに続く活性サブユニットの形成による二量体化によって起こります。カスパーゼの標的は、細胞のさまざまな重要な機能を担うタンパク質です。現在、14 種類のカスパーゼが記載されています。機能的な特徴 3 つのグループに分けることができます。

サイトカインの活性化因子（カスパーゼ 1、4、5、13）

カスパーゼ - エフェクターカスパーゼ (カスパーゼ 2、8、9、10) の活性化の誘導因子

· エフェクターカスパーゼ - アポトーシスの実行者 (3、6、7)

膜の1つ細胞受容体アポトーシスのメカニズムに関与するのは、Fas 受容体 (CD95/APO1) と呼ばれるタンパク質です。 Fas 受容体のリガンドはタンパク質 Fas リガンド (Fas-L) です。これは腫瘍壊死因子のファミリーに属し、膜タンパク質の形または可溶性の形で存在します。 Fas 受容体が Fas リガンドに結合すると、カスパーゼ誘導因子の活性化によりアポトーシス機構が活性化されます。続いてエフェクターカスパーゼが活性化すると、一連のタンパク質分解反応が始まります。その目的は、DNA 断片化、細胞構造タンパク質の直接切断、タンパク質合成の調節不全など、細胞のアポトーシスによる「解体」です。したがって、エフェクターカスパーゼがアポトーシスに関与すると、アポトーシス細胞と周囲の細胞の破壊、細胞骨格の再構成、DNA修復と複製の能力の低下、核膜の破裂とDNA破壊、細胞の生存を示すシグナルの放出が引き起こされます。アポトーシス、およびアポトーシス体への細胞の切断。エフェクターカスパーゼが「処刑カスパーゼ」と呼ばれているのは偶然ではありません。

アポトーシスを研究する方法は非常に多様です。当初、アポトーシスを判定する最も一般的な方法は、抽出された DNA 画分の電気泳動でした。これにより、低分子量 DNA の離散性をモル単位で識別することが可能になります。質量（ヌクレオソーム間 DNA 分解の結果として）。形態学的研究では、TUNEL 法を使用して DNA 切断を検出します。これは、DNA 切断部位における標識オリゴヌクレオチドの挿入物の形成に基づいており、その形成は TdT 酵素によって触媒されます。

現在、リンパ球のアポトーシスを記録するために、フローサイトメトリーに基づく方法がますます使用されています。このグループには、蛍光色素 - ヨウ化プロピジウムを使用して細胞 (低二倍体細胞) による DNA の一部の損失を検出することに基づく方法が含まれており、これについては後述します。フローサイトメトリーに基づく他の方法も、アポトーシスを測定するために使用されます。リンパ球のアポトーシスは早期に検出可能初期段階アポトーシスを起こしている細胞の膜上に現れるホスファチジルセリンに結合する、蛍光色素標識されたアネキシン V を介します。アポトーシスを発症するリンパ球の「傾向」のおおよその考え方は、リンパ球の表面およびプロトンコジーン bcl-2 のミトコンドリアにおける Fas 受容体 (CD95) の発現を測定することで得られます。

アポトーシスの障害は多くの疾患に関連しているため、患者の臨床検査および免疫学的検査中にアポトーシスを評価することの臨床的重要性は疑いの余地がありません。アポトーシスの弱体化は、自己免疫疾患の形成によるものです（リンパ球の自己特異的クローンを選別するプロセスの混乱による）。したがって、アポトーシスの弱化を記録することは、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患の発症メカニズムに関する情報源として役立ちます。関節リウマチ、および自己免疫性リンパ増殖症候群の基礎は、アポトーシスシグナルの受容体を決定する遺伝子の変異です。アポトーシス障害というのは、重要な仕組み悪性プロセスの発症。腫瘍細胞では、DNA の修復されていない切断の存在に関するシグナルを感知するタンパク質をコードする p53 遺伝子の変異が検出されることがよくあり、染色体変異、アポトーシスの発症につながります。その結果、遺伝的に欠陥のある細胞は廃棄されず、腫瘍形成の原因となります。

逆に、他の多くの病気ではアポトーシスの増加が観察されます。これは、感染過程（T 細胞の大規模なアポトーシスは微生物のスーパー抗原によって引き起こされることが多い）、敗血症、およびさまざまな過程で発生します。ウイルス性疾患、エイズを含む。アポトーシスは多くの血液疾患で亢進しており、原発性免疫不全症、その原因が細胞生存因子の生産不足である場合、その役割はサイトカインによって演じられます。それで、重度の症状の一つとして、複合免疫不全症 IL-7 遺伝子またはサイトカイン受容体の共通 γ 鎖の変異に関連する、IL-7 欠損によるリンパ前駆体の死です。

しかし、最も一般的に重要なのは、マイトジェンによって刺激されたときにリンパ球が経験する「活性化アポトーシス」の評価です。実際のところ、アポトーシスは増殖とともに、活性化刺激に対するリンパ球の反応の一形態であるということです。分化の初期段階では、アポトーシス反応が優勢であり、その結果、誘導抗原に対する耐性が形成されます。成熟リンパ球は主に増殖によって刺激に反応します（初期これは免疫応答の発生の前提条件です）が、活性化アポトーシスに入る一定の確率は残ります。アポトーシスは増殖に代わるプロセスとして機能するため、その比率は活性化シグナルに対する細胞応答の有効性の尺度として機能します。マイトジェンに対するリンパ球の反応に対するアポトーシスの寄与が大きいほど、抗原特異的効果は低くなります。免疫防御。したがって、マイトジェンによるリンパ球の活性化中のアポトーシスの決定は、同じ刺激に対する細胞の増殖応答の並行評価の対象となり、最も有益です。

アポトーシスの過程では、複雑な反応連鎖が分子レベルで細胞内で発生し、代謝プロセスや細胞の表現型特性の変化につながります。これらの変化は生化学的、顕微鏡的、またはサイトメトリーの方法で測定でき、アポトーシスのマーカーとして使用されます。

アポトーシスの初期マーカーの 1 つは、細胞の細胞膜上に現れることです。 アネキシン受容体。アポトーシス細胞では、リン脂質のホスファチルジセリン (PD) が再配向され、細胞膜の表面に局在します。膜表面上の PS の局在化は次から観察されます。
初期段階細胞が完全に分解されるまでのアポトーシス。組換え-
高い親和性を持つnyアネキシンVタンパク質（35～36 kDa）
Ca +2 イオン存在下での PS に対する耐性。表面のFSに接触
ty細胞、蛍光色素と結合したアネキシンVは、
アポトーシスのマーカー。アネキシン V は通常、以下と組み合わせて使用されます。
同時に認識できるヨウ化プロピジウム (PI)
無傷の細胞 (アネキシン V と PI の両方が陰性)、細胞
「初期」アポトーシスにある（アネキシン V 陽性、
PI 陰性）、後期アポトーシスの細胞、または
壊死（アネキシン V と PI の両方が陽性）。

CD95 Fas、または APO-1 は、腫瘍壊死因子 (TNF-α) 受容体ファミリーのメンバーである膜貫通糖タンパク質 (45 kDa) です。 CD95 抗原は、末梢血の胸腺細胞、CD4 + 、CD8 + リンパ球で大量に発現されますが、程度は低いですが B リンパ球および NK 細胞で発現されます。この抗原は顆粒球や単球にも発現しますが、血小板や赤血球には発現が見られません。 CD95 受容体は正常組織や腫瘍の細胞でも観察されます。 Fas リガンド (Fas-L、CD95L) による CD95 の結合は、それを発現する細胞のアポトーシスを誘導します。 CD95 に対するモノクローナル抗体により、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡を使用して、アポトーシスの準備ができている細胞集団を特定することが可能になります。

CD95L(ファス-L)– Fasリガンドと呼ばれる、膜タンパク質（40 kDa）です。可溶型の CD95L (sFas-L) もあり、これは (TNF-α) ファミリーの受容体に由来するタンパク質 (26 kDa) です。この抗原は細胞傷害性 E リンパ球および NK 細胞によって発現され、多くの腫瘍細胞でも検出されています。 Fas-L が CD95 受容体に結合すると、標的細胞のアポトーシスのプロセスが誘導されます。 CD95L に対するモノクローナル抗体により、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡を使用して、アポトーシスの準備ができている細胞集団を特定することが可能になります。

Bcl-2– 過剰発現するとアポトーシスをブロックするタンパク質 (26 kDa)。 Bcl-2 はミトコンドリアに局在する細胞内タンパク質であるため、モノクローナル抗体を使用して Bcl-2 を検出するには、細胞膜の予備透過処理を行う必要があります。

仕事の終わり -

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免疫状態を評価する方法 - 医学部、小児科学部、および医療予防学部の学生のための教科書

クルスク州医科大学連邦保健社会開発庁..臨床免疫学およびアレルギー科..

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免疫状態とその評価方法
免疫状態 (IS) は、免疫系の細胞の量的および機能的活性を特徴付ける一連の検査パラメータです。 IP インジケーターは高い

免疫学研究の目的と方法
研究の対象研究の方法表現型の特徴免疫担当細胞フローサイトフルオロメトリー Imm

リンパ球
免疫系の細胞の一部である真の免疫細胞はすべてリンパ球の変異体です。他の種類の白血球（好中球、好酸球、好塩基球、単球）、マクロファージ、血小板、マスト細胞

MFSセル
末梢血単球および組織マクロファージは、多能性幹細胞に由来します。単球は血流に入ると 2 ～ 3 日以内に組織に定着し、そこで組織に変わります。

抗菌性酸素依存システム
殺菌グルコース + NADP+ → ペントースリン酸 + NADPH の酸素依存メカニズムシトクロム b245 NADP + O2 ͛

メディエーター細胞
顆粒球は、血液中を循環し、単球マクロファージ細胞と同様に骨髄幹細胞から生じる多形核白血球です。骨髄。グラニューは3種類あります

リンパ球の免疫表現型検査法
リンパ球を研究する場合、末梢血中のリンパ球の数と機能活性が評価されます。細胞数の決定は、細胞上の分化抗原を考慮して行われます。

単核球画分の分離
単核球を分離する方法は、異なる血球の異なる浮力に基づいています。一定の密度の勾配を利用することで、単核球（リンパ球、単球、血球）を分離することができます。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリー法は、細胞の光学的特性の測定に基づいています。細胞は石英フローセル内の層流に単独で導入され、そこで集光された光を通過します。

間接免疫蛍光法
間接免疫蛍光法は、蛍光色素で標識されたモノクローナル抗体の使用に基づく方法であり、発光顕微鏡検査中の細胞の特異的な発光を考慮して結果を評価します。

免疫細胞化学的方法
免疫細胞化学的方法は、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素の使用に基づいています。現在、最も一般的に使用されている方法は、PA (ペルオキシダーゼ-アンチペルオキシダーゼ)、st.

リンパ球の機能活性を研究する方法
リンパ球の機能活性は、抗原を認識する能力、細胞の活性化、増殖および分化の作用によって評価されます。リンパ球認識能力

リンパ球芽球形質転換反応
リンパ球と外来抗原または非特異的マイトジェンとの接触には、活性化および芽球形質転換反応 (BTLR) が伴います。小型リンパ球から芽球への移行を伴う細胞増殖

リンパ球の混合培養
異なるハプロタイプの MHC-II 分子を有するリンパ球の共培養により、芽球の形質転換と増殖が引き起こされます。応答する細胞は T リンパ球に属し、外来物質によって刺激されます。

血漿タンパク質
ヒト血漿中には 200 を超えるタンパク質が存在し、そのほとんどが単離され、構造的および機能的に説明されています。血漿タンパク質は主に糖タンパク質に代表されます。エレクトロフォを使用

グロブリン
α1-アンチトリプシンは、血清抗プロテアーゼ活性の 80% 以上を占め、α-バンドの主成分である α1-グロブリンです。ホエーソーダで

グロブリン
ハプトグロビンの半減期は 2 ～ 4 日です。血清中のハプトグロビンの正常な含有量は 0.3 ～ 2.0 g/l です。その主な機能的価値- 血清中の遊離ヘモグロビンと結合する

タンパク質電気泳動法
電気泳動は、血清タンパク質の半定量測定やパラタンパク質の検出に広く使用されています。電気泳動は血漿ではなく血清を用いて行われるため、

免疫グロブリン
免疫グロブリン (Ig) は、外来抗原に対する反応の結果として免疫系によって生成され、血清やその他の体液に蓄積する特異的なタンパク質です。

ヒト免疫グロブリン
プロパティ IgM IgG IgA IgD IgE 分子形態 5 量体

免疫グロブリンの測定方法
血清およびその他の体液中のさまざまなクラスの Ig 含有量の定量測定用幅広い用途見つかったさまざまなオプションゲル中での沈殿反応のセットアップ

パラプロテイン
パラプロテインは、免疫グロブリンまたはそのフラグメントであり、形質細胞、B リンパ球の 1 つの特定の細胞株 (モノクローン) から形成されます。パラプロテインは失敗することが多い

クリオグロブリン
クリオグロブリンは病的な血漿タンパク質 (10 ～ 80 mg/ml) であり、37°C 以下の温度でゼリー状の状態に変化する特性があります。ほとんどのクリオグロブリンはポリクローナル複合体です

免疫複合体を決定する方法
Ig の抗原への結合は、身体から抗原を排除することを目的とした免疫複合体 (IC) の形成につながる生理学的プロセスです。ただし、ある条件下では

全身性膠原病の診断における自己抗体の測定
現代の概念によれば、自己免疫とは、自身の組織の正常な抗原に対して抗体または感作リンパ球が体内に現れる状態を指します。

自己免疫疾患の主な血清学的マーカー
抗原元の名前分子構造機能診断値

間接免疫蛍光反応における ANA の測定
典型的な検査では、患者の血清を抗原性基質（動物の肝臓または腎臓組織、Hep-2 細胞培養物）とインキュベートして、存在する物質を特異的に結合させます。

間接免疫蛍光法
発光の特徴抗原特異性臨床的意義末梢または周縁の dsDNA、l

固相ELISAによるANAとENAの測定
ELISA ANA 用テストシステム (UBI MAGIWELL) - 抗核抗体のスクリーニング分析用に半定量的測定を提供広い範囲ウェルに吸着された複合体に対する抗体

自己免疫疾患
病理の種類免疫学的研究の結果。抗体の種類とその頻度 (%)

サイトカインシステム
サイトカインは、免疫系の発達、機能、および他の身体系との相互作用に必要な、免疫系の可溶性ペプチドメディエーターの一種です。彼らは定義します

インターロイキン
IL-1 は、炎症反応、組織病変、感染症の際に放出される免疫調節メディエーター (炎症誘発性サイトカイン) です。 IL-1は増殖と分化を刺激します

インターフェロン
インターフェロン (IFN) は、抗ウイルス活性を持つタンパク質として発見されました。抗ウイルス効果 IFNは、ウイルスの細胞内複製を段階的に妨害する能力によるものです。

腫瘍壊死因子
腫瘍壊死因子 (TNF) は、グラム陰性菌に反応して体内で生成される主要なメディエーターです。グラム陰性菌の活性物質は、細胞系の構成要素である LPS です。

コロニー刺激因子
免疫応答の発生中に生成される多くのサイトカインは、骨髄前駆体の分化を刺激する効果があります。これらのサイトカインはコロニー刺激サイトカインと呼ばれます。

成長因子
トランスフォーミング成長因子 (TGFβ) は、成長と形態形成を制御する一般的なプロセスに複数の影響を与える関連ペプチドのファミリーです。 TGFβ - 主要なサイトカイン

サイトカインを測定する方法
さまざまな体液中のサイトカイン含有量の測定は、非常に重要免疫担当細胞の機能活性と免疫応答の制御を評価します。別の言葉で言うと

補体系
補体系は、自己組織化が可能であり、体液性免疫および食作用の反応を媒介できる血清タンパク質の複合体です。現在知られているのは、

補体活性を測定する方法
補体の総活性（力価）は、羊の赤血球を用いた溶血反応で測定されます。試験血清に含まれる補体は、感作された羊に溶血を引き起こす

50% HE での補体力価
溶血、% K 溶血、% K 溶血、% K 溶血、% K

補体成分の測定
補体成分を測定するには、ELISA および比濁法が使用されます。その実施方法は、診断検査システムに添付されている説明書に記載されています。で臨床実践の上

補体成分
補体成分臨床症状 C1欠乏症は通常、臨床的に重大な障害を引き起こすことはありません。

顆粒球の貪食活性を研究する方法
 最も重要な特徴顆粒球の機能は、その貪食活性を評価することです。その減少は、血清オプソニン化因子（抗体、補体）の欠乏の結果である可能性があります。

NSTテスト
ニトロブルーテトラゾリウムテスト (NBT テスト) は、いわゆる活性化された顆粒球と単球を識別するために使用されます。食細胞の活性化は酸化反応の急激な増加に基づいています

研究方法
必要な試薬および材料：KN 42 OPO 44 0、Na 42 OPO 44 0、NaCl、グルコース、ニトロブルーテトラゾリウム、ヘパリン、メチルアルコール、1% メチレングリーン水溶液（場合によっては）

ミエロペルオキシダーゼの測定
ミエロペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下で多くの基質 (ベンジジン、オルトフェニルジアミン) を酸化し、呈色反応を伴います。ミエロペルオキシダーゼはファージ顆粒に含まれる酵素です

化学発光
化学反応の際に、反応する物質のエネルギーによって起こる自発発光を化学発光（CL）といいます。それは、それらが含んでいる限り、生きている有機体のすべての組織と細胞に固有のものです。

IgE含有量の測定
ほとんどのアトピー性疾患における免疫状態の非特異的パラメーターを評価するための免疫学的方法の中で最高値総IgE量を決定します。ただし、同意します

好塩基球脱顆粒試験
アレルギー患者では、IgE のかなりの部分が Fc 受容体を介してさまざまな白血球に結合します。抗体を保有する細胞の存在は、対応するアレルゲンに対する細胞の感作を示します。 B

好塩基球細胞抗原刺激試験 - CAST
IgE介在性の場合アレルギー反応誘発メカニズムは、アレルゲンが好塩基球の表面上の特定の IgE 分子に結合することから始まります。肥満細胞。 E

白血球遊走阻害反応
この反応は、疑わしいアレルゲンに対して感作されているリンパ球を特定するために実行されます。感作されたリンパ球は、特定のアレルゲンと相互作用すると、メディエーター (FPML) を放出します。

タスクNo.1
23歳の患者は、顔と脚に限局した再発性のおできを訴えています。頻繁にメモする風邪（年に最大7〜8回）、唇のヘルペス性発疹。

問題その2
22 歳の患者 N は、慢性閉塞性気管支炎の悪化を伴うことが多い急性呼吸器ウイルス感染症の再発（最大年 7 回）を訴えて免疫学者に相談しました。導電性抗菌

タスクその3
患者 T さん（27 歳）は、再発する急性呼吸器ウイルス感染症、気管気管支炎、脱力感、倦怠感について繰り返し医師の診察を受けていました。既往歴から、その年に彼がARVIに6回、2回苦しんでいたことが判明した。

問題その4
患者Kさん、45歳。診断：全身性エリテマトーデス。免疫学的研究により、白血球 - 5.5 x 109/l リンパ球 -37%、絶対値が明らかになりました。 2.03×109

問題その5
5 歳の子供は、頻繁に長期にわたって病気になり、ARVI が月に 1 回再発し、集団感染する子供のグループに属しています。慢性感染症 (慢性副鼻腔炎、アデノイド炎）、頸部リンパ節の肥大

免疫検査中
第一レベルの検査総白血球数。白血球 T リンパ球 B リンパ球

一般的な血液分析
標準 SI 単位ヘモグロビン MF 130.0-160.0 120.0-140.0 g/l

免疫系細胞の主なCDマーカー
CD マーカー細胞集団細胞の % CD2 T 細胞および NK 細胞

小児のリンパ球部分集団
リンパ球 4～5日～3ヵ月 4～8ヵ月 1～2年 2～5年 5年以上すべて

成人の血清中の免疫グロブリンのレベル
IgM IgG IgA IgE 1.3 ～ 1.7 g/l 12 ～ 14 g/l 2.1 ～ 2.9 g/l

さまざまなグループのアレルゲンに対する特定の免疫グロブリンを特定するためのアレルギー MAST パネル (複数のアレルゲン吸着テスト)
食品 Ig E パネルロシア拡張 Ig E パネル食品 Ig G パネルロシア製ユニバーサル Ig E パネル

用語集
結合力は、抗原と抗体の結合の強さであり、抗体の親和性と価数によって決まります。凝集 - 凝集

略語と記号の一覧
AG – 抗原 AOK – 抗体形成細胞 APC – 抗原提示細胞 AT – 抗体 VLS – 遠心性リンパ管 ZVK – 感染したウイルス

3歳から15歳までの45人の子供が検査されました。研究の目的は、アポトーシスマーカー - CD95、CD95L、BSL2 を測定することにより、末梢血リンパ球と好中球のアポトーシスの準備ができているかどうかを判断することでした。免疫担当細胞のアポトーシスを評価すると、リンパ球のプログラム細胞死の準備状態の低下と好中球顆粒球の増加が見つかりました。最も顕著な変化は、3 年以上の疾患経験を持つ 7 ～ 15 歳の年齢層で記録されています。得られたデータは、免疫応答の延長に寄与する膵臓組織内の自己反応性リンパ球のプログラム死が抑制されていることを示している可能性があります。 CD95L を発現する白血球細胞の割合の増加は、免疫担当細胞が浸潤した膵島 β 細胞におけるプログラム細胞死プロセスの増加に寄与している可能性があります。

好中球のアポトーシス

リンパ球のアポトーシス

1型糖尿病

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導入

1 型糖尿病 (T1DM) は、膵臓 β 細胞に対する自己抗体および自己反応性 T リンパ球の形成に関連する多遺伝子性の多因子疾患です。

病因における主要な関連性自己免疫病変免疫調節異常とプログラム細胞死です。

制御されたアポトーシスは、今日、炎症部位の細胞の最適なバランスを維持し、活性化クローンの増殖を制限し、自己免疫反応の発症を防ぐための主要な機構であると考えられています。その実装に欠陥が発生すると、活性化された免疫細胞が蓄積し、自己免疫疾患の発生につながる可能性があります。

研究の目的：小児の1型糖尿病における末梢血リンパ球および好中球におけるアポトーシスの活性化マーカーCD95、CD95L、Bsl2の研究。

材料と研究方法

3～15歳の1型糖尿病の小児45人を対象に調査が行われた。グループ I には 3 ～ 6 歳の子供 (未就学児) 20 名、グループ II - 罹患期間が 3 年未満の 7 ～ 15 歳の子供 (学童) 12 名、グループ III - 7 ～ 15 歳の子供 (学童) 13 名が含まれていました。 3年以上の病気経験のある方。対照群は、3 ～ 6 歳 (15 歳) および 7 ～ 15 歳 (15 歳) の健康な子供 30 人で構成されました。この研究は、その名にちなんで名付けられた市立小児臨床病院の内分泌科に基づいて実施されました。 G.K.フィリプスキー、スタヴロポリ

プログラムされた細胞死を評価するために、アポトーシスのマーカーを発現するリンパ球および好中球顆粒球の数が検出されました。リンパ球はFicoll-Paque密度勾配で単離し、好中球は二重密度勾配Ficoll-PaqueおよびFicoll-urografin（GE Healthcare、スウェーデン）で単離した。細胞懸濁液をRPMI-1640培地(Vector-Best、ロシア)で3回洗浄した。リンパ球および好中球の培養物において、CD95、CD95L、Bsl2を発現する細胞の数を、モノクローナル抗体(Invitrogen、米国)を使用するフローサイトメトリーによって評価した。

データの統計分析には、ソフトウェアパッケージ「Primer of Biostat 4.0」、Attestat 10.5.1 を使用しました。グループ間の差異を評価するために、繰り返し測定の分散分析を Newman-Keuls および Dunn 基準の計算とともに使用しました。

定量値は非正規分布し、中央値および分位間（25 パーセンタイルおよび 75 パーセンタイル）の範囲 (Me (Q1-Q)) として表示されました。 pの違い<0,05.

結果とその考察

この研究により、健康な小児と比較して、すべてのグループの患者においてFas受容体（CD95）を発現するリンパ球の数が減少していることが明らかになりました（表1）。最小の指標は、3 年以上の疾患経験を持つ 7 ～ 15 歳の小児で観察されました (表 1)。

表1

1 型糖尿病の小児におけるリンパ球アポトーシスの指標

	臨床グループ
3～6年	T1DM (I) (n=20)	17,7(15,9-19,43) * **	7,4(5,81- 8,94) * **	70,2(68,56-71,76) * **
3～6年	対照群	28,0(26,08-30,0)	9,2(8,04- 10,25)	65,9(62,82-69,05)
7～15歳		20,5(17,94-23,02) * **	11,6(10,12-13,14) * **	70,3(65,72-74,9) * **
		13,9(10,04-17,73) * **	15,6(14,26-16,87) * **	79,5(75,47-83,59) * **
	対照群	26,5 (24,20-28,84)	8,14 (6,49-9,78)	60,3(56,97-63,66)

*- p<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- p<0,05 - по сравнению с группой

抗アポトーシスマーカー (Bsl2) の発現レベルを評価すると、その増加がすべてのグループの子供のリンパ球で明らかになり、罹患期間が 3 年を超える学童でより顕著であり、これは Fas-2 の違反も示しています。 1 型糖尿病の小児における依存性アポトーシスは、自己反応性リンパ球の細胞死のプロセスの遅延につながります。

我々の結果は、免疫応答の延長に寄与する膵臓組織内の活性化リンパ球のプログラム死の抑制の間接的な兆候である可能性があります。

リンパ系細胞のアポトーシスの準備状態のレベルは疾患の期間に依存し、3 年を超える T1DM の小児では低下します。

糖尿病ではアポトーシスに対するリンパ球の抵抗性があることが以前に示されており、これが自己免疫応答の性質と持続期間を説明している可能性があります。

糖尿病の小児のリンパ球培養では、健康な小児のグループと比較して、CD95L を発現するリンパ球の割合の増加が見られました (表 1)。罹患率が最も高かったのは、3年以上の疾患経験を持つ7～15歳の小児でした（表1）。

T1DMでは、膵島に広範囲のサイトカインを産生する免疫細胞が浸潤し、膜受容体の異常発現を伴うことが知られています。グルコースおよびサイトカインの濃度上昇の影響下で、β細胞はその表面にCD95を発現し始めますが、これは通常では実質的に存在しません。

リンパ系細胞上の CD95L 発現の増加は、膵臓 β 細胞におけるより顕著なアポトーシスプロセスとその後のそれらの除去に寄与する可能性があります。

近年、好中球顆粒球が自己免疫炎症の形成に積極的に関与していることが示されています。自己抗原の局在化と排除を目的とした好中球の反応は、免疫系に対する抗原効果の強さと持続時間、および細胞の機能活性の初期レベルに大きく依存します。

小児糖尿病の経過には、アポトーシスマーカー（CD95）を発現する好中球の割合の増加と、表面に抗アポトーシスタンパク質Bsl2を持つ細胞の割合の減少が伴うことを我々は発見しました（表2）。

表2

1 型糖尿病の小児における好中球アポトーシスの指標

	臨床グループ
3～6年	T1DM (I) (n=20)	75,1(71,49-78,72) * **	9,5 (8,63- 10,32) * **	3,68 (3,46-3,90 * **
3～6年	対照群	59,2 (56,31- 62,01)	7,35 (6,58- 8,12)
7～15歳	T1DM、疾患経験が3年未満（II）（n=12）	77,6(71,15-83,99) * **	9,5(8,14-10,92) * **	3,99(2,9- 5,08) * **
	T1DM、3年以上の疾患経験（III）（n=13）	87,9(84,24-91,63) * **	12,1(10,22-13,96) * **	2,78(2,36-3,19) * **
	対照群	58,43(54,95- 1,90)

*- p<0,05 - по сравнению с контрольной группой, **- p<0,05 - по сравнению с группой III (Newman-Keuls テスト、ダンテスト)。

グループ間特性の比較により、最大 CD95 値 (p<0,05) и минимальные Bsl2 (p<0,05) отмечены у детей 7-15 лет с длительностью заболевания более 3-х лет.

表面に CD95L を持つ多形核白血球の割合の増加が検出されました。最も高い罹患率は、3年以上の病気歴のある学童で観察されました。

文献に示されている糖尿病における PMN アポトーシスの研究結果は矛盾しています。 T1DM および T2DM では末梢血好中球のアポトーシス率が増加するという証拠があります。

しかし、多くの研究では、1型糖尿病患者において、特に高血糖状態では好中球顆粒球のアポトーシスが減少することが判明しており、これによりおそらく組織損傷を伴う慢性炎症プロセスが開始され、また、1型糖尿病患者では長期にわたる細菌感染症が起こりやすくなります。 1 糖尿病。

我々の結果は、T1DM患者はアポトーシスに対するPMNの素因が増加していることを示唆しており、これは活性好中球の「過剰」を排除することを目的とした防御反応の現れであり、その形成により組織損傷が増大する可能性がある。

好中球顆粒球のアポトーシス能の増加は、疾患の免疫病因への PMN の積極的な関与を反映しています。

糖尿病患者における好中球顆粒球上の CD95L 発現の増加は、膵臓細胞だけでなく患者自身の白血球細胞の除去にも寄与する可能性があります。

したがって、1型糖尿病の小児における免疫担当細胞のアポトーシスを評価すると、リンパ球のプログラム細胞死に対する準備状態の低下と多形核白血球の増加が確認されました。

最も顕著な変化は、3年以上の疾患経験を持つ7～15歳の年齢層で記録されています。すべてのグループの小児において、表面に CD95L を発現する白血球細胞の割合の増加が検出されました。

PMN は自然免疫と適応免疫の間のつながりであり、抗菌防御において主導的な役割を果たすことが知られています。

アポトーシス活性の増加により、子供の年齢に伴う抵抗力が低下し、感染症にかかりやすくなる可能性があります。

アポトーシスの誘導に敏感なリンパ球数の減少は、プログラムされた細胞死の抑制と活性化型リンパ球の除去障害の間接的な兆候です。

結論

1. 1 型糖尿病に苦しむ小児では、末梢血リンパ球のアポトーシスの準備が低下し、好中球顆粒球が増加します。これは、CD95 および Bsl2 の発現の変化を伴い、糖尿病の期間に依存します。病気。

2. T1DM におけるリンパ球および好中球顆粒球上の CD95L 発現の増加は、免疫担当細胞が浸潤した膵島 β 細胞におけるプログラム細胞死のプロセスの増加に寄与する可能性があります。

査読者:

Shchetinin E.V.、医学博士、聖州立医科大学教授、科学・イノベーション担当副学長、ロシア連邦保健省高等専門教育「スタヴロポリ国立医科大学」HBO部門長、スタヴロポリ。

ゴルベバ M.V. 医学博士、ロシア連邦スタヴロポリ保健省の HBO 高等専門教育機関「スタヴロポリ国立医科大学」小児感染症科長。

書誌リンク

Barycheva L.Yu.、Erdni-Goryaeva N.E. 小児の 1 型糖尿病における免疫担当細胞のアポトーシスのマーカー // 科学と教育の現代の問題。 – 2013. – 第 4 号。
URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=9953 (アクセス日: 07/18/2019)。出版社「自然科学アカデミー」が発行する雑誌をご紹介します。

アポトーシスと細胞増殖のマーカー。 科学と教育の現代の問題 アポトーシスのマーカー